柱前衍生化 - 高效液相色譜法跟蹤檢測酶法制備 - D - 谷氨酰 - L - 色氨酸反應過程-

1、柱前衍生化2高效液相色譜法跟蹤檢測酶法制備C 2D 2谷氨酰2L 2色氨酸反應過程屠春燕*吳燕嬌 袁艷娟 姚忠 唐美華 韋萍(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院,南京210009摘 要 C 2D 2谷氨酰2L 2色氨酸(SCV 207是一種新型廣譜免疫調(diào)節(jié)類化合物。針對酶法合成SCV 207反應體系的特點,以鄰硝基苯磺酰氯為柱前衍生試劑,RP 2HPLC 為分離模式,選用L i chrosphe r C 18柱,20mmol/L 磷酸鹽溶液(p H 3.0和乙腈為流動相,梯度洗脫,檢測波長230n m,建立了同時分析測定多種氨基酸和小肽的方法,所有組分于15m i n 內(nèi)洗脫完畢。氨基酸及二肽在0

2、.96260L m ol/L 范圍內(nèi)線性良好,相關系數(shù)大于019991;加標回收率在97.8%101.6%之間;相對標準偏差為1.2%2.9%。本方法適用于SCV 207產(chǎn)品的純度分析,以及酶法轉肽制備SCV 207反應過程跟蹤檢測,具有分析速度快,準確度高、操作簡單等優(yōu)點。關鍵詞 色氨酸,鄰硝基苯磺酰氯,衍生化,反相高效液相色譜 200202219收稿;2009205213接受*E 2m ai:l tcy7341126.co m 1 引 言C 2D 2谷氨酰2L 2色氨酸(C 2D 2G l u ta myl 2L 2tryptophan ,S CV 207是一種新型廣譜免疫調(diào)節(jié)類化合物,作

3、用類似胸腺素A 1,在老鼠體內(nèi)進行的實驗已證實了它對抗肺結核病的生物活性1。Suz uk i 等2在2004年最早建立了酶法合成SC V 207技術,近年來國內(nèi)也有相關的報道3,4。該方法是利用C 2谷氨酰轉肽酶(C 2G luta mylt ranspepti d ase ,C 2GT ,E .C .2.3.2.2的C 2谷氨酰基化反應制備小肽,但在反應中當以L 2谷氨酰胺(L 2G luta m i n e ,L 2G ln為谷氨酰供體時,存在一定程度的自轉肽反應5,同時,C 2GT 還可以S CV 207為谷氨酰供體,并生成相應的氨基酸,且這一水解過程是不可逆的2,3,這導致轉肽反應過程

4、中目的產(chǎn)物SC V 207轉化率降低,同時也使酶法制備SCV 207的反應體系復雜化。因此建立快速、可行的分析方法監(jiān)控反應進程以獲得高收率、高純度的谷色二肽極為重要。柱前衍生高效液相色譜法是小肽或氨基酸分析的主要方法,方法的關鍵在于衍生劑的選擇。目前,常用的衍生劑主要有鄰苯二甲醛6、氯甲酸芴甲酯8、丹酰氯9及二硝基氟苯10等,這些方法均存在一定的缺陷11,且所建立的方法大多側重于分析產(chǎn)品,用于同時監(jiān)測酶反應體系中的氨基酸和小肽的方法尚未見報道。本研究采用鄰硝基苯磺酰氯為柱前衍生試劑,以酶法制備SCV 207的反應體系為分析對象,建立一種用于跟蹤檢測反應過程的分析方法,以求推廣到其它同類反應過程

5、的檢測分析。2 實驗部分2.1 儀器與試劑Beckman 126/166型高效液相色譜儀(美國Beckman 2Coulter 公司。鄰硝基苯磺酰氯(江蘇中意化工技術開發(fā)研究所提供;C 2GT(南京工業(yè)大學材料化學工程國家重點實驗室提供;S CV 207(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院小肽合成室自制,純度>99.9%;D 2谷氨酰胺(D 2G luta m ine ,D 2G ln、L 2色氨酸(L 2T r yptophan ,L 2Trp、L 2谷氨酸(L 2gl u ta m ic ac i d ,L 2G l u ,上海國藥集團;乙腈(色譜純,M er ker 公司;其它試劑均為

