第七章 抗原抗體反應及應用

1、第七章 抗原抗體反應及應用 不論天然的還是人工合成的分子，只要能被機體的免疫系統(tǒng)識別的都可以誘導機體的免疫應答，產(chǎn)生相應的抗體。大多數(shù)抗體和抗原本身是既有免疫原性(誘發(fā)產(chǎn)生特異抗體)，又有反應原性(與特異的抗體相結合)?？乖c抗體的特異性反應不僅可以在體內進行，而且可以在體外進行。一切利用血清學技術方法所進行的各種測試都是基于這一根本的特性?？贵w反應技術的應用之廣泛已經(jīng)遠遠超出了免疫學、醫(yī)學、甚至生命科學的范圍，成為類微量，靈敏，快速的檢測分析方法。本章著重介紹抗體制備，抗體抗原反應原理及技術方法的應用。第一節(jié)抗體的制備 環(huán)境中的大部分生物(包括病原生物)及其產(chǎn)物分子和一些化合物對哺乳動物的免

2、疫系統(tǒng)而言是外源抗原，這些抗原能通過侵染或其他的途徑刺激免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生以抗體為主的體液免疫應答。同樣用抗原人工免疫實驗動物，可以獲得含有特異性抗體的血清，稱為抗血清(antiserum)，因血清中抗體是多個抗原決定簇刺激不同B細胞克隆而產(chǎn)生的抗體，所以稱多克隆抗體(polyclonal antibody)。一個B細胞克隆所分泌的抗體即為單克隆抗體。用免疫動物的B細胞與骨髓瘤細胞融合，在體外可以分離出許多單個B細胞克隆，以此方法可制備單克隆抗體(monoclonal antibody)。隨著分子生物學技術的發(fā)展，已經(jīng)可以用抗體基因文庫(antibody combinatorial library

3、)篩選制備單克隆抗體。應用基因工程技術，根據(jù)需要對抗體進行改造，獲得基因工程抗體(engineering antibody)，以及催化性抗體(catalytic antibody 或abozyme)等的全新的抗體。 一、抗血清的制備 1免疫動物 (1)抗原：免疫動物是制備抗血清的第步。免疫所用的抗原可用病毒、細菌或者其他蛋白質抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必須與大分子載體連接，連接劑見表71?？乖挠昧恳暱乖N類及動物而異，次注射小鼠可以少至幾個微克，免、羊甚至更大的動物每次注射的量就相應增加，從幾百g次至幾mg次。2)佐劑及乳化：佐劑可以幫助抗原在注射部位緩慢釋放，以增加免疫刺激的效果

4、。佐劑有完全和不完全佐劑之分。完全佐劑加有滅活的分枝桿菌(如卡介苗)或棒狀桿菌。福氏佐劑可從試劑公司購買，也可用羊毛脂和石蠟油按1：24混合自行制備。佐劑與抗原按1：1的比例混合乳化為均勻的乳液，放置后不會發(fā)生油水分離。 (3)免疫動物：常用于制備抗血清的動物打豚鼠、家免、小鼠、大鼠等，如果大量生產(chǎn)可用動物羊、馬等，動物接受免疫的乳液量小鼠為1020 mL，家兔為24mL?？乖庖邉游锏耐緩饺Q于動物種類、抗原特性和是否使用佐劑。腹腔注射(ip)，肌肉注射(im)，皮內注射(id)和皮下注射(sc)適合于任何抗原，這些途徑主要刺激局部淋巴結發(fā)生免疫應答，初次免疫和免疫加強注射均可使用。靜脈注射

5、(i.v.)則只適合于可溶性抗原及分散的單細胞懸液，且不能使用佐劑，其誘發(fā)的免疫應答主要發(fā)生在脾臟。此外，在單克隆抗體制備時，亦可用脾臟直接注射或體外免疫方法，尤其對微量抗原比較實用。體外免疫方法也常用于人源單克隆抗體的制備。體外免疫時將脾細胞或外周血淋巴細胞(包括B細胞，T細胞及抗原遞呈細胞)與抗原一起作體外培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細胞融合。初次免疫后要經(jīng)過23次以上的免疫加強以保證能形成較高水平的IgC抗體。兩次免疫注射之間的時間間隔，一般34周比較適合大部分動物，小動物可間隔1014d，大動物則在2月左右。在免疫加強最后一次注射后的一周內采集抗血清，可獲得高水平的抗體。 2抗血清的純化與保存

6、 （1）采血：加強免疫的動物23次后，可通過耳靜脈或眼球(小鼠)采血，進行抗血清效價測定。當效價達到理想的高度后，可以采血。采血方式可以從心臟直接取血，也可通過動脈放血。待血液凝固后用針筒或吸管吸取血清。 (2)抗血清的純化與保存：除抗體外血清中含有多種其他蛋白成分。為了避免這些蛋白質干擾抗體(免疫球蛋白)標記反應和抗原抗體反應，抗血清可經(jīng)過純化以獲得單一的機體(常為IgG)組分。常用的純化IgG的方法為飽和硫酸胺鹽析和層析法。蛋白質在不同的鹽濃度的溶液中，其溶解度不一樣，鹽離子干擾蛋白質和水分子間氫鍵形成，因為水鹽結合比水蛋白質結合更穩(wěn)定，蛋白質即可從溶液中沉淀出來。蛋白質分子越大，沉淀時所

7、需鹽離子濃度越低。免疫球蛋白(Mr 1.5105)比血清中主要蛋白質白蛋白(M r 6.7104)的分子大得多，抗體在3050飽和度的硫酸鹽中析出，而白蛋白需在7080飽和度才析出，因此常用33飽和度的硫酸胺純化血清中的IgG。鹽析時為了減少抗體變性，需在4進行，同時用pH8.0緩沖液稀釋抗血清，以減少蛋白濃度過高而發(fā)生共沉淀。銨鹽的溶解度不隨溫度變化而明顯改變，0和25僅差3，而鈉鹽則相差5倍，因此常在低溫沉淀時用銨鹽，室溫沉淀用鈉鹽。銨鹽對抗體的標記反應(如FITC和biotin標記時)有一定的干擾作用。 鹽析法只能部分純化抗體，更高純度的抗體制劑可用層析法制備。 IgM五聚體相對分子質量

