凍干皮上劃痕用鼠疫活菌苗制造及檢定規(guī)程

1、凍干皮上劃痕用鼠疫活菌苗制造及檢定規(guī)程本品系采用鼠疫菌弱毒菌株， 經(jīng)培育后凍干制成。用于預(yù)防 鼠疫。1 菌種1.1菌種來源用弱毒的 EV 菌株，由中國藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意、。1.2菌種檢定凍干菌種在生產(chǎn)前每年需要檢查一次培養(yǎng)特性、生化特性、 噬菌體裂解試驗及安全性。1.2.1培養(yǎng)特性在瓊脂平皿上，37C培育 4448 小時之菌落應(yīng)為粗糙型，在肉湯中液面有薄菌膜，管底有沉淀物，肉湯透明。1.2.2生化特性應(yīng)分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，石蕊牛乳輕度變紅，在甘油培 養(yǎng)基內(nèi)不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。1.2.3噬菌體裂解試驗將 EV 菌種涂于瓊脂平皿上，加滴度為 10-6 以上的鼠疫噬菌 體 1滴，于 28C

2、培育 4448 小時，在噬菌體流過的地方應(yīng)無本 菌生長。1.2.4安全試驗用體重 300400g 豚鼠 3 只， 每只皮下注射 120 億菌 （28 30C培育 4448 小時的培養(yǎng)物）。在注射后第6 天解剖 1 只，第 21 天解剖 2 只，檢查注射部位、脾、肝、肺，并用脾、肝、 肺及心血進行培育。其中心血和肺培育應(yīng)無本菌生長。肉眼檢查病變，注射部位可見充血，浸潤變?yōu)槟摨?，肝和脾可有丘疹狀結(jié) 節(jié)，肺部不應(yīng)有鼠疫特異病變?yōu)榘踩囼灪细瘛７尾咳缬酗@著病變時，應(yīng)用同量豚鼠復(fù)試，若仍有顯著病變時，菌種應(yīng)廢棄。1.2.5免疫力試驗用體得200250g的豚鼠10只， 每只皮下注射70萬菌 （28 30C

3、培育 4448 小時的培養(yǎng)物）一次。于 2025 天后進行攻擊，每只皮下感染鼠疫強毒菌 200 個 MLD。同時用 3 組豚鼠作對照， 每組 3 只，各組豚鼠皮下分別注射 0.5、1 及 2 個 MLD 勺毒菌。 免疫組及對照組至少觀察 25 天。免疫動物存活不少于 8 只，而 對照動物注射 1 個及2 個 MLD 全部死亡時，免疫力試驗為合格。1.3 菌種保存菌種應(yīng)凍干保存，凍干菌種保存于 28C暗處。2 菌苗制造2.1制造鼠疫活菌苗之實驗室在生產(chǎn)期間應(yīng)專用，不得作 其他細菌工作，絕對禁止保存鼠疫毒菌。2.2制造用培養(yǎng)基制造菌種可用 pH6.87.2 的厚氏瓊脂培養(yǎng)基或其他適宜 的培養(yǎng)基。2

4、.3原液制造2.3.1第 1 代菌種啟開干燥菌種加入生理鹽水溶解后，接種于厚氏瓊脂培養(yǎng)基 上，于 2830C培育 4448 小時為第 1 代。放 28C保存可使 用半個月。2.3.2第 2 代菌種用生理鹽水將第 1工菌種洗下， 接種足夠量的種子瓶， 于 2830C培育 4448 小時為第 2 代，供大批生產(chǎn)用。不得用第 3 代菌種生產(chǎn)。2.3.3大量接種第 2 代菌種經(jīng)肉眼檢查無雜菌后， 加入適量生理鹽水洗下菌 苔，制成均勻的菌懸液，用此菌懸液接種培養(yǎng)瓶，于 2830C培育 4448 小時后，逐瓶肉眼檢查，有雜菌者廢棄。2.3.4采集用由蔗糖、明膠、硫脲、味精及尿素組成的保護液洗下菌苔（洗菌前

5、將凝固水倒去）或?qū)⒕稳肷鲜霰Ｗo液內(nèi)，制成原液。每瓶原液均應(yīng)按生物制品無菌試驗規(guī)程進行純菌試驗，不得 有雜菌生長。2.3.5合并、稀釋、分裝用 4 層紗布或絹布將純菌試驗合格之原液過濾合并，按中國細菌濁度標準比濁后用保護液稀釋，使稀釋后每人份含菌數(shù)7億9 億。然后按 10 或 20 人份分裝于安瓿，并進行凍干。采集 至凍干，原液不得超過 7 天，合并后的原液應(yīng)按生物制品無菌 試驗規(guī)程進行純菌試驗。2.4菌苗分批同一日培育的原液于同一次冷凍干燥者為1 批。如 1 批有數(shù)瓶，應(yīng)分亞批。3 凍干菌苗分裝后應(yīng)立即在-30C以下進行冷凍。干燥時間可根據(jù) 水含量及活菌數(shù)來決定。干燥完畢后進行真空封口，亦

6、可充氮封口。4 成品檢定4.1物理性狀檢查本品為白色或淡黃色疏松體。用真空測定器檢查安瓿應(yīng)為真 空。菌苗水分含量不得超過 3%加入生理鹽水后應(yīng)在半分鐘內(nèi) 溶解成均勻懸液。4.2濃度測定菌苗經(jīng)稀釋后，按中國細菌濁度標準（7 億/ml ）測定濃度。 皮上劃痕用菌苗每人份含菌數(shù)為 7 億9 億。4.3活菌數(shù)測定由生產(chǎn)部門會同質(zhì)量檢定部門進行。每亞批取 3 支安瓿，加生理鹽水溶解后，混勻比濁，稀釋至10 億/ml。再按 10 倍系列稀釋至 10-6。 用 10-6 稀釋度懸液接種 5 個平皿， 每個平皿接種 0.1ml。涂勻后放 2830C培育 23 天，計算活菌數(shù)。凍干后 活菌率不少于45%為合格。

7、如低于 45%寸可復(fù)試，如仍不合格則 該批菌苗應(yīng)廢棄。4.4純菌試驗每批菌苗按生物制品無菌試驗規(guī)程進行。5 菌落、菌形檢查應(yīng)呈典型粗糙型菌落，涂片鏡檢，為革蘭氏陰性桿菌。4.6安全試驗由生產(chǎn)部門會同質(zhì)量檢定部門進行。每亞批菌苗取2 支安瓿，用生理鹽水溶解后，用體重 300400g 豚鼠 2 只，每只皮下 注射 120 億菌，第 6 天稱豚鼠體重（不應(yīng)比原體重減輕 1/5 以上） 并取其中 1 只解剖，另 1 只觀察到 21 天解剖。檢查項目及要求 均同 1.2.4項。4.7免疫力試驗每 10 批菌苗抽檢，10 批以下者每 35 年至少檢查 1 次。由生產(chǎn)部門會同質(zhì)量檢定部門進行。用體重250300g 豚鼠 10只，每只皮下注射 5000 萬菌，注射后 2025 天以 200 個 MLD 的 鼠疫毒菌進行皮下攻擊。同時有 3 組豚鼠作對照，每組 3 只，分 別于各組豚鼠皮下注射 0.5、1 和 2