小顆粒脂肪移植堿性成纖維細(xì)胞生長因子及緩釋劑濃度的正交篩選

1、    小顆粒脂肪移植堿性成纖維細(xì)胞生長因子 及緩釋劑濃度的正交篩選        【摘要】目的解決游離脂肪移植吸收問題。方法根據(jù)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的生物學(xué)特性，以纖維蛋白作為緩釋劑，參與小顆粒狀脂肪移植。并采用正交法設(shè)計(jì)，觀察bFGF及緩釋劑濃度與效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果術(shù)后3個(gè)月，移植物重量變化在差位級為98%，好位級為225%。后者基本與動物體重同步增長。脂肪生存及增殖與bFGF緩釋劑濃度關(guān)系密切。在0.2g移植脂肪中加入bFGF1 000U、2 000

2、U或4000U，以4000U效果最佳。緩釋劑濃度1 000mg/L，2 000mg/L，或3 000mg/L，以1 000mg/L為佳。組織學(xué)觀察各移植物均有被膜、纖維間隔。脂肪組織結(jié)構(gòu)良好，細(xì)胞成熟。結(jié)論bFGF在以纖維蛋白為緩釋劑條件下，對移植脂肪具有良好的促增殖作用。其效應(yīng)具有濃度依賴關(guān)系。【關(guān)鍵詞】脂肪移植堿性成纖維細(xì)胞生長因子游離脂肪移植在百余年應(yīng)用歷史中一直受過度吸收的困擾。80年代以來，小顆粒脂肪移植雖給脂肪移植帶來新的希望，但吸收問題依然存在1。1992年我們開始應(yīng)用bFGF于脂肪移植。其早期血管形成效應(yīng)已得到證實(shí)2。我們初步報(bào)道bFGF參與下移植脂肪的生存、增殖作用。1材料與

3、方法1.1纖維蛋白原提取。人血漿以12.5%NaSO4沉淀纖維蛋白原，溶解，上葡聚糖柱層析后收集，電泳定性，透析，真空干燥后備用。1.2bFGF(珠海東大生物公司提供)與白蛋白結(jié)合。4萬個(gè)單位加入1mg/ml人白蛋白0.2ml，真空干燥備用。1.3動物處理及結(jié)果觀察。SD大鼠9只，體重190240g。雄性。3%戊巴比妥鈉(0.1ml/100g)腹腔麻醉。取腹股溝區(qū)脂肪0.2g，剪成20小塊，使用1ml注射器接16號針頭能順利通過。雙側(cè)下頜角下方各做一5mm切口，分離咬肌與皮膚(此區(qū)域無皮下脂肪)。雙側(cè)各植入0.2g脂肪。植入前按正交設(shè)計(jì)加入不同濃度bFGF10l，纖維蛋白原10l(表1)，并以

4、100g/ml凝血酶10l促凝。植入后，傷口縫一針。動物術(shù)后3個(gè)月處死。沿被膜取出移植物稱重。標(biāo)本用10%福爾馬林固定。緩慢脫水、制片、HE染色觀察組織變化。2結(jié)果取材可見移植組織與深面咬肌、淺面皮下均有明顯界限，被膜表面肉眼見血管豐富、組織豐滿(1，2)。組織重量變化及動物體重變化見表1。正交表計(jì)算結(jié)果見表2。 表1bFGF、纖維蛋白原濃度及動物、移植物重量Tab 1 Weight of graft,concentration of bFGF and fibrinogen in each animalbFGF纖維蛋白原動物體重移植體重量(g)序號(1000U/10l)(1000mg%)(g)

5、(術(shù)后3個(gè)月)左右左右術(shù)前術(shù)后3個(gè)月左右142332004600.3630.163221332004350.2570.175314322404550.1980.360442222204500.3050.235521222304700.2980.249614212104300.3090.371742111904200.5320.506821112404400.2740.218914132304300.2050.402組織學(xué)結(jié)果所有標(biāo)本均存在被膜、纖維間隔。脂肪組織結(jié)構(gòu)完好；細(xì)胞分化成熟(3，4)。某些區(qū)域有灶性或散在淋巴細(xì)胞浸潤。其中纖維蛋白濃度較高的移植物其纖維被膜及間隔較厚；低濃度者較菲薄。

6、低濃度bFGF參與的移植物標(biāo)本存在個(gè)別小壞死灶并為囊樣脂池。3 討論脂肪移植作為顏面部軟組織凹陷的皮下充填物應(yīng)是理想材料。過度吸收是脂肪移植的難題。雖然近年來廣泛采用的小顆粒脂肪移植已 表2正交試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算Tab 2 The result from data of experiment by othogonal design位級bFGF(1000U/10l)纖維蛋白原(1000mg%)143222311各位級組織左右左右組織重量總和重量和(g)(g)左右(位級1)1.2001.1330.8180.760(位級2)0.8290.9080.9120.8482.7412.703(位級3)0.7120