8、達9.7105，比血清中任何其他蛋白都大，用分子篩層析很容易將其純化。IgG在PH 80時帶負電荷，能與DEAE纖維素上的陽離子結合，因此可用離子交換層析來純化IgG。IgG純化最常用的方法為親和層析。IgG與葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白具合高度的親和性，可用這兩種蛋白質交聯(lián)親和層析柱將IgG純化。大部分IgG與蛋白A結合PH為89，洗脫PH為24；而與蛋白G的結合PH為57，洗脫PH為910。C蛋白更適合于IgG的純化，不但反應條件為溫和的弱酸性或弱堿性，并且與IgG的結合力高于A蛋白。G蛋自能與大部分動物種類的IgG結合，而A蛋白對小鼠IgG1、大鼠IgG2b、人IgG3、馬和綿羊IgG結

9、合力弱或不能結合G蛋白和A蛋白均不能與雞IgG結合。 抗血清或純化的抗體在低溫保存可維持活性數(shù)年，反復凍融使抗體很快失活，被細菌或霉菌污染的抗血清或IgG制品也易失去活性。稀釋的抗血清加入防腐劑疊氮化鈉和保護劑如BSA等可于4保存。長期保存常用等量甘油于20以下冷藏。也可置于 50飽和硫酸銨中4保存，還可以冷凍干燥保存。 3抗血清的特性鑒定 根據(jù)不同目的制備的抗血清，對其中所含抗體的濃度，特異性及免疫球蛋白種類的要求也不一樣。為了獲得質量和數(shù)量上合符要求的抗血清，在收集動物血清前必須對免疫效果進行檢測，對收獲后的抗血清也必須對些參數(shù)進行分析，如效價、親和力及交叉反應等。 根據(jù)不同的抗原性質選用

10、合適的檢測方法。最常用的為免疫沉淀，ELISA，放射免疫等。 效價又稱滴度(titer)，是常用于表達抗血清中特異性抗體相對含量的個半定量指標，即在給定的條件下，結合定量抗原的抗血清的稀釋度?？寡褰?jīng)一系列稀釋后(如倍比稀釋)與定量的抗原反應，以能檢測抗血清最大稀釋倍數(shù)即為該抗血清的效價。不同的檢測方法測定同一種抗血清的效價，靈敏度不一樣，抗血清的效價也不一樣，如沉淀反應(瓊脂雙擴散)與ELISA二者的效價相差甚大，后者遠高于前者。放射免疫分析(RIA)常用于標記小分子抗原來檢測抗血清的效價。 親和力(affinity)表示抗血清與相應抗原的結合強度，是描述抗體持異性的重要指標，常用親和常數(shù)K

11、表示。親和常數(shù)K與抗原抗體反應的平衡常數(shù)有關： K+ AgAb AgAb KAgAb K+ K= K=AgAb K 式中K+為結合速度常數(shù)，K為解離速度常數(shù)。親和常數(shù)K的測定見第二節(jié) 抗體特異性與交叉反應：抗體是特異的。只與相應抗原反應。實際制備的抗體卻常有非特異性反應，這是因為抗原不純造成的。多組分抗原之間存在共同的抗原決定簇，或者兩個抗原決定簇結構類似能與同一抗體結合，均可出現(xiàn)抗體與異源抗原的交叉反應。用瓊脂雙擴散能簡便直觀地反映不同抗原與同一抗血清，或不同抗血清與同一抗原的交叉反應。 二、單克隆抗體的制備 1制備原理 單克隆抗體(MAb)與抗血清(又稱多克隆抗體，PAb)最主要的區(qū)別是M

12、Ab為單一種B細胞克隆所產(chǎn)生的一種均一的免疫球蛋白分子。所以MAb是B細胞克隆的標志，是一種獨特型的抗體，它的特異性是針對一個抗原決定簇的。制備單克隆抗體不能用化學分離的方法從多克隆抗體中去分離純化得到它，而是用分離產(chǎn)生抗體的B細胞克隆的方法得到它。為了使B細胞克隆能在體外人工培養(yǎng)下長期存活并產(chǎn)生完全均一的MAb，GKhler合Milstein于1975年創(chuàng)立了雜交瘤方法。所以制備單克隆抗體的技術又稱雜交瘤技術(hybredoma technique)。 雜交瘤技術的基本原理是用分泌抗體但不能長期培養(yǎng)的B細胞與能在體外長期培養(yǎng)并可低溫保存的腫瘤細胞進行雜交。篩選得到的雜交瘤細胞應該是既能分泌抗

13、體又有瘤細胞的特性，可長期傳代培養(yǎng)，又可在液氮中保存的細胞。把這些細胞單克隆化，用單克隆化的雜交瘤細胞進行單克隆抗體的生產(chǎn)（圖71）。 2B細胞與瘤細胞的來源及雜交瘤選擇原理 最常用的單克隆抗體是小鼠的單抗，此外也有大鼠的和人源的單抗。人源單抗制備比較復雜。小鼠單抗的制備通常是使用Balbc小鼠的B細胞和它的骨髓瘤細胞。大鼠的單抗制備通常用Louc大鼠及其骨髓瘤和Y3AO大鼠及其骨髓瘤細胞(表72)。B細胞是從免疫動物的脾臟中分離出來的。動物免疫方法與抗血清制備相同，只是在制備脾臟前3d必須進行一次靜脈加強注射以保證得到的B細胞有旺盛的分泌抗體的活性。骨髓瘤細胞有許多細胞株是經(jīng)過誘變和篩選得到

14、的缺陷型。篩選的標準是瘤細胞本身不產(chǎn)生抗體或者產(chǎn)生抗體的某種鏈，但不能分泌；是次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)的缺陷型。因為這種缺陷型的瘤細胞正常的核酸合成途徑被氨基喋吟(aminopterin)阻斷后，由于缺失這些酶，即使補充它的底物次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)，核酸合成的旁路也不能起到救援的作用，結果導致瘤細胞死亡(圖72)。而雜交瘤細胞因帶有B細胞的全套基因，在HAT存在的條件下借助于HGPRT和TK的作用通過替代的核酸合成途徑能正常合成DNA和RNA。所以雜交瘤能正常地生長繁殖而被選擇出來。未被融合的游離的B細胞只能存活3d而后自行死亡。這就是用HAT培

