實驗五雞蛋清中卵類粘蛋白分離純化及活性測定

1、實驗五 雞蛋清中卵類粘蛋白分離純化及活性測定、實驗?zāi)康暮鸵?)設(shè)計從雞蛋清中分離純化卵類粘蛋白的試驗方案。2)設(shè)計從雞蛋清中分離純化卵類粘蛋白的試驗操作條件。3)了解離子交換層析系統(tǒng)中四大組成部分和實驗主要影響因素。4)掌握熟離子交換層析層析儀的使用方法和注意事項。5)學(xué)會凝膠預(yù)處理和裝柱、平衡、洗脫的方法。二、器材和試劑1實驗器材：層析系統(tǒng) LH-2 ，(包括自動部分收集器，紫外檢測儀，記錄儀，蠕動泵，梯度混合器)6套；高速離心機(jī)；布氏漏斗；燒杯500ml,100ml ，各 16個；移液管 1、 2、5ml, 各 16 個；量筒50ml,100ml，各16個；真空干燥器4個；滴管，16個；

2、濾紙$ 120,1 盒；2實驗試劑：(1) 丙酮； (2)1 ， pHl.15 的三氯乙酸：將稱取的三氯乙酸置燒杯內(nèi)，加入2 3 總體積的蒸餾水溶解，用6mol/L氯氧化鈉調(diào)至約 PHI.15，靜置約1h,然后在pH 計上校正至pH 1.15 ，最后補(bǔ)充水到所配體積； (3)0.02 mol /L,pH6.5 ，磷酸鹽緩沖液；(4)0.5mol /L氯化鈉一0.5mol / L氫氧化鈉溶液；(5)0 . 5mol/L鹽酸溶液；(6)0.3mol/L氯化鈉一0.02mol/L磷酸鹽緩沖液，PH6.5 ; (7)底物緩沖液：0.05mol / L, Tris-HCl緩沖液，pH8.0，內(nèi)含2.22

3、mol /L的氯化鈣；(8)2mmol / 1,BAEE底物：用底物緩沖液配制；(9)lmg / mL胰蛋白酶溶液：用 0.001 mol / L 鹽酸配制；(10)DEAE-纖維素粉(DE-32) ; (11)SphadexG-25 ; (12)雞蛋 30 個；( 13)1 硝酸銀三、實驗原理1 蛋清中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成為：卵清蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵類粘蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶、G、G3球蛋白、卵抑制素、卵糖蛋白、黃素蛋白、卵巨球蛋白、蛋白抑制劑、抗生物素蛋白。2.雞卵類粘蛋白(chickenovomucoid , CHOM的性質(zhì)：雞卵類黏蛋白(chickenovomucoid , CHOM是由雞卵

4、清中制得的一種糖蛋白,可強(qiáng)烈地抑制胰蛋白酶， 對枯草芽孢桿菌蛋白酶也有一定程度的抑制作用，但對胰凝乳蛋白酶無抑制作用，對人的胰蛋白酶也無明顯的抑制作用。 常用于胰蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的研究。 也可將其制成親和吸附劑，通過親和層析技術(shù)有效地分離與純化胰蛋白酶。雞卵類黏蛋白至今還未能獲得單一組分的制品， 目前至少已獲得 4 種不同組分， 它們在抑制胰蛋白酶的性能上和氨基酸組成上差別不大，但是在糖基部分（主要為D-甘露糖、D-半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸 ）的含量有差別。由于 Ovomucoid 所帶的糖基不同，電泳行為呈現(xiàn)出不均一性，其 pI 大致在 3.9-4.5 ，相對分子質(zhì)量 28 000 ，卵類黏蛋

5、白抑制胰蛋白酶的摩爾比為 1： 1。卵類黏蛋白在中性或酸性溶液中對熱和高濃度的脲都相當(dāng)穩(wěn)定，而在堿性溶液中不穩(wěn)定,尤其是當(dāng)溫度較高時會迅速失活。 Ovomucoid 帶有四種糖基,因此有較強(qiáng)的吸水性。在50%丙酮或 5%三氯乙酸鹽的水溶液中，仍有較好的溶解度。所以，選擇合適的pH,丙酮濃度和三氯乙酸鹽的濃度，可以從蛋清中除去大量的非卵粘蛋白。Ovomucoid在280nm處的百分消光系數(shù) A1%1cm. 280 = 4.13 ,即蛋白酶濃度為 1mg/ml 時,溶液的吸光度 A280 = 0.413,據(jù)此可以測定其溶液中蛋白質(zhì)的含量。本實驗主要參照 Kassell 的方法,雞蛋清經(jīng)三氯乙酸 （

