非甾類同化激素類藥殘留分析前處理方法——凈化（一）

1、非甾類同化激素類藥殘留分析前處理方法凈化（一） (3)凈化辦法 經(jīng)典的凈化處理辦法主要有液液分配(llp)，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)展和獸藥殘留檢測(cè)要求的不斷提高，各種新技術(shù)、新手段也被用來作為生物樣品中非甾類同化激素的樣品前處理辦法，包括固相萃取(spe)、分子印跡(mit)、免疫親和色譜(iac)、固相微萃取(spme)、基質(zhì)固相簇?fù)矸?mspd)等。 1)液液分配(liquid liquid partition，llp) llp是利用樣本中的待測(cè)物與干擾物在互不相溶的兩種溶劑(溶劑對(duì))中分配系數(shù)的差異舉行分別的凈化辦法，通常用法一種能與水相溶的極性溶劑和一種不與水相溶的非極性溶劑配對(duì)來舉行分配，

2、經(jīng)過反復(fù)多次分配，使待測(cè)物與雜質(zhì)分別。llp是最常用的凈化手段，常與其他辦法結(jié)合用于提取液的脫脂等。 shin等采納llp辦法提取和凈化老鼠血清中的zon。在老鼠血清中加入叔丁基甲基醚，渦動(dòng)混合，離心，有機(jī)層氮?dú)獯蹈?，加入乙?0.1%溶液(50+50，v/v)復(fù)溶，渦動(dòng)混合，離心后，取上清液hplc分析。該辦法回收率為79.3%96.2%，日內(nèi)和日間cv低于12.1%，loq為10ng/ml。曹瑩等利用llp凈化雞肝臟中zer殘留。雞肝酶解液中加入，旋渦振蕩，離心，吸取上層液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后，加入和1mol/l溶解，上清液用調(diào)整ph5，用乙醚llp凈化，收集上層溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘余物用0

3、.3%乙酸-乙腈(55+45，v/v)溶解，供lc-ms分析。該辦法的loq為4ng/g，回收率為65.0%86.4%，cv為5.1%15.4%。 2)固相萃取(solid phase extraction，spe) spe利用吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，使其與樣品基體、干擾物質(zhì)分別，然后通過洗脫液洗脫或加熱解吸附，分別和富集目標(biāo)物。與傳統(tǒng)llp相比，spe不需要大量有機(jī)溶劑，不產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，可凈化很小體積的樣品，是目前獸藥殘留分析中樣品前處理的主流技術(shù)。但spe易將共存干擾物萃取出來，且富集倍數(shù)有限。 a.二苯乙烯類 在類化合物的分析辦法中，硅膠柱、hlb柱、石墨化碳黑(gcb)柱、

4、氨基柱(nh2)和硅藻土柱等都被用于動(dòng)物基質(zhì)中二苯乙烯類的凈化。 許泓等采納硅膠spe柱凈化動(dòng)物源食品中的des、hes和dis殘留。用6ml分兩次預(yù)洗硅膠柱，流速4ml/min；上樣，流速2ml/min，在樣品試管中加入3ml淋洗液(-正己烷，6+94，v/v)，混合后過柱，流速2ml/min；用3ml淋洗液以3ml/min流速淋洗，2ml空氣流以4ml/min流速吹過硅膠柱；用6ml洗脫液(乙酸乙酯-正己烷，25+75，v/v)洗脫，流速2ml/min，2ml空氣流以6ml/min流速吹過硅膠柱，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈?，?ml流淌相(-水，70+30，v/v)溶解后，供lc-ms/ms測(cè)定