15、養(yǎng)基進行選擇的原理。 3細胞雜交與選擇培養(yǎng) (1)融合：細胞雜交之前，要分別準備好脾臟的B細胞懸液和小鼠骨髓瘤細胞(如SP20Agl4細胞株)。免疫后的小鼠脾臟在無菌條件下破碎，將B細胞懸浮在沒有血清的培養(yǎng)液中(通常使用RPMIl640商品配制)，并洗滌3次去掉小鼠的血清。SP20細胞是用加有10胎?；蛐∨Ｑ迮囵B(yǎng)的，每天更換新鮮培養(yǎng)液使成為對數(shù)分裂期生長旺盛的細胞。細胞用RPMIl640洗滌23次，把兩種細胞合并在同試管中，用50的聚乙二醇(相對分子質量為10001500)作為融合劑，在37條件下融合l2min。然后用1640培養(yǎng)液緩慢稀釋，然后除去PEG，將細胞分散至HAT選擇培養(yǎng)板中。電

16、融合方法也可用于單克隆抗體制備，雖融合率較高，但一次融合的細胞數(shù)少，且需專門設備，故限制了其廣泛使用。融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例在5：110：1均可獲得滿意結果，每次融合細胞數(shù)量在107108較為合適。融合后的細胞在40或96孔板上的HAT培養(yǎng)液(RPMIl640含1020胎?；蛐∨Ｑ搴虷AT)中37，5CO2條件下培養(yǎng)。融合后的細胞懸液中只有脾細胞和骨髓瘤細胞形成的雜交瘤細胞能在HAT培養(yǎng)基中生長，其他形式的融合細胞均不能生長未融合的細胞也不能在HAT培養(yǎng)液中生存(表73)。 在融合后的細胞培養(yǎng)過程中，飼養(yǎng)細胞(feeder cell)有助于雜交瘤細胞的生長。飼養(yǎng)細胞可用同種動物的腹腔

17、細胞或胸腹細胞。腹腔細胞中的吞噬細胞能清除死亡細胞碎片。使背景更為清潔“干凈”。同時飼養(yǎng)細胞分泌的細胞因子或活性物質有助于雜交瘤細胞的生長?，F(xiàn)有商品“雜交瘤細胞生長因子”可用于替代飼養(yǎng)細胞。 (2)陽性雜交瘤細胞的篩選與單克降化：雜交細胞經(jīng)約1014d培養(yǎng)后，形成可用的細胞集落(克隆)。經(jīng)過幾次更換培養(yǎng)液(HT培養(yǎng)液)后進行抗體活性檢測。常用的篩選槍測方法是ELISA和凝集試驗，前者常用于可溶性抗原，后者適用于細胞、細菌等表面抗原。此外，DotELISA、免疫印跡及免疫熒光試驗均可用于雜交瘤細胞的篩選。 使許多細胞克隆混合生長的細胞分離為單個的細胞克隆的過程稱克隆化(colonization)

18、最常用的單克隆化方法是有限稀釋法(limited dilution)，即將混合細胞經(jīng)稀釋后分裝于培養(yǎng)板上，使培養(yǎng)板的大部分孔中只出現(xiàn)一個細胞。為了確?？贵w分泌細胞來源于單個細胞，克隆化過程可重復進行，稱為亞克隆化(subclonization)。除有限稀釋法外，熒光激活細胞分揀法(FACS)也用于雜交瘤細胞的克隆化過程。 4單克隆抗體的擴大生產(chǎn) 產(chǎn)生特異性抗體的單克隆雜交瘤細胞株應立即擴大培養(yǎng)，以獲得足夠的細胞用于保存和生產(chǎn)可供應用的抗體。生產(chǎn)大量單克隆抗體的方法目前常用的有3種：小鼠腹水制備，大瓶培養(yǎng)和中空纖維反應器，前者多用于實驗室制備，后二者適應于工廠化生產(chǎn)。 腹水制備：雜交骨髓瘤細胞在

19、腹腔中定植，并產(chǎn)生大量腹水。選用與單克隆抗體制備所用相同的動物品系或者含有相同基因的Fl代雜交品系。雜交F1代品系更適合于腹水制備，如果用異源動物制備腹水時可選用無MHC限制性的裸鼠。用小鼠制備腹水時，先用礦物油或Pristane致敏，以抑制其免疫功能，利于腹水的形成。腹腔注射106107個雜交瘤細胞，經(jīng)過710 d后形成腹水。每只小鼠可獲得35mL腹水，每mL含IgG抗體可達510mg。腹水中含有較多的雜蛋白和非特異性IgG，并且含有許多蛋白酶，易使抗體失活，因此腹水收集后應盡快純化，以防止降解。 大瓶培養(yǎng)：采用1000mL或更大的搖瓶培養(yǎng)。大瓶培養(yǎng)上清體積大，但抗體濃度低，給抗體純化帶來很

20、大困難，消耗人力和培養(yǎng)液，增加生產(chǎn)成本。 中空纖維反應器：是比較經(jīng)濟的單克隆抗體生產(chǎn)方法。該裝置由具有半透膜性質的成束的微孔纖維組成，雜交瘤細胞位于纖維外部的小量培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液在纖維的微孔中循環(huán)，供給營養(yǎng)和帶走廢物，抗體大分子和小分子化合物被隔開。高密度的雜交瘤細胞能在此系統(tǒng)中維持數(shù)月，每天可產(chǎn)生數(shù)百毫克的抗體，抗體濃度高，體積小易于純化。 胎(小)牛血清一直是細胞培養(yǎng)所必須的，在單克隆抗體生產(chǎn)過程中培養(yǎng)液中的血清蛋白使抗體的純化增加了困難，近年開發(fā)的無血清培養(yǎng)技術已逐漸用于單克隆抗體的生產(chǎn)中。 5人單克隆抗體的制備 小鼠的單克隆抗體蛋白應用于人體后，作為抗原能引起人的免疫應答，大大降低其生