6、國產(chǎn)分析純。2 實驗方法2.2.1 標準品衍生化方法12準確稱取各標準品,用0.1mol/L HC l 溶解,配制成儲備液(D 2G ln 及L 2G l u 的濃度約為3mmol/L ,SC V 207及L 2Trp 的濃度約為1mmol/L。移取50L L 混合儲備液置于2mL 的具塞磨口試管內(nèi),依次加入硼酸緩沖液(0.05mmol/L ,p H 9.01mL ,鄰硝基苯磺酰氯的乙醇溶液第37卷2009年10月 分析化學(FENXI HUAX UE 研究簡報Ch i nese Journa l of Ana l yti ca l Chem istry 第10期15281530(40mmol

7、/L80L L ,混勻,塞緊后于30e 水浴中衍生反應30m i n 后,以8000r/m i n 離心10m i n ,待用。2.2.2 樣品衍生化方法 終止反應后的酶反應液高速離心,取上清液,適當稀釋,按2.2.1方法衍生處理。2.2.3 色譜條件 Lichrospher C 18柱(250mm 4.6mm,5L m ;流動相A 為20mmol/L 磷酸鹽溶液(p H3.0,流動相B 為乙腈;洗脫梯度:25%B 0y 13m in 95%B ;流速:1mL /m in ;進樣量:20L L ;檢測波長選擇在二肽及氨基酸衍生產(chǎn)物的最大吸收230n m 處;室溫。3 結果與討論3.1 緩沖鹽種

8、類及p H 值的選擇實驗對醋酸緩沖鹽2乙腈體系、磷酸緩沖鹽2乙腈體系進行考察,最后確定以磷酸緩沖鹽2乙腈作為流動相。其中緩沖鹽的p H 對分離的影響較大,pH U 5時,谷氨酸保留較短,與衍生試劑水解產(chǎn)物分離度不佳;當緩沖鹽pH U 3.0 時,谷氨酸保留時間增大且各組分均達到基線分離(圖1。圖1 標準品(a和酶反應液(b色譜圖F ig .1 Chro m ato gra m of standard sa m ple(aand reacti on sol u tion(b1.G l uta m i ne(G l n ;2.G l u ta m ic aci d(G l u;3.C 2D 2G

9、l uta m yl 2L 2tryp t ophan(SC V 207;4.L 2Tryptophan(T rp.3.2 衍生方法重復性考察本實驗考察了鄰硝基苯磺酰氯與氨基酸及小肽的衍生化反應的穩(wěn)定性。取6份相同的氨基酸和小肽的混合標準溶液,按2.2.1和2.2.3方法衍生并測定,D 2G l n ,L 2G lu ,SC V 207和L 2Trp 的衍生產(chǎn)物響應峰面積的RSD 分別為3.0%,2.5%,3.8%和4.1%,說明此衍生方法重復性良好。將混合樣品衍生反應液在室溫下保存2d 后測定。結果顯示,各衍生產(chǎn)物的峰形、峰面積、保留時間等無明顯差異,各組分衍生產(chǎn)物測定結果的RSD 均<

10、;2%,表明此衍生產(chǎn)物具有良好的穩(wěn)定性。3.3 標準曲線、準確度、精密度及檢出限配制系列標準溶液,按2.2.1和2.2.3方法衍生并測定,回歸方程及檢出限(S /N =3B 1見表1。表1 回歸方程、相關系數(shù)、檢出限、回收率及精密度Table 1 Li near regressio n equati on ,corre l a ti on coe fficient ,de tecti on li m it ,recovery and prec i sio n成分Compon ent線性范圍L i n ear range (L m ol/L回歸方程Regress i on equati on 相

11、關系數(shù)Correlati on coeffici en t 檢出限Detection li m it (f m ol/L平均回收率A verage recovery (%RS D (%,n =6谷氨酰胺Gln2.8260y =0.095x +0.19120.999114.7101.21.2谷氨酸Glu2.8260y =0.0547x +0.02590.999432.1101.62.9二肽S CV 2071.095y =0.3988x +0.77480.99923.598.22.7色氨酸Trp 0.9688y =0.4655x -0.3880.99913.797.82.6在已知成分的酶反應液中分