5、。該辦法對(duì)des、dis的lod為0.05ng/g，在0.510ng/g范圍內(nèi)，回收率為84%108%；對(duì)hes的lod為0.025ng/g，在0.255ng/g范圍內(nèi)，回收率為59%87%。 吳銀良等也利用硅膠spe柱凈化動(dòng)物組織中des、dis和hes。在堿性條件下用乙酸乙酯提取，提取液過硅膠spe柱(5ml正己烷、5ml乙酸乙酯活化)，依次用2ml正已烷、2ml正己烷-乙酸乙酯(85+15，v/v)混合溶劑淋洗，并抽干，用4ml正已烷-乙酸乙酯(80+20，v/v)混合溶劑洗脫，收集洗脫液，gc-ms分析。辦法的lod為0.30g/kg(des)、0.10g/kg(hes)和0.15g/

6、kg(dis)；在0.54.0ug/kg添加水平，回收率為73.0%86.5%，rsd為1.0%7.2%。lohne等用乙腈提取魚肉中的des、dis和hes，然后用硅膠spe柱凈化，lc-ms/ms測(cè)定。dis、des和hes的平均回收率分離為119%、99%和104%，rsd分離為18%、11%和15%；lod低于0.21ng/g，loq在0.180.65ng/g之間。 徐英江等用hlb柱凈化草魚血液、肌肉和肝臟中的des。采納10%和乙酸乙酯提取，提取液用1ml甲醇溶解殘留物，再加9ml水稀釋，過spe柱。hlb小柱依次用10ml乙酸乙酯、10ml甲醇和10ml ph3的鹽酸溶液活化，上

7、樣后，用10ml水-甲醇(9+1，v/v)淋洗，抽干，再用10ml正已烷淋洗，抽干，用5ml乙酸乙酯洗脫。控制囫圇過程流速不超過2ml/min。收集洗脫液，氮吹至近干，流淌相復(fù)溶、過膜，進(jìn)lc-ms/ms測(cè)定。該辦法lod可達(dá)0.5g/kg，loq可達(dá)1.0g/kg；des的平均回收率在85.0%108%之間，批內(nèi)rsd在7.12%8.65%之間；dis的平均回收率在73.1%80.2%之間，批內(nèi)rsd在5.02%7.49%之間。 丁雅韻等采納基質(zhì)固相簇?fù)?mspd)提取和凈化動(dòng)物肝臟中的des，洗脫液再過堿性硅藻土和硅膠spe柱凈化。1.5mlkoh溶液(0.25mol/l)加入0.50g硅

8、藻土中，強(qiáng)烈振蕩，靜置15min，轉(zhuǎn)移到底部有篩板的固相萃取空柱中，在固相萃取裝置上用20ml甲苯-異辛烷(1+9，v/v)淋洗，抽干。mspd洗脫液殘?jiān)?00ul甲苯和0.4ml異辛烷溶解并定量轉(zhuǎn)移到硅藻土柱上，用10ml甲苯-異辛烷(1+9，v/v)淋洗，抽干，用10ml水飽和的乙醚洗脫，收集洗脫液，n2吹干，再用100l二氯甲烷-乙酸乙酯(1+1，v/v)溶解并定量轉(zhuǎn)移到硅膠柱上。硅膠柱已用5ml二氯甲烷-乙酸乙酯(1+1，v/v)和5ml正已烷活化。上樣后用5ml正己烷淋洗，5ml二氯甲烷-乙酸乙酯(1+1，v/v)洗脫，洗脫液n2吹干，衍生化后，進(jìn)gc-ms測(cè)定。該辦法lod低于1

9、g/kg，回收率為81.6%100.9%，rsd為8.7%13.2%。 yang等報(bào)道了豬肉、牛肉、蝦、牛奶和肝臟中的50種同化激素類(包括dis、hes和des)的殘留分析辦法。采納gcb串聯(lián)nh2spe柱對(duì)樣品舉行了凈化。樣品經(jīng)酶解和甲醇提取后，提取液用超純水稀釋，以35ml/min的速度過spe柱凈化。gcb柱分離用6ml二氯甲烷-甲醇(70+30，v/v)、6ml甲醇和6ml水平衡。提取液所有通過gcb柱后，用1ml甲醇洗滌，真空抽干gcb柱，nh2柱用4ml二氯甲烷-甲醇(70+30，v/v)平衡后接在gcb柱下部，8ml二氯甲烷甲醇(70+30，v/v)洗脫，洗脫液氮?dú)獯蹈桑?ml