21、物活性，并可能導致變態(tài)反應。因此人源單克隆抗體在臨床治療上有廣泛應用前景，引起人們的普遍興趣。但是人單克隆抗體制備存在許多技術上和倫理上的障礙，如人雜交瘤細胞系不穩(wěn)定，有些抗原不能對人進行人工免疫，人B細胞只能從外周血中分離而無法從脾臟取得等。盡管如此，一些人源單克隆抗體已經(jīng)獲得，技術上也在逐步完善起來。 人的瘤細胞株U266常用來與人外周血B細胞融合以獲得人源單克隆抗體。另一些淋巴母細胞抹(LCL)則來源于EB病毒轉化的淋巴細胞，如GMl500，W1L2和ARH77等也用于雜交瘤細胞的制備。這些細胞系表現(xiàn)ED病毒核抗原(EBNA)陽性，且形成的雜交瘤細胞抗體的分泌水平不高。 獲得人單克隆抗體

22、的另一方法是用EBV直接轉化某些抗體分泌細胞，使之成為“不死”的細胞在體外培養(yǎng)。EBV感染人B細胞后，病毒基因插入人B細胞基因組中，有1的細胞轉化為“不死”的細胞。B細胞轉化可通過“病毒驅動”和“細胞驅動”兩種方法獲得。前者是將B細胞與分泌EBV的B958細胞系一同培養(yǎng)，后者則是與EBNA陽性的LCL細胞一同培養(yǎng)?！凹毎寗印鞭D化的B細胞比較穩(wěn)定，抗體分泌能力也較強。 人淋巴母細胞系和人雜交瘤細胞較難獲得，人單克隆抗體也可以通過異源雜文的辦法制備，即將EBV轉化的B細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，將獲得的異源雜交瘤細胞再與免疫后的B細胞融合，得到人單克隆抗體分泌細胞，不產(chǎn)生自身免疫球蛋白，EBVA也

23、是陰性。 三、基因工程抗體的制備 1抗體的化學修飾 抗體Fc段用雙功能連接劑與熒光素，同位素，酶，發(fā)光化合物，稀土元素以及藥物，毒素等連接后，并不影響其Fab功能區(qū)與特異性抗原結合。根據(jù)交聯(lián)物的性質不同，標記的抗體可用作診斷試劑，也可作為藥物的定向載體，引導藥物或毒素到達抗原存在部位使藥物或使毒素發(fā)揮更有效的作用，即俗稱“生物導彈”。從而減少藥物、毒素、同位素、酶在腫瘤治療過程中引起嚴重的副作用，大大提高治療腫瘤的效果。 許多毒素如蓖麻毒素，白喉毒素，天花粉，紅豆毒素等均為蛋白質或糖蛋白，可用雙功能劑與抗體相連；嗎啡，前列腺素，氨甲喋吟，磷酸酯酶C等含有羧基能用碳二亞胺(EDC)，混合酸酐法與

24、抗體的氨基形成酰胺鍵；同樣，含脂肪胺的藥物如慶大雷素，阿霉素在水溶性EDC的作用下與抗體的羧基連接；而含芳香胺的藥物則先在低溫下與亞硝酸作用形成重氮化合物，再與抗體分子上的酪氨酸或組氨酸殘基形成偶氮鍵?？傊ㄟ^抗體的化學修飾把抗體的特異性用到定向給藥和定位檢測上。 2抗體基因文庫 抗體基因文庫(antibody recombination library)是將不同的重鏈和輕鏈基因隨機組合，克隆到合適的表達載體中，在原核細胞表達不同的抗體，形成一個抗體庫，從這個抗體庫中，用抗原可以篩選到相應的抗體基因(圖73)?？贵w基因來源于雜交瘤細胞或動物B細胞(免疫或未免疫)的DNA和mRNA 。用質粒作為

25、抗體文庫的載體，雖然也可能表達有活性的抗體分子或片段，但由線狀噬菌體表達更為方便有效。M13、fd、F1等噬菌體的外殼蛋白由5種蛋白組成：p、p、p、p和p。每種含量不一，其中p含量最多，每個噬菌體有2700個p亞基，其余4種蛋白僅5個拷貝。增加噬菌體外殼蛋白的長度并不影響噬菌體的裝配，抗體以融合蛋白的形式表達于噬菌體表面。噬菌體表達質粒常用的有fdCAT1、fdtetDOG1、PHEN1、pComb3和pComb3H等。抗體融合蛋白構建多用p和p，p拷貝數(shù)高，低親和力的抗體蛋白容易篩選出來。在噬菌體表達抗體時，常常不表達完整的抗體分子，（因為CH2上不能進行糖基化）。根據(jù)不同的引物得到重鏈的

26、VH或VHCH1區(qū)，輕鏈的VL或VLCL區(qū)。VL和VH兩個片段用一短肽作連接片段，形成單鏈可變區(qū)（singlechain fragment variable，scFv）；VHCH1和VLCL兩片段則形成Fab片段。另外，單獨的VH和VL也能結合抗原，如果二者形成同源或異源二聚體(dAb)，則穩(wěn)定性和親和性明顯提高(圖74)。此外在抗體片段DNA末端加上一些功能蛋白(如堿性磷酸酶和蛋白毒素)的基因，則表達的抗體就帶有一定生物活性功能片段，可用于檢測或治療。如果在抗體基因末端加上終止子(TAG)則表達的抗體片段是可溶性的，而不是結合在噬菌體表面。 用特異性抗原免疫的動物B細胞構建抗體的噬菌體文庫，

27、抗體親和性高，用與免疫抗原不同的抗原篩選得到的抗體親和性普遍較低。可用模擬天然體細胞突變的方法來提高親和力。如混雜重組法，即將己獲得的輕鏈或重鏈的V片段切下，再克隆至隨機的文庫中的V區(qū)構成二級文庫，使H鏈和L鏈混雜，可以使抗體片段的親和性提高。利用PCR錯配將隨機突變引人至抗體的抗原結合區(qū)，也能提高對抗原的親和力。先用低親和力的載體在噬菌體的P表達，篩選后、將抗體基因片段PCR擴增轉至P上表達，可獲得高親和力的抗體片段。 抗體基因文庫有兩個優(yōu)點，一是從不適合進行人工免疫的物種獲得單克隆抗體，如人源單克隆抗體；二是可快速方便獲得單克隆抗體。 3抗體基因的改造 將鼠源抗體的V區(qū)基因與人源抗體C區(qū)基