7、.6621.0111.095極差、中最大最小0.4880.4710.194較傳統(tǒng)的整塊脂肪移植吸收有所減少。術(shù)后12周前顆粒移植為原重量27.1%，塊狀移植為17.3%。24周后兩者均進(jìn)一步吸收3。本實(shí)驗(yàn)最佳級別移植組織重量變化為223%；動物體重變化為215%，幾乎與動物體重同步增生。差級別組織重量變化為98.25%，顯示bFGF促進(jìn)移植物生存和增長的巨大作用。bFGF的促血管生成作用，在早期提供移植物以充分血供。從而保證移植物的生存條件。細(xì)胞培養(yǎng)顯示bFGF對血管內(nèi)皮細(xì)胞有明顯的促分裂和增殖作用4。Kouri等在皮瓣移植中觀察到bFGF促進(jìn)皮瓣與受植床血管接通再生5。筆者1994年報(bào)道小顆

8、粒脂肪移植中，bFGF誘導(dǎo)血管早期形成作用。術(shù)后5，7，10天，經(jīng)灌墨計(jì)數(shù)，移植物血管均顯著高于對照側(cè)2。單純血管生成提供移植物充分營養(yǎng)，似乎不足以獲得令移植物伴隨動物體重增長而增長的結(jié)果。bFGF對脂肪細(xì)胞及脂肪前體影響的研究目前甚少，然而，bFGF作為一組多功能生長因子，對中胚葉，外胚葉細(xì)胞也都具有促進(jìn)分化、分裂、增殖功能，正受廣泛關(guān)注。成肌細(xì)胞經(jīng)過bFGF培養(yǎng)2天，注入活體，28天后檢測到-單乳糖量酶陽性纖維化較對照側(cè)高4倍6?？梢奲FGF對促進(jìn)間葉源細(xì)胞的分化成熟有明顯效應(yīng)。而bFGF是否能促進(jìn)脂肪細(xì)胞前體分化成熟有待證實(shí)。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，似乎有些可能性。對于成熟細(xì)胞軟骨細(xì)胞有刺激增

9、殖作用7。脂肪細(xì)胞雖屬終末細(xì)胞，在bFGF等成份作為促脂肪細(xì)胞生長因子參與的細(xì)胞培養(yǎng)中，可見增殖8。正交法是一種高效的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)9只動物18側(cè)移植，二因素三水平各可獲得6次參與。雙側(cè)交叉重復(fù)。術(shù)后3個(gè)月，移植物總重量基本一致，各級別順序不變。重復(fù)性好，可排除系統(tǒng)誤差。從正交法計(jì)算結(jié)果可見bFGF對移植脂肪的增殖具有劑量依賴性。0.2g移植脂肪加入bFGF1 000U、2 000U、4 000U。其增殖程度遞增。而作為緩釋劑的纖維蛋白原濃度不宜過高。結(jié)果顯示濃度為3 000mg/L,2 000mg/L,1 000mg/L的纖維蛋白原中，低濃度效果較好。組織學(xué)觀察高濃度纖維蛋白原參與的組織標(biāo)本

10、纖維被膜及間隔較厚。這可能因高濃度纖維蛋白原形成更致密而厚的纖維蛋白網(wǎng)而影響bFGF的釋放而妨礙發(fā)揮作用。我們僅從組織移植中觀察到bFGF在緩釋條件下促使移植脂肪重量增殖效應(yīng)。其機(jī)理有待進(jìn)一步探討。1，2 術(shù)后3個(gè)月，移植脂肪被膜完整血管豐富組織豐滿，1為移植物深面，2為淺面3，4 術(shù)后3個(gè)月移植脂肪被膜包裹，纖維組織分隔，脂肪細(xì)胞成熟Fig1,2 Postoperative 3 months, the transplanted fat tissue showing fullness and with a capsule exhibiting prominent blood vessel ne

11、tworks, fig 1 showing deep surface of gratf and fig 2 showing superficial surfaceFig3,4 Postoperative 3 months, sevtions of graft showing normal adipocyte morphology surrouded and separated by fibrotic tissue本課題受海南省自然科學(xué)基金資助作者單位：570311海南省人民醫(yī)院口腔科(廖天安、陳麗媚)；海南醫(yī)學(xué)院病理教研室(謝富生)，附屬醫(yī)院口腔科(王瓊超、符起亞)參考文獻(xiàn)1Eppley BL

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