12、別加入高、中、低3種不同濃度的氨基酸及二肽標準混合液,混勻,衍生化后進樣分析,考察分析方法的回收率和相對標準偏差(表1。結果表明,回收率在97.8%101.6%范圍內(nèi),相對標準偏差為1.2%2.9%。3.5 酶法制備SCV 207的反應過程分析稱取適量L 2Trp 和D 2G l n 溶于p H 10.0的緩沖液,混勻;加入適量酶液,40e 下反應3,按一定時間間隔取適量反應液,加等體積三氯乙酸(10%,V/V 終止反應,按2.2.2方法進行處理,HPLC 分析各組分濃度,以考察在酶轉化過程中底物和產(chǎn)物的變化趨勢,確定最適反應條件。1529第10期屠春燕等:柱前衍生化2高效液相色譜法跟蹤檢測酶

13、法制備C 2D 2谷氨酰2L 2色氨酸反應過程1530分析化學第37卷從圖2可以看出,隨著反應的進行,底物產(chǎn)物L2Trp和D2G ln濃度下降,產(chǎn)物SC V207與G l u的濃度逐漸升高,結果表明:C2GT不僅通過其轉肽活性生成了二肽,同時在反應過程中存在C2GT對產(chǎn)物SCV207的水解作用,這為深入了解此類反應的作用機理,有效控制反應進程提供了有益的借鑒。圖2酶法合成SC V207的進程曲線F i g.2Co nversi on process of SCV207by enzy m atic sy n2thesis procedureR efer ences1A lexander A K,

14、Andrey S S,Sergey V K.USP,5744452,19992Suzuk iH,K ato K,Ku m aga iH.Journa l o f B iotechnology,2004,111(3:2912953W ang Q ian(汪前,Yao Zhong(姚忠,Xun Zh i2Ji n(荀志金,Xu X i ao2Y i ng(徐曉瀅,Xu H ong(徐虹,W e i P i ng (韋萍.J o urna l of Che m ica l Eng i neering o f Ch i nes e Un i versities(高校化學工程學報,2008,22(2:2

15、882934W ang Q ian(汪前,Yao Zhong(姚忠,W uM i ng2Gang(吳明剛,Xun Zhi2J i n(荀志金,Zhou Zh i(周治,Xu H ong (徐虹,W e i P i ng(韋萍.J o urna l of Che m ica l Indu stry a nd Engineering(化工學報,2008,59(2:4314365Ke ill or JW,Castonguay R,Lherbet C,H el m ut S,Lester P.M etho ds i n Enzy m olo gy,2005,401:4494676Pere ira V,

16、Pontes M,Ca m ara J S,M arques J C.J.Chro ma togr.A,2008,1189(122:4354437L ez2Cervantes J,S chez2M achado D I,R osas2Rodr uez J A.J.Chro m a to gr.A,2006,1105(122:1061108Qu Q S,Tang X Q,W ang C Y,Yang G J,H u X Y,Lu X,L iY,L i S C,Yan C.Ana l.Ch i m.Acta,2006,572(2: 2122189M araschie llo C,M i randa

17、 E,M ill n E,F l or i ano P,V ilageli u J.J.Chro ma t ogr.B,2003,791:11110Yu H o ng(于泓,M u Sh i2Feng(牟世芬.Chinese J.Ana l.Che m.(分析化學,2005,33(3:39840411Tu Chun2Yan(屠春燕,Zhao Jun(趙珺,Ge Jia2Lu(葛佳璐,W u Yan2Jiao(吳燕嬌,TangM e i2H ua(唐美華,L i Shou2Chun(李壽椿.J o urna l o f Instru m enta l Ana l ysis(分析測試學報,2008

18、,27(7:681685Ana lysis of C2D2G l u tam yl2L2tryp tophan i n Enzy m a tic Syn thesis P rocedure by H igh P erform ance L i qu i d Ch ro m atography TU Chun2Yan*,WU Y an2Jiao,YUA N Y an2Juan,YAO Zhong,TANG M e i2Hua,WE I P i n (Institute o f B iotechnolo gy and P ha r m aceutica l Engineer i ng,N anji

19、ng Un i versit y o f Technolo gy,N anjing210009Abstr act C2D2G l u ta myl2L2tryptophan(S CV207is a pr ospecti v e med ici n e f or the treat m ent of tubercu l o2 sis.The RP2H PLC method was used to analyz e the practica l syste m of S CV207by enzy matic synthesi s f ro m D2gl u ta m ine and L2tr yptophan.Under the opti m al conditi o ns,the chro matograph i c conditi o ns were as f oll o ws: L i c hrospher C18column(250mm4.6mm,5L mwas used,the detection wavelength was230nm.F l o w rate was110mL/m in;mobile phase A was20mmol/L sodi u m dihydrogen phosphate(p H3.0,mobile phase B