28、因重組，獲得的嵌合抗體(chimerical antibody)，可保留鼠抗體對抗原的高親和性，又減弱鼠源抗體對人的免疫原性，提高治療性抗體的效果。重組的嵌合抗體基因轉化骨髓瘤細胞或中國地鼠卵細胞(CH0)，可在其中表達。為了進一步地消除鼠抗體V區(qū)框架區(qū)(FW)的異源性，可實行CDR移植(CDR grafting)，以獲得與鼠FW類似的人FW結構的嵌合抗體。 噬菌體表達的抗體僅含V區(qū)(scFv)或Fab片段，缺乏Fc區(qū)，使抗體的穩(wěn)定性下降，半衰期縮短，與Fc受體結合功能也消失。因此在抗體功能片段的末端連接A蛋白、酶、細胞因子、CD4和毒素等分子，既可增加抗體片段的穩(wěn)定性，又可發(fā)揮某些生物學活性

29、功能。 用抗體基因工程方法獲得的抗體與效應分子交聯(lián)物比用化學交聯(lián)法具有優(yōu)點：可以大量生產(chǎn)，不會因修飾作用影響抗體及效應分子的活性，效應分子還可根據(jù)需要進行改造。 此外在抗體片段的末端連接一段特異的雙親性螺旋(amphiphilic helixes)結構，如亮氨酸拉鏈結構(leucine zipper)，可使單價的scFv或Fab片段在體內或體外形成穩(wěn)定的雙分子聚合體，從而提高抗體片段的親和力。此法也可用于制備雙特異性抗體。 4基因工程抗體在真核細胞中的表達 噬菌體表達的抗體片段常常是在原核細胞(E.coli)中完成。原核系統(tǒng)表達抗體片段產(chǎn)量高，成本低，快速易于操作。但抗體片段在原核表達系統(tǒng)中不

30、能進行CH2糖基化，從而影響抗體的活性。因此重組抗體基因片段可轉移至適合的骨髓瘤細胞系或哺乳動物細胞系(如CHO)，甚至于植物細胞中表達，可以得到與淋巴細胞表達相同的抗體分子。免疫球蛋白IgA的重鏈和輕鏈及分泌片基因可以分別轉化不同的植株，將表達這些蛋白的植株進行有性雜交，在雜交后代中可以裝配成完整的IgA雙分子。以植物作為生物反應器進行抗體的表達已有許多成功的研究報道，與動物細胞相比更為經(jīng)濟，具有廣泛的應用前景。 四、催化性抗體的制備 1抗體催化的原理 1986年，由PGschultz和RALerner分別領導的兩個小組同時證明抗體具有催化活性。針對一個四面體帶電荷的磷酸酯半抗原產(chǎn)生的抗體，

31、能有選擇性地催化相應的碳酸脂和羧酸脂的水解反應。他們將這種有催化活性的抗體稱為催化性抗體(catalytic antibody)，又稱抗體酶(abozyme)。催化抗體的作用取決于底物分子水解時的轉換態(tài)(transition state)(圖75)。轉換態(tài)的分子結構是分子活化后的一種結構狀態(tài)，處于轉換態(tài)的分子具有最高的活化能，分子表現(xiàn)極性。處于這種狀態(tài)的分子也是最不穩(wěn)定的，能與這種分子結合的酶或者抗體會使某些化學鍵發(fā)生斷裂(如酯鍵，碳鍵，胺鍵等)起到酶解作用?？梢娍贵w酶的作用與天然的蛋白質酶非常相似?？贵w酶也表現(xiàn)出對底物的專一性，對立體結構的專一性。在飽和動力學與競爭性抑制方面都與常規(guī)酶相似。

32、所以抗體酶的發(fā)現(xiàn)打破了只有常規(guī)酶才有的分子識別和加速催化反應的傳統(tǒng)概念，為酶工程學開創(chuàng)了新的領域。 2抗體催化的化學反應 由抗體催化的化學反應特異性高于酶，但催化速率低于常規(guī)的酶，只有l(wèi)03106倍。但有一些未發(fā)現(xiàn)催化劑的反應，如DielsAlder反應也能被抗體催化。常規(guī)酶一般不能催化胺鍵水解，抗體酶能使胺鍵水解的速度增加25萬倍。訖今為止，已發(fā)現(xiàn)和證明的由抗體催化的化學反應不下40種。 3催化性抗體的制備 抗體酶是抗原決定簇處于轉換態(tài)結構的抗體。因為轉換態(tài)分子極不穩(wěn)定無法制備抗體，所以催化性抗體的獲得主要是通過設計穩(wěn)定的轉換態(tài)的類似物作為半抗原，與載體蛋白交聯(lián)后，免疫動物，獲得針對半抗原的

33、抗體，從中篩選具有催化活性的抗體。篩選催化性單克隆抗體所用的ELISA與篩選一般抗體的方法不完全一樣，應根據(jù)催化反應的特點而進行適當?shù)男薷?。?jīng)典的方法是先篩選出與底物或半抗原結合的抗體，然后從中再篩選出有催化活力的抗體，這種方法費時費力。利用催化性抗體對底物的催化活性，對底物進行適當修飾，使催化反應的產(chǎn)物可直接表現(xiàn)抗體的催化活性，這樣可以簡化檢測步驟。 轉換態(tài)類似物半抗原的設計，必須了解催化反應的轉換態(tài)模型的結構特點。催化抗體的抗原結合位點上與轉換態(tài)互補的某些催化基團的形成，能穩(wěn)定轉換態(tài)分子。此外有人把單克隆抗體分子用化學修飾方法引入一些活性基團，提高催化性抗體的催化與親和效率。應用噬菌體抗體

34、文庫也可以篩選催化性抗體，可省去制備轉換態(tài)類似物的復雜過程，直接用底物從文庫中篩選有催化活性的抗體片段。如用半抗原免疫后制備的文庫或文庫經(jīng)過多次混雜重組，則可以得到更高的親和力的催化性抗體?？躬毺匦涂贵w也用于催化性抗體的制備，用酶作為抗原免疫小鼠獲得能夠封閉酶活性位點的單克隆抗體，將這個抗體用蛋白酶除去Fc片段，用Fab免疫其他品系的小鼠或家兔，得到的抗體具有相應的酶催化活性。 從理論上看，B細胞具有全套免疫球蛋白的多樣性的胚系基因，當然也包括有催化作用的自身抗體在內。然而1989年Paul W.首次報道了人體的一種能催化蛋白質水解的免疫球蛋白。它是種自身抗體，能水解血管活性腸肽(vasoac

