氧反常心肌細胞內(nèi)游離鈣濃度的變化及丹參素和SOD的影響

1、    氧反常心肌細胞內(nèi)游離鈣濃度的變化 及丹參素和SOD的影響        摘要目的：觀察心肌細胞氧反常時細胞內(nèi)的游離鈣濃度的變化，探討丹參素和SOD對細胞內(nèi)的游離鈣濃度的影響。方法： 體外分離成年大鼠心肌細胞復(fù)制氧反常模型，缺氧40 min后給氧20 min，用鈣熒光探針（Fluo-3）分別測定了正常大鼠心肌細胞(Control,n=11)、缺氧40min(H40 min,n=11)以及缺氧40 min再給氧20 min(H40 min R 20min,n=1

2、2)的大鼠心肌細胞內(nèi)的游離鈣濃度，并觀察了丹參素(H40minR20min+DS,n=10)和SOD(H40minR20min+SOD,n=11)對氧反常的心肌細胞內(nèi)的游離鈣濃度的影響，并用顯微鏡觀察了細胞桿形率的改變。結(jié)果：氧反常組的細胞內(nèi)的游離鈣濃度（596.71±20.29 nmol/L）明顯比正常對照和單純?nèi)毖?0 min的高（158.67±5.01和328.51±13.86 nmol/L，P0.01）。加入丹參素和SOD，可明顯降低氧反常細胞內(nèi)的游離鈣的濃度（分別為254.29±8.83和300.04±13.04 nmol/L，P0.

3、01）。細胞桿形率亦有類似的改變。結(jié)論：氧反常時心肌細胞發(fā)生明顯的鈣超載，丹參素和SOD對細胞內(nèi)鈣超載具有一定的防治作用。主題詞心肌；氧；鈣；丹參；超氧化物歧化酶 Effects of Salvia Miltiorrhizae and SOD on Ca2+-overloadedrat myocardial cells in oxygen paradoxZHU Fu-Xiang,LIU Guo-Mei,YANG Zhi-Hong,WANG Xiao-Ming,MA Li-Ying Institute of Radiation Medicine,Beijing(100850)AbstractAI

4、M:To observe the changes of intracellular free calcium concentration in oxygen-paradoxed rat myocardial cells and to discuss the protective effects of Salvia Miltiorrhizae (DS) and SOD on Ca2+-overloaded rat myocardial cells.METHODS: Adult rat myocardial cells was isolated in vitro and oxygen parado

5、x model was made.Selecting 40 min as hypoxia period followed by 20 min of reoxygenation,a new calcium fluoresence probe (Fluo-3) was used to detect the intracellular free calcium concentration in control (n=11)、H40min (hypoxia,n =11) and H40minR20min (hypoxia+reperfusion,n=12) groups respectively.We

6、 also looked into the rod-shaped rates of myocardial cells with microscope.In addition,the effect of Salvia Miltiorrhizae (n=10) and SOD (n=11) on intracellular free calcium concentration and rod-shaped rate of oxygen-paradoxed myocardial cells were observed.RESULTS: The intracellular free calcium c

7、oncentration of H40minR20min group increased far beyond the control and H40min groups (596.71±20.29 nmol/L vs 158.67±5.01 and 328.51±13.86 nmol/L,P0.01),showing a significant Ca2+-overload.The changes of rod-shaped rates were similar to intracellular free calcium concentration.Salvia

8、Miltiorrhizae and SOD can inhibit Ca2+-overload obviously (254.29±8.83 and 300.04±13.04 nmol/L vs H40minR20min 596.71±20.29 nmol/L,P0.01).Moreover,effect of Salvia Miltiorrhizae was more striking than SOD (P0.01).CONCLUSION:There is a significant Ca2+-overload in oxygen-paradoxed myoc

9、ardial cells.Salvia miltiorrhizae and SOD have a definite protective effect on Ca2+-overload.MeSHMyocardium; Oxygen; Calcium; Salvia Miltiorrhizae; Superoxide dismutase自70年代初Jenning發(fā)現(xiàn)“心肌缺血再灌注損傷”與心肌細胞鈣濃度大量增加可能有關(guān)以來，大量的研究都支持這一觀點。目前認為“鈣超載”是再灌注損傷的一個主要因素，細胞內(nèi)鈣超載是心肌缺血再灌注損傷的重要病理改變之一，被認為是細胞死亡的最后共同通路1。從這個理論出發(fā)，

10、研究再灌注損傷時細胞內(nèi)游離鈣的改變并探討如何防止鈣超載，對于進一步闡明再灌注損傷的機理和保護再灌注損傷的心肌都具有重要的實際意義。本文用體外分離的大鼠心肌細胞復(fù)制氧反常模型以模擬再灌注損傷，用鈣熒光探針（Fluo-3）測定細胞內(nèi)游離鈣濃度的改變，并觀察丹參素和SOD對氧反常的心肌細胞內(nèi)游離鈣濃度的影響。材料與方法(一) 材料：1灌流液成份與濃度：A液（mmol/L）：NaCl 143.0,KCl 8.0,MgCl2 5.0,CaCl2 1.8,Glucose 5.0,NaH2PO4 0.42,HEPES 5.0,pH 7.4；B液：不含CaCl2，其他同A液；C液：B液加0.1%膠原酶和50.