6、TCA） 丙酮溶液處理,除去沉淀物，然后經(jīng)丙酮分級沉淀獲得粗晶，再用DEAE纖維素柱層析純化而得合格產(chǎn)品。四、實驗步驟1雞卵類黏蛋的提取取50mL雞卵清，加入等體積的 10%, PH1.15三氯乙酸溶液（緩緩加入以防局部過酸出現(xiàn)塊狀物），形成類似于酸奶狀的白色沉淀，輕輕地攪拌均勻。在酸度計上檢查最終 pH值應(yīng)為大約3.5，若pH值偏離3.5 0. 2則要用5mol/L氫氫化鈉或5mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值,由于提取液非常稠，在調(diào)節(jié) pH值時防止局部過酸或過堿。pH值調(diào)好穩(wěn)定后，在室溫下靜置4h以上。待卵清清蛋白完全沉淀后，以3000r / min離心10min。棄去沉淀物，上清液用濾紙過濾，以除

7、去上清液中脂類物質(zhì)及其他不溶物。收集濾液轉(zhuǎn)入500mL的燒杯內(nèi)。檢查濾液的pH值是否為3.5，否則要調(diào)回到pH3.5。置冰浴或冰箱內(nèi)冷卻片刻，緩慢加入3倍體積預(yù)冷的丙酮,用玻璃棒輕輕攪勻,用塑料薄膜蓋好封嚴(yán),在冰浴里放置24h,待雞卵類黏蛋白完全沉淀后,小心虹吸出一部分上清液,剩余的部分全部轉(zhuǎn)移到50mL帶蓋的離心杯里,加蓋經(jīng)平衡后以3000r /min離心15min,除去上清，沉淀物放在真空干燥器內(nèi)，抽氣除去殘留丙酮。使沉淀物由白轉(zhuǎn)變?yōu)橥该黟こ砦锖笸Ｖ钩闅狻＜尤?0mL蒸餾水溶解，若溶解液混濁則用濾紙濾去不溶物。濾液經(jīng) SephadexG-25 柱層析法脫鹽或者經(jīng)透析除鹽。2雞卵類黏蛋的脫鹽

8、用 SephadexG-25 柱層析法脫鹽的操作如下：稱取30gSephadexG-25，用500mL0.02mol/ L, pH6.5的磷酸鹽緩沖液在100 C熱溶脹2h或者室溫下溶脹 24h。脫氣后裝柱（35mmx300mm,柱床體積約 150mb用約2倍體積的 0.02mol / L, PH6.5磷酸鹽緩沖液平衡。流出液在核酸蛋白質(zhì)檢測儀上繪出穩(wěn)定的基線或經(jīng)紫外分光光度計測定光吸收，其A80小于0.02即可上樣。280nm無明顯光吸收，若繪取20mL雞卵類黏蛋白提取液上柱（上樣量不超過柱床體積的1/6）。用同樣的緩沖液洗脫，收集第一峰，在蛋白峰完全流出后鹽才開始流出，鹽通常在出第二峰則是

9、殘留丙酮峰。丙酮和鹽同時流出。洗脫曲線見下圖。圖1 旖聊類彊白的Sephadex C-25柱毘析船鹽稅脫曲it梳曲ft： 0.02 ml/L.沖液圖2篦卵類黏蛋白在DEAE軒維柱上的 枕脫曲線平0,02 mol/L,確ffitb沖韁港;0,3I/L Nia-0,02 tnd/L, pHS.5沖液通過上述方法獲得的雞卵類黏蛋白仍含有少量的卵清清蛋白。由于二者的等電點(diǎn)不同, 采用DEAE纖維素離子交換層析可以將二者分開。稱取10g DEAE-纖維素粉（DE-32），用150mL 0.5 mol / L氫氧化鈉-0.5mol/L 氯化鈉溶 液浸泡20min。用布氏漏斗（內(nèi)墊為200目尼龍網(wǎng)）抽濾。用

10、蒸餾水洗至 pH8. 0左右，抽干。然后移至500mL的燒杯內(nèi)，用150mL0.5mol /L鹽酸溶液浸泡20min，再轉(zhuǎn)移到布氏漏斗內(nèi),抽濾，用蒸餾水洗至PH6.0左右，最后轉(zhuǎn)移到燒杯內(nèi)，用150mL0.2mol/L, pH6.5磷酸鹽緩沖液浸泡約15min，經(jīng)真空干燥器脫氣后裝柱。取一支層析柱（35mmx200mn裝入約1/4體積的0.02mol / L, pH6.5磷酸鹽緩沖液，將處理過的DEAE纖維素裝入柱內(nèi)。以同一緩沖液平衡，流出液在核酸蛋白質(zhì)檢測儀上繪出穩(wěn)定的基線或經(jīng)紫外分光光度計測定光吸收，待A80值小于0.02即可加樣。將經(jīng)SephadexG-25脫鹽后的雞卵類黏蛋白溶液上柱吸