35、tive intenstinal peptide，VIP)的Glnl6Met17鍵。用VIP作為抗原能得到有催化作用的單克隆抗體，也能催化Glnl6Met17鍵。大約有17的人有這種自身抗體酶，但患有氣喘的病人中該抗體與VIP的親和力比健康人高50倍。由于VIP是一種氣管松弛劑，因此有人認為這種VIP自身抗體的長期作用可能與氣喘的過敏應答有一定關系。由此推測除了人工設計催化抗體以及發(fā)現(xiàn)的自身催化抗體外，用篩選單抗的方法，也有可能找到所需要的催化抗體。第二節(jié) 抗原抗體反應原理 抗體能特異性地識別相應的抗原，并與之結合。這種結合在體外也能發(fā)生，這種特性就是許多免疫檢測方法的基礎?？乖c抗體相互作用

36、是非共價的，可逆的，其特性符合許多化學反應的基本原理。但因為抗體分子的結構特點，以及抗原分子結構的多樣性，使抗原抗體結合反應表現(xiàn)出復雜性。 一、抗原抗體作用的熱力學與動力學 1溶液中抗原抗體的化學平衡 抗體與抗原的結合是非共價結合，二者在結構互補適應的基礎上通過范德華力(van der Waals force)、靜電引力、氫鍵和疏水作用等次級鍵相互作用。因為結合是可逆的，結合與解離的強度在定條件下取決于抗原與抗體的親和力。如果以S代表抗體結合位，即互補位(paratope)；以L代表抗原決定簇；以SL代表抗原與抗體的復合物，則抗原(Ag)與抗體(Ab)在溶液中的反應如下： K+ K+AgAb

37、AgAb 即SL SL K KKSL/SLK+/ K 抗原抗體結合形成的復合物的濃度為SL，游離的抗體結合位的濃度為S，抗原決定簇的濃度為L。在反應早期復合物形成很快，一定時間后逐漸慢下來，直至復合物的形成與解離達到平衡(圖76)。此時抗原抗體復合物的濃度SL與游離抗原表位的濃度S和游離抗體結合位的濃度L之比K是平衡常數(shù)，又稱為內在結合常數(shù)，或稱內在親和力(intrinsic affinity)。K+和K分別為結合和解離反應速度常數(shù)。 在恒定的條件下，如溫度、pH、離子強度等一定時，K是一個常數(shù)。改變抗原或抗體的濃度，復合物的濃度也相應改變以達到新的平衡，在一定范圍內如果S與L增加2倍，則SL

38、應該增加4倍，但實際上會少于4倍，因為AgAb復合物的濃度SL是抗原抗體的一部分。如果上述濃度都以摩爾濃度molL表示，則是K的單位為濃度的倒數(shù)(Lmol)。如抗體的K在1071012 Lmol為高親和力抗體，K低于107 Lmol為低親和力抗體。 如果以解離常數(shù)(K)描述抗體的親和力，比K更簡單方便，Kd為K的倒數(shù)，即Kd1/K，單位為mol/L。Kd值越大親和力越小，Kd越小親和力越大。 2抗原抗體反應的自由能變化 抗原抗體反應的自由能改變與K相關：F0RTln K，KeF/RT，這里R摩爾氣體常數(shù)8.31J(molK)；T絕對溫度；ln自然對數(shù)；e自然對數(shù)的底數(shù)；F0標準的自由能變化，規(guī)

39、定F01molS與1mol L形成1mol SL時自由能的變化。負號表示自由能為負的變化。 從上式可以估計：當抗原抗體結合親和力增加l0倍，則1n102303，37(3l015K)時的F05.94KJmol，溫度低于37時F0更小。這種自由能變化還不足單個氫鍵的能量(約1881KJmol的13。即使親和力非常高，K1010Lmol，F(xiàn)0只有594KJmol，僅相當于3個氫鍵的結合能。當抗原與抗體間形成氫鍵時，水的氫鍵被破壞，因此每個氫鍵的凈能接近于4.18KJmol。由此可見抗體與抗原結合時，吸力與斥力幾乎相等，即使在很高親和力下，也只有幾個千卡的微小差別。因而F的輕微增加會導致抗原抗體結合的

40、親和力增高，這就不難理解當抗原結構發(fā)生某些微小改變(如化學修飾)時，會引起抗原抗體的親和力的很大變化。自由能對K的影響取決于溫度，然而自由能本身也受溫度的影響： F 0H 0TS 0H 0 為焓變，S 0為熵變，T為絕對溫度。K隨溫度的變化如下: dlnK /dT=H 0 / RT2 或dlnK/d(1/T)= H 0 /R 當氫鍵和極性鍵形成時，較大的負焓變驅動放熱，親和力會隨溫度的增加而下降。因此抗原抗體相互作用在4比在25或37有更高的親和力，可見在給定的濃度下，最大眼度的結合在較低溫度下達到的。相反，非極性或者疏水的相互作用受到熵的影響，TS 0和H 0接近于零，所以這時溫度對親和力影

41、響較小。 3.抗原抗體反應的動力學 抗原抗體反應達到平衡時的參數(shù)測定在實際操作時是困堆的。反應完成90，只需幾分鐘或幾小時，而從90至99則需幾倍的時間，而欲達到999完成時所費時則更長，因為此時的Ag和Ab已減少到極低的水平。測定一些參數(shù)在反應的早期或者未到平衡時是可行的，利用動力學可以計算出抗原抗體反應的特征性參數(shù)，用以描述抗原抗體反應的規(guī)律： K+ Ag（S）Ab(L) AgAb （SL） K 結合反應速度KSLM-1S-1 解離反應速度=K-SLS-1達到平衡時，則K+SLK-SL KK+K- KK+K-表明相同親和力的抗體，其結合速度常數(shù)和解高速率常數(shù)并不一致。如果K+和K-均很大則