10、甲醇-水(1+1，v/v)復(fù)溶后，lc-ms/ms檢測(cè)。該辦法的loq為0.042.0g/kg，平均回收率為76.9%121.3%，cv為2.4%21.2%。該討論同時(shí)比較了c18柱串聯(lián)nh2柱和hlb柱串聯(lián)nh2柱的凈化效果。結(jié)果發(fā)覺，gcb-nh2、c18-nh2和hlb-nh2都可以取得愜意的回收率，但c18-nh2和hlb-nh2凈化會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，dis、hes和des的基質(zhì)抑制率為58%88%，gcb-nh2凈化的基質(zhì)抑制率為28%36%。 b.rals 強(qiáng)陰離子交換柱(max)、nh2柱等常被用于動(dòng)物基質(zhì)中rals的凈化。 xia等采納max柱凈化牛奶中的zer、tal

11、、zan.zon、a-zol和-zol。在5ml牛奶中加入5ml乙腈，渦動(dòng)30s，9000r/min離心5min(4)，取上清液，加入1.0ml氨水(2.5mol/l)和10ml水，混勻后過max柱(2ml乙腈和2ml水平衡)，2ml5%氨水和0.5ml乙腈洗滌，真空干燥2min，3ml乙酸-乙腈溶液(2+98，v/v)洗脫，50c水浴中氮?dú)獯蹈桑?.5ml水-乙腈(50+50，v/v)復(fù)溶，過0.22um微孔濾膜后，lc-ms/ms分析。該辦法平均回收率為92.6%112.5%，cv低于11.4%，lod和loq分離為0.010.05g/l和0.050.2g/l。錢卓真等利用nh2柱凈化水產(chǎn)

12、品中的zer、tal、zan、zon、a-zol和b-zol。樣品經(jīng)乙腈提取，正已烷脫脂，下層乙腈溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，乙腈飽和正己烷溶解備用。將nh2柱用5ml乙酸乙酯、5ml正己烷平衡。取提取液過柱，流速不超過1ml/min，再依次用5ml正已烷、5ml正已烷-乙酸乙酯(60+40，v/v)淋洗，4ml正己烷-乙酸乙酯(20+80，v/v)和4ml乙酸乙酯洗脫。洗脫液于50c下氮?dú)獯蹈桑?ml乙腈-水溶液(20+80，v/v)定容，過0.22um微孔濾膜后，lc-ms/ms分析。該辦法loq為1.0lg/kg，回收率為75.9%103.8%，rsd為3.90%13.5%。 c.二苯乙烯類和ra

13、ls同時(shí)凈化 動(dòng)物源基質(zhì)中的二苯乙烯類化合物和rals也可以采納spe舉行同時(shí)凈化。 rubies等建立了spe-lc-ms辦法檢測(cè)動(dòng)物尿液中的tal、zer、hes、des和dis等藥物。尿液酶解后用hlb固相萃取柱凈化，lc-ms/ms檢測(cè)。該辦法的回收率為71.4%106.4%；cca為0.20.9ug/l，cc為0.31.0ug/l。kathrin等2建立了采納spe同時(shí)凈化牛尿中二苯乙烯類化合物(des、dis、hes)和rals(zer、tal、a-zol、-zol和zon)的辦法。5ml尿液樣品中加入2ml乙酸鈉緩沖液(2mol/l，ph5.2)，加入100l蝸牛液(helixpomatiajuice)，37避光放置16h或50放置3h，水解完成后用2mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)ph9.0+0.1，5ml乙醚提取2次，旋轉(zhuǎn)蒸干，加入1.5ml甲醇和3ml水，2ml正已烷洗滌2次，棄掉正已烷層，過已用5ml甲醇和5ml水平衡的hlb柱