11、附。以0.02mol / L, , pH6. 5的磷酸鹽緩沖液平衡，基線穩(wěn)定后，改用 0.3mol /L 氯化鈉 0.2mol /L， pH6.5 的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集第二洗脫峰。柱層析圖譜見上圖。在雞卵類黏蛋白液中所含的雞卵清清蛋白，在洗脫時可能出現(xiàn)一個小峰或不明顯的峰形。 在這種情況下可根據(jù)峰形大小，測定活性來確定雞卵類黏蛋白洗脫峰的位置。4. 雞卵類黏蛋白純品的制備經(jīng)DEAE纖維素離子交換柱層析制得的雞卵類黏蛋白溶液裝入透析袋內(nèi),用蒸餾水進(jìn)行透析，間隔一段時間更換一次蒸餾水，直至經(jīng)1硝酸銀檢查無氯離子為止。將透析過的雞卵類黏蛋白溶液轉(zhuǎn)移到燒杯內(nèi)，小心地用1mol /L鹽酸調(diào)節(jié)至pH4

12、.0，取出lmL ,稀釋510 倍測定雞卵類黏蛋白的含量及活性。然后加入 3 倍體積的預(yù)冷丙酮，用塑料薄膜封嚴(yán)燒杯口，在冰浴里靜置 4h 左右。待雞卵類黏蛋白完全析出后，傾去上清，沉淀轉(zhuǎn)移到一個帶蓋的50mL離心杯內(nèi)，于3000r / min離心15min，棄上清，沉淀物放人真空干燥器內(nèi)干燥,即可得到透明膠狀物 - 雞卵類黏蛋白 （約 200300mg）。5 雞卵類黏蛋白的含量測定配成一定濃度的雞卵類黏蛋白溶液，測定A80。雞卵類黏蛋白的消光系數(shù)是:A1%1cm=4.13 。雞卵類黏蛋白（mg/mL）=（A28oX稀釋倍數(shù)）/0.4136. 雞卵類黏蛋白的活性測定 （ 選做）雞卵類黏蛋白的活性

13、可以用抑制胰蛋白酶的活力單位表示。即：抑制 1 個胰蛋白酶活力單位（BAEE單位）所需卵類黏蛋白量定為抑制劑的1個活力單位。取 2 個石英比色池 （帶蓋，光程為 l cm） ，一個加入 o.o5mol /L， pH8o Tris-HCl緩沖液和2. Omol/L, BAEE底物溶液各1.5mL混勻，在波長253nm處調(diào)整儀器零點(diǎn)。另一個比色池內(nèi)加0.05mol / L, pH8.0 , Tris-HCI緩沖液1.5mL, 10卩L胰蛋白酶液（約10卩g胰蛋白酶），10卩L雞卵類黏蛋白（約5-10卩g雞卵類黏蛋白）輕輕搖勻，在室溫下（最好是在25 C恒溫箱內(nèi) ） 放置 2min如蛋白酶與雞卵類黏

14、蛋白充分結(jié)合。然后加入2mol/L BAEE底物溶液1. 5mL,立即混勻并記時。于波長 253mn處測定其光吸收遞增值 A253/ min。每隔30 s讀數(shù)一次，使 A253/min值控制在0.05左右為宜，否則要根據(jù)隔/ min的大小適當(dāng)減少或增加雞卵類黏蛋白的量。以反應(yīng)時間t為橫坐標(biāo)，A253為縱坐標(biāo)作圖，取直線部分的任一時間間隔與相應(yīng)的光吸收變化值為 A253/min用A表示。與此同時，以同樣的方法（不加雞卵類黏蛋白：測胰蛋白雞卵類黏蛋白的抑制活性及抑制比活性的計算公式如下： 雞卵類黏蛋白的抑制活性單位 (BAEE)=(Al -A2)/0.001雞卵類黏蛋白抑制比活單位(BAEE單位/mg胰蛋白酶)=(AI-A2) X 1000/( AI-A2 )/1 X0.001式中A I：胰蛋白酶 A253/ min ; A2：加入抑制劑后胰蛋白酶