42、抗原抗體復合物形成很快，但不穩(wěn)定；而K+和K-均小時抗原抗體復合物形成較慢，但很穩(wěn)定。前者適合于親和層析，后者適合于標記分析。 抗原抗體結合成復合物后解離的速度常數(shù)(K-)取決于結合鍵的強度。已知抗體的親和力和結合速度常數(shù)K+，根據(jù)動力學基本公式KK+K-可以計算解離常速度數(shù)K-。例如抗葡萄球菌核酸酶的抗體對酶蛋白抗原的親和力是8.3l08Lmol，結合速度常數(shù)K+41l05 L(mols)，比對半抗原的結合常數(shù)低。由公式KK+K-計算得到K-4.910-4 L(mols)。然后根據(jù)公式t1/21n2K-，計算半解離期(halftime for dissociation)，得到該抗體與抗原復合

43、物的半解離期為23min。了解抗原抗體復合物的半解離期便可知道結合物在多大的時間范圍內稀釋而不影響結合物的解離，這對在免疫親和層析等許多其他免疫方法的應用中有重要意義。 抗原抗體反應的速度在很大程度上取決于抗原分子和抗體分子的擴散速率及碰撞的機率。擴散速度常數(shù)用下式表示： Kdl4D(61020) 為抗原和抗體分子半經(jīng)之和(單位為cm)；D為反應系統(tǒng)中抗原和抗體分子的擴散常數(shù)之和(單位為cm2s)；61020為轉換函數(shù)，為了把單位轉換為L(mols)。例如10-6cm，D107cm2s，Kdl=7.5108L(mols)。通常大的蛋白抗原比半抗原與抗體結合的速率要慢，大部分蛋白質的結合速度在1

44、05106L(mols)，而理論上限為109 L(mols)。 二、抗體與單價抗原的作用 1抗體親和力的測定 抗體親和力的測定的方法常采用作圖法。抗原抗體反應最簡單的情況是單克隆抗體與單價抗原的反應，如半抗原與單克隆抗體或單克隆抗體與大分子抗原上單一的非重復的位點(抗原決定簇)的作用。以最簡單的單克隆抗體與半抗原反應為例的作圖法，首先用平衡透析(equilibrium dialysis)(圖77A)來測定系列游離抗原及結合抗原的濃度。根據(jù)不向抗原濃度進行平衡透析所獲得的結合抗原，游離抗原?？贵w濃度是已知的。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，進行Scatchard分析，即可計算出Ka的值(圖77B)。 Scatch

45、art分析方法是將KaSL/SL分子和分母都除以抗體的濃度，SL/Ah=r,r代表每個抗體分子結合的抗原(單價)分子數(shù)SL/Ab=S/Ab.L(nr)C，S/Ab;表示每個抗體分子上未被抗原占有的游離抗體結合位的濃度。這濃度實際上是抗體分子上等于全部抗體結合位(n)減去以被抗原占據(jù)了的結合位數(shù)。因為用的是單價抗原，因此也就是減去結合的抗原分子數(shù)r，即(nr)。這里的n實際上代表抗體的價數(shù)。C在這里代表抗原的濃度L。由此得到公式： 當固定抗體的濃度用不同濃度的抗原進行一系列的平衡透析實驗，得到一系列相應的r數(shù)據(jù)，然后根據(jù)以r/C對r作圖。如果所用抗體是均質的（單克隆抗體），r/C與r的關系為線性

46、關系，它的斜率即為親和力Ka（圖77B）。從公式可見，當抗原的濃度很大的r/C0，所以Ka（nr）0或Kan=Kar,由圖77B可見橫坐標r的截距就等于抗體價n。2親和力的異質性 當與單價抗原結合的抗體是多克隆抗體時，其Scatchard圖呈非線性關系(圖77B)。由于多克隆抗體來源于多個細胞克隆，其內在親和力不同。內在親和力的平均值Ko常用于表示異質的多克隆抗體的親和力，Ko為抗體結合位點12被占據(jù)時的游離抗原濃度。 3抗體結合抗原的特異性半抗原反應抗體與單價半抗原反應的特異性極強，半抗原上化學基團的細小差別或位置的改變，則與抗體的反應性會表現(xiàn)明顯的差別(圖78)?？贵w與同源抗原(homol

47、ogous antigen)反應最強，與異源抗原(heterologous antigen)反應相對較弱。有些抗體與異源抗原的反應比同源強，稱為變態(tài)抗體(heteroclitic antibody)。抗原分子表面或末端的一些突出的基團，具有免疫優(yōu)勢，是抗原決定簇的主要結構，影響決定簇的特異性?？贵w的抗原結合部位是疏水的，微溶于水的三硝基苯半抗原與相應抗體形成親和力很高的復合物，而水溶性很高的糖類、有機離子(如苯甲酸鹽)只能與抗體結合形成低親和力的復合物。 三、抗體與大分子多價抗原的反應 1多抗原決定簇大分子抗原的特征 能與一個抗體結合的大分子抗原的特異性部分稱為抗原決定簇(antigen de

48、terminants)。一個大分子抗原常常有多個抗原決定簇而成為多價抗原?？乖瓫Q定簇的序列結構已清楚的稱為抗原表位(epitope)。半抗原相當于一個抗原決定簇。大分子抗原上含有多個抗原決定簇能與相應的特異抗體結合。在一些情況下，決定簇之間相距較遠的各自與抗體結合而互不影響，這種決定簇是不重疊的決定簇。當一個抗體與某一決定簇結合后，在空間上干擾了其他抗體與相應決定簇的結合，這些靠得較近的決定簇稱為重疊決定簇。在少數(shù)情況下，前一抗體的結合導致抗原結構的空間變化，影響了另外抗體的結合，稱為變構效應(allosteric effect)。 許多大分子如蛋白質、核酸、復合多糖常常形成重復結構，因而每個

49、分子內有多個相同的抗原決定簇。顆粒性抗原細胞、細菌及病毒等還可形成多亞基聚合物，也可產(chǎn)生重復的抗原決定簇，成為多價的(multivalent)抗原。單抗原決定簇的分子即半抗原可吸附在固相載體上，其結構也類似多價抗原，如ELISA中的包被抗原，其結合特性和溶液中單價抗原有所不同。 2抗原抗體的親和力和親合力 單價抗原與抗體反應取決于親和力(affinity)的大小，而天然多價抗原與小分子半抗原不同，含有1個以上的抗原決定簇，因此能與1個以上的抗體結合。如果沒有空間限制，對重復的多價抗原分子，一個IgG或IgE分子有兩個結合位點，而個IgM有10個結合位點。對任何一個位點的親和力是不變的，總的結合