11、0 mmol/L CaCl2；D液（mmol/L）：NaCl 118.0,KCl 30.0,MgCl2 0.5,KH2PO4 10.0,Glucose 10.0,谷氨酸 70.0，EGTA 0.5,BSA 2%,HEPES 10.0,pH 7.4；E液：D液中加10.0 mmol/L CaCl2。2試劑：I型膠原酶（Sigma公司）；A23187（NAKARAI chemical Ltd）；Fluo-3/AM（Dojin，KYOTO JAPAN）；HEPES（分析純，華美公司）；丹參素（上海第一醫(yī)科大學(xué)藥理教研室制備）；SOD（哈醫(yī)大生化教研室研制，系純化的小牛紅細胞Cu-Zn-SOD；其它試

12、劑均為國產(chǎn)分析純。3儀器：熒光分光光度計（RF-540型，日本島津公司）；顯微鏡（Olympus公司）。(二) 大鼠心肌細胞的分離與實驗分組：健康雄性Wistar大鼠，體重200250 g。按Farmer的方法2加以改進，體外分離心肌細胞，具體操作如下：按45 mg/kg腹腔注射0.6%戊巴比妥鈉麻醉動物，同時注射0.2%肝素20 mg/kg抗凝，開胸，距主動脈根部34 mm剪斷主動脈取出心臟，迅速移至非循環(huán)無作功的Langendorff灌流裝置。用95%O2 5%CO2混合氣體飽和的A液灌注15 min（灌流壓為90 cmH2O）后，旋即用B液灌注5 min，使心臟停搏；用C液通過電子蠕動泵

13、恒流循環(huán)灌注1 h，最后用D液非循環(huán)灌注5 min；剪下心室肌于適量的D液中，用眼科剪充分剪碎并反復(fù)吹打以分散心肌細胞，尼龍網(wǎng)濾過后，上清用D液洗3次，離心收集心肌細胞，懸浮于E液，調(diào)節(jié)細胞濃度為6×105/2mL。實驗分組如下：（1）正常對照組（持續(xù)通以95%O2 5%CO2，37°C溫育40 min，n=11）；（2）缺氧40 min組（H40 min，持續(xù)通以95%N2 5%CO2，37°C溫育40 min，n=11）；（3）氧反常組（H40 min R20 min， 缺氧40 min后給氧20 min，n=12）；（4）丹參素保護組（H40 min R20

14、 min+DS，氧反常+丹參素，終濃度為40 mg/L，n=10）；（5） SOD保護組（H40 min R20 min+SOD，氧反常+SOD，終濃度為3.7×105 IU/L，n=11）。(三) 細胞內(nèi)游離鈣的測定：用鈣熒光探針Fluo-3/AM，測定方法按文獻4進行。(四) 細胞桿形率的計算：各組細胞取1滴用0.4%胎盤藍染色，光鏡下計數(shù)200個細胞，計算拒染的桿形細胞所占的比率。(五) 統(tǒng)計處理：實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，組間差異顯著性用t檢驗判定。結(jié)果(一) 心肌細胞分離結(jié)果：本實驗所分離的心肌細胞胎盤藍染色桿形率達94.00%±2.50%。(二) 細胞內(nèi)游

15、離鈣濃度的變化：正常心肌細胞內(nèi)游離鈣濃度為(158.67±5.01) nmol/L,缺氧處理后游離鈣濃度明顯升高，P0.01；再給氧（氧反常）后，游離鈣濃度更行升高，與單純?nèi)毖踅M相比，P0.01；加丹參素和SOD處理，游離鈣濃度與氧反常組相比，明顯回落，P0.01，而且丹參素的效果更明顯，與SOD比，P0.01。結(jié)果如表1。表1 丹參素和SOD對細胞內(nèi)游離鈣濃度的影響Tab 1 Effect of DS and SOD on intracellular free Ca2+ concentration (±s)GroupnCa2+i (nmol/L)ControlH40min

16、H40minR20minH40minR20min+DSH40minR20min+SOD1111121011158.67±5.01328.51±13.86*596.71±20.29*254.29±8.83#300.04±13.04#*P0.01,vscontrol；*P0.01,vs H40min；# P0.01,vs H40minR20min，()P0.01,vs H40minR20min+SODH=hypoxia; R=reperfusion (三) 細胞桿形率的改變：缺氧組的心肌細胞的桿形率明顯低于正常對照組（94.14%±3.2

17、5%，P0.01）；氧反常組的的桿形率更低，與缺氧組比，P0.01；丹參素組和SOD組的桿形率明顯高于氧反常組，P0.01，而以丹參素組更明顯，與SOD組相比，P0.01。結(jié)果見表2。表2丹參素和SOD對心肌細胞桿形的影響Tab 2Effect of DS and SOD on rod-shaped rate ofcardiomyocytes(±s)GroupnRod-shaped rate (%)ControlH40minH40minR20minH40minR20min+DSH40minR20min+SOD111112101194.14±3.2548.30±1.

