小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及分離純化實(shí)驗(yàn)方案

1、小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及分離純化實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)閱讀，參考了眾多對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方案，對(duì)比了不同方案的利弊優(yōu)缺，整合了相對(duì)符合本實(shí)驗(yàn)室條件和實(shí)驗(yàn)要求的方法，如有其他變更方案，以修改后為準(zhǔn)。1. 實(shí)驗(yàn)材料與試劑剪刀、小鑷子、小毛刷、DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、馬血清、0。25，0。05%胰蛋白酶、PBS液、青霉素、鏈霉素、培養(yǎng)皿離心管、50 mL 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、CO2 恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、細(xì)胞板、熒光標(biāo)記二抗、0。4 Trypan Blue染色液、抗小鼠OX42單克隆抗體和新生SD小鼠等 試劑配比:(1) DMEM 10：10:1DMEM， 10%FBS, 10%Hors

2、e Serum， 1 Penicillin/Streptomycin （P/S)(2) DMEM 5：5：1DMEM, 5% FBS， 5 of Horse Serum, 1 P/S(3) SERUM FREE MEDIUM +GROWTH FACTORS（DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基+生長(zhǎng)因子）25g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白,10nM生物素，30 nM亞硒酸鈉，1g/ml putrescine(腐胺）,5g/ml胰島素, 20 nMhydrocortisone（氫化可的松）,20 nMprogesterone（孕激素)，1P / S+生長(zhǎng)因子(5ng/ ml的血小板衍生生長(zhǎng)因子PDGFAA和5ng /

3、 ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF）胰蛋白酶/ EDTA溶液0。05%胰蛋白酶+0。02EDTA在W / O內(nèi)Ca2+ / Mg2 +的HBSSDMEM/F12 containing 25 g/ml transferrin, 10 nM biotin， 30 nM sodium selenite, 1 g/ml putrescine， 5 g/ml insulin， 20 nM hydrocortisone, 20 nM progesterone, 1 P/S + Growth Factors （5 ng/ml PDGF-AA and 5 ng/ml bFGF）Trypsin/EDTA so

4、lution 0.05 Trypsin + 0，02 EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+· Laminar flow hood· Dissecting magnifying glass· Water bath at 37ºC· Humidified tissue culture incubator （37ºC， 5 CO2）· Sterilized microdissecting instruments： large dissecting scissors, mouse-teeth forceps， cur

5、ved forceps and fine Dumont forceps· Orbital Shaker (Boeco OS 20）· Tabletop centrifuge· 50 ml plastic conical tubes （Sarstedt， 62.547。004）· T75 cm2 tissue culture flasks with plugseal (BD Falcon, 137787)· Tissue culture plates （Falcon)· Petri dishes （Sterilin)· 30

6、m sterile nylon mesh （Saatilene, Hitech)2。實(shí)驗(yàn)步驟2。1星形膠質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)取新生SD小鼠若干只（出生24h內(nèi)）,在無(wú)菌條件下斷頭， 迅速剪開(kāi)顱骨， 取出腦組織至盛有冷PBS 液的培養(yǎng)皿中反復(fù)沖洗以去除血污； 再把全腦移入另一盛有PBS 液的培養(yǎng)皿中， 用小毛筆輕輕刷去腦表面的腦膜和血管， 用PBS液沖洗后剪去腦干僅留大腦半球； 用小剪刀充分剪碎腦組織, 加入比組織塊總量多3050倍的0。05%胰酶, 再移入50 mL 離心管， 用吸管反復(fù)吹打消化至肉眼觀(guān)察無(wú)明顯的腦組織團(tuán)塊; 加入DMEM/F12 完全培養(yǎng)基（含10胎牛血清、100U/mL 青霉素

7、和100 ug/mL 鏈霉素） 終止消化， 再次反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液, 配平， 1000 r/ min， 離心5min, 棄上清; 加定量完全培養(yǎng)液再次制成細(xì)胞懸液, 更具實(shí)驗(yàn)需要接種入若干個(gè)50 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中， 置于5CO2 恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱( 37度) 培養(yǎng)； 3 h 后更換1 次培養(yǎng)液， 以后每3 d 換1 次液， 并在鏡下觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活情況。2.2星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離和純化將培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中的混合膠質(zhì)細(xì)胞上清棄去，用0。01mol/L PBS 洗2遍。用無(wú)血清培養(yǎng)基0.25%胰酶6 mL 加入培養(yǎng)瓶，37消化15 min 左右,至鏡下觀(guān)察到大部分星形細(xì)胞脫落，將含有星形

8、膠質(zhì)細(xì)胞的消化液立即置于等量含10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基中止消化,1000 r/ min離心5 min，再用PBS 洗2 遍后,重懸于含10 FBS DMEM/F12 培養(yǎng)基中，種于培養(yǎng)瓶中； 將培養(yǎng)瓶置于37細(xì)胞培養(yǎng)箱穩(wěn)定貼壁1 d 后,再用37恒溫定軌搖床，200 r/min 振搖2 h;吸取上清液棄去(其中主要包括一些小膠質(zhì)細(xì)胞和部分少突膠質(zhì)細(xì)胞） ，貼壁細(xì)胞采用0。 25 胰酶37消化后立即置于含10 FBS DMEM/F12 培養(yǎng)基中，終止消化后，1000 r/ min離心5 min,棄上清，將沉淀細(xì)胞重懸于含10%FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)基,計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度10

9、6 /孔接種于6 孔培養(yǎng)板中，穩(wěn)定24 h 后可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2。3星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定本實(shí)驗(yàn)建議選擇OX42作為小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物， 能同時(shí)反映小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)，以O(shè)X42抗小鼠CD11b/c抗體免疫熒光染色法鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞.具體步驟:(1）待小膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)成片后, 取出蓋玻片， 依次用PBS液清洗3次，每次5 min, 冰丙酮固定15 min， 干燥5 min， PBS漂洗3 次； （2）特異性抗體：按照說(shuō)明書(shū)稀釋比要求稀釋抗體，加入抗體，放置37孵育60min，進(jìn)行抗體標(biāo)記.（3)洗滌:1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次/15 分鐘,晾干.(4）加入熒光標(biāo)記抗體，37孵育30min.1 × PBS （pH 7。4 )洗滌3次/15 分鐘，晾干。（5）封片：封片劑封片.(6）鏡檢:熒光顯微鏡下觀(guān)察,膠質(zhì)細(xì)胞包質(zhì)呈現(xiàn)較強(qiáng)黃綠色熒光，細(xì)胞核周?chē)绕涿黠@.注意事項(xiàng)1、選材注意選取新生小鼠(24h內(nèi)）。取材過(guò)程盡可能保證無(wú)菌，盡量剔除腦膜及血管和海馬部分。2、注意盡可能消除腦組織表面的殘血，避免血細(xì)胞及某些血清成分對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞貼壁的影響.3、應(yīng)嚴(yán)格掌握好酶的消化濃度和消化時(shí)間.4、嚴(yán)格控制膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)條件。包括細(xì)胞培養(yǎng)用液（培養(yǎng)基,生長(zhǎng)因子，血清,抗生素）的質(zhì)量，濃度。5