50、強度包括抗體上所有的結合位的親和力，抗體對抗原分子總的結合強度，稱為親合力(avidity)。親合力大大強于每一位點的親和力，其強度增加不僅僅是親和力的簡單相加，而是呈幾何級數(shù)上升的。因此，一個低親和力的IgM分子，或者多個低親和力的IgG分子對一個多價抗原的結合是相當緊密的。 3抗體與多價抗原結合的濃度帶現(xiàn)象 抗體與單價抗原形成的復合物都是可溶性的，但抗體與多價抗原形成的復合物大多數(shù)能形成沉淀。沉淀反應可用于研究抗體與大分子抗原結合的特性。用非蛋白大分子(如多糖)抗原與相應抗體形成的沉淀，其中只有抗體是蛋白質，為抗體的定量測定提供了方便。在一定量的抗體中，逐漸增加抗原濃度，沉淀的形成與抗原抗

51、體的比例密切相關。圖79是典型的單特異性沉淀曲線。沉淀反應的曲線分為3個區(qū)：抗體過量區(qū)，抗原與抗體形成小分子復合物，不形成沉淀或沉淀很少，稱為前帶(prozone)現(xiàn)象；抗原過量區(qū)，雖然沒有游離的抗體，但沉淀仍很少，稱為后帶(postzone)現(xiàn)象；在抗原抗體等帶區(qū)(equizone)形成大量沉淀，也沒有游離的抗原和抗體存在。如果抗原是多抗原決定簇的多價抗原如細菌、細胞、乳膠顆粒等表面，則形成凝集反應。 抗原抗體相遇時，不管二者比例如何，很快發(fā)生特異性結合，一般在幾秒鐘內完成，稱為初級反應階段。初級反應沒有可見的沉淀。從特異性結合到可見沉淀形成稱為次級反應階段。這階段通常需要更長的時間，從幾分

52、鐘到幾小時甚至幾天，才能看見沉淀。次級反應除受抗原抗體濃度比例影響外，pH值、離子強度和補體的存在也影響沉淀的形成。 抗原抗體形成沉淀的機理，用Marrack等人提出的網(wǎng)格理論可得到合理的解釋。抗原抗體的結合包括許多抗原與許多抗體相互連接形成網(wǎng)格。當這些聚合物達到一定大小時，便從溶液中沉淀出來。抗體分子大多為二價(1gG)，而大分子抗原一般是多價的，一個抗體可以與兩個抗原上相同的決定簇結合，一個抗原分子也能與多個抗體分子結合，從而形成相互交聯(lián)的網(wǎng)格發(fā)生沉淀。而抗原或抗體過量時，不能形成網(wǎng)格，故不發(fā)生沉淀。反應系統(tǒng)中存在多種抗原抗體反應稱為多特異性系統(tǒng)，它與單特異性反應不同，在沉淀最多時懸液中仍

53、有過量的抗原或抗體，這是因為一個獨立的反應中，過量抗原會與另個獨立的反應的過量抗體重疊的結果。此外，在一些反應系統(tǒng)中，即使抗原抗體比例合適，也不形成可見的沉淀、這是因為抗體的親和力很低，或者抗體的雙價結合位點只結合一個大分子抗原，稱為單配雙價結合(monogamous bivalent binding)，或者抗體的雙價結合位結合了同一個抗原分子的重復的決定簇。在上述這些情況下無法形成網(wǎng)格結構，這類抗體稱為不完全抗體(incomplete antibody)。 4交叉反應 大分子抗原常常含有多個抗原決定簇，部分抗原決定簇與另一大分子上的抗原決定簇相同，當用此類抗原免疫后所獲得的抗體既可以與同源抗

54、原結合，又能與異源抗原結合。抗體與同源抗原的親和力通常比異源抗原要高得多，所以反應較強。少數(shù)交叉反應用低親和力的抗體比用高親和力抗體更能顯示出來，如抗多糖抗體一般親和力較低，易表現(xiàn)交叉反應。低親和力抗體往往是因為其抗原結合位特異性低，易與結構類似的抗原反應。用免疫沉淀尤其是凝膠雙擴散方法能非常容易地鑒定交叉反應，并且根據(jù)沉淀線形成的類型判斷幾種抗原間的交叉反應關系。第三節(jié) 常見免疫分析方法免疫分析方法是利用抗原與抗體特異性反應的特性對抗原或抗體進行量或質的測定分析。這類分析方法具有特異、靈敏和快速的特點，有的可以表現(xiàn)出一個氨基酸分子的差異，如用單克隆抗體進行檢測的方法；測定的量可以達到g甚至n

55、g的水平，如ELISA法，放射免疫法等；反應在幾小時，幾分鐘甚至更短的時間可以看到測定的結果，如免疫沉淀法等。這類免疫分析的方法可以用于醫(yī)學，免疫學中抗原抗體的分析(包括病原的診斷，免疫細胞表面分子的檢測等)，而且可以廣泛的用于生命科學的幾乎各個領域，甚至于食品科學，環(huán)境科學及分析化學等更為廣泛的學科領域。 一、免疫沉淀 1溶液中的沉淀反應 在體外當抗體與相應抗原二者濃度比例適當時，會發(fā)生免疫沉淀(immunoprecipitation)反應，表明兩者之間有特異性反應。免疫沉淀反應廣泛用于抗原或抗體的定性及定量分析。在液相中形成的沉淀不易觀察判斷，利用抗原和抗體溶液之間的界面形成的沉淀線便于判斷，即環(huán)狀沉淀試驗(ring precipitant test)(圖7l0)。沉淀試驗可以在玻璃管中進行，將小試管或毛管的底部加入抗原溶液，在上層輕輕鋪上不同稀釋倍數(shù)的抗體溶液，勿使界面破壞，為了使界面更好地形成，常在下層抗原溶液中加入10的蔗糖或甘油?？乖贵w溶液置于37或4孵育后，在界面上形成白色沉淀線。玻片上沉淀的形成必須在顯微鏡下觀察。2凝膠擴散沉淀 抗原抗體可在半透明的半固相介質中進行沉淀實驗?？乖肿雍涂贵w分子在凝膠介質中自由擴散形成濃度梯度，抗原與抗體在比例合適的一定擴