18、93*26.31±3.32*64.25±3.17#51.60±2.10#*P0.01,vs control;* P0.01,vs H40min；# P0.01,vs H40minR20min; ()P0.01,vs H40minR20min +SOD 討論鈣離子參與人體許多細胞正常生理活動，包括細胞增殖、信息傳遞、心肌興奮-收縮耦聯(lián)、神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)、細胞分泌、形態(tài)發(fā)生以及細胞老化等諸多方面。所有這些功能的發(fā)揮都有賴于鈣離子在細胞內(nèi)外相差10 000倍的分布，而這種分布是能量依賴性的。心肌再灌注損傷是一種重要的病理生理現(xiàn)象，其發(fā)生與這種鈣離子細胞內(nèi)外正常分布的破壞亦

19、即細胞內(nèi)鈣超載有密切的關(guān)系。我們實驗室曾用焦銻酸鉀作為鈣離子的指示劑證明再灌注損傷的心肌細胞內(nèi)有大量的鈣鹽沉著,尤以缺血40min再灌最為明顯3。通過細胞內(nèi)游離鈣的測定亦得到類似的結(jié)果（另文報道）。如何防止鈣超載從而保護再灌注心肌的功能，除了盡早進行再灌注或預(yù)處置（preconditioning）以增加心肌對缺血再灌注損傷的耐受性以外，需要采用適當(dāng)?shù)谋Ｗo劑，這也是缺血再灌注損傷研究的重要課題之一。本文用體外分離的大鼠心肌細胞氧反常模型，以缺氧40 min為再給氧的時間點，觀察了細胞內(nèi)游離鈣的變化，并對比觀察了丹參素和SOD對鈣超載的防治作用。結(jié)果顯示，缺氧40min再給氧20 min時細胞內(nèi)游

20、離鈣濃度比單純?nèi)毖?0 min顯著為高，伴有明顯的鈣超載現(xiàn)象，細胞桿形率的變化亦然。丹參素和SOD可顯著降低氧反常時細胞內(nèi)游離鈣，提高細胞桿形率，表現(xiàn)出對氧反常心肌細胞的保護作用，而且前者的作用優(yōu)于后者。關(guān)于鈣超載的發(fā)生機理，目前認為主要與Na+/Ca2+交換增加4、再灌時產(chǎn)生的大量的氧自由基對膜結(jié)構(gòu)的破壞作用5以及兒茶酚胺的作用6有關(guān)。最近的研究表明7，心肌細胞局部的腎素-血管緊張素系統(tǒng)亦參與了鈣超載的發(fā)生。丹參是一種具有活血化淤作用的中草藥，我們以前的工作表明它可通過打破氧自由基介導(dǎo)的惡性循環(huán)性細胞損害的發(fā)病連鎖環(huán)，抑制脂質(zhì)過氧化物的形成從而抑制鈣離子的大量內(nèi)流，達到保護心肌從而避免再灌注

21、損傷的作用8。丹參素還能對線粒體膜電位和ATP酶合成反應(yīng)有明顯的恢復(fù)與保護作用9。另有研究表明10，丹參對急性缺血后再灌注心肌PIP2和IP3的高水平狀態(tài)有明顯的抑制作用，提示丹參防治再灌注損傷的機制可能與其抑制心肌組織磷脂肌醇系統(tǒng)的代謝，使肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣離子釋放受抑，從而減輕心肌細胞內(nèi)鈣超載的程度有關(guān)。SOD防止鈣超載的機制在于其對再灌注過程中大量產(chǎn)生的氧自由基具有滅活作用，防止膜脂質(zhì)過氧化，維持膜結(jié)構(gòu)與功能的完整性。本文結(jié)果顯示丹參素的作用優(yōu)于SOD，這為開發(fā)和利用丹參這種具有豐富資源的中草藥的藥用價值提供了依據(jù)。作者單位：朱甫祥:北京市放射醫(yī)學(xué)研究所 (北京 100850)劉國美：安徽省宣州

22、市人民醫(yī)院楊志宏：山東省煙臺市煙臺山醫(yī)院內(nèi)科王孝銘馬麗英：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室參考文獻1Nalyer WG,Panagiotopoulos S,Elz JS,et al.Calcium-mediated damage during post-ischemic reperfusion.J Mol Cell Cardiol,1988， 20(suppl.II):41.2Farmer BB,Mancina M,Williams ES,et al.Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts.Life Sci,1983， 33:1.3李芳，王孝銘，李相忠.缺血/再灌注時心肌細胞內(nèi)Ca2+分布的時相性改變及丹參的影響.中國病理生理雜志