重癥肌無(wú)力患者骨骼肌肌肉蛋白成分分析

1、重癥肌無(wú)力患者骨骼肌肌肉蛋白成分分析         【摘要】目的探討重癥肌無(wú)力（MG）肌肉中與收縮有關(guān)的肌球蛋白成分是否減少。方法 用Gubstraub溶液(myosin 提取液) 按常量（勻漿）和微量（浸出）方式提取10名正常人及17例MG患者肌肉的蛋白成分，用雙盲法分別以常量及微量聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法分析肌肉蛋白成分, 用雙向電泳分析有差異的譜帶。結(jié)果常量SDS-PAGE電泳圖譜分析顯示,相對(duì)分子質(zhì)量約25 000的蛋白譜帶密度為4.14±1.33，MG患者肌肉為2.02

2、77;1.08，差異有非常顯著意義（P0.001）；微量分析獲得正常肌肉該蛋白譜帶的密度為4.26±2.58，MG患者肌肉為1.34±0.79，差異亦有非常顯著意義（P0.001）；雙向電泳顯示，有差異的25 000蛋白略偏堿性，并至少由2個(gè)等電點(diǎn)相近的蛋白成分組成。用部分純化的肌球蛋白鑒定顯示，25 000蛋白與肌球蛋白輕鏈無(wú)關(guān)。結(jié)論MG患者肌肉中25 000蛋白水平明顯低于正常人肌肉，提示該蛋白可能與MG發(fā)病或發(fā)展有關(guān)。 Analysis of protein components of skeletal muscle from the patients with my

3、asthenia gravis  【Abstract】ObjectiveTo explore whether the components of protein associated with muscle contraction appear decreased in the muscles of myasthenia gravis (MG).MethodsThe proteins were extracted from 10 normal cases and 17 cases of MG skeletal muscles with Gubstraub solution, and

4、the components of the protein were analyzed by SDS-PAGE in common and micro methods in double blind. Composition of the differential protein band was observed by two-dimensional electrophoresis.ResultsSDS-PAGE patterns showed that the density of the protein band with a mass of about 25 kD in MG musc

5、les was much&nb sp;lower than that in normal muscles. The value of density for 25 kD protein band in common analysis was 4.14±1.33 and 2.02±1.08 in the normal and MG muscles, respectively (P0.001), while in micro analysis the density of the protein band was 4.26±2.58 in normal and

6、 1.34±0.79 in MG muscles, respectively (P0.001).The pattern of two-dimensional electrophoresis demonstrated that the differential 25 kD protein band was composed of more than two components appearing in the adjacent isoelectric point on the alkaline side of the gel, and they were proved to be n

7、ot related to the components of myosin light chains. ConclusionIt was suggested that pathogenically the development of MG should be associated with the involvement of 25 kD protein of the skeletal muscles. 【Key words】Myasthenia gravis； Muscle, skeletal； Proteins 重癥肌無(wú)力（MG）被認(rèn)為是一種由乙酰膽堿受體（AChR）抗體引起神經(jīng)肌肉接

8、頭突觸膜AChR功能喪失的自身免疫疾病。但近年已發(fā)現(xiàn)，一系列的非AChR骨骼肌抗體1、Ryanodine 受體抗體及補(bǔ)體C9等均與MG的發(fā)病有關(guān)2。最近，我們不僅從肌肉組織中篩選到5個(gè)在正常人和MG患者肌肉中表達(dá)有明顯不同的新的基因片段3，而且發(fā)現(xiàn)在以PBS提取的MG患者肌肉蛋白成分中，1個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量約25 000的蛋白的水平明顯低于正常人肌肉。由于AChR 抗體陽(yáng)性和陰性的MG患者臨床表現(xiàn)相似，均為骨骼肌極易疲勞，并且已經(jīng)知道Duchenne和強(qiáng)直性等肌營(yíng)養(yǎng)不良的肌病患者骨骼肌肌球蛋白輕鏈組成發(fā)生了改變4，那么，是否MG患者肌肉極易疲勞的唯一原因?yàn)锳ChR功能的喪失， 而不涉及肌肉蛋白，特

9、別是與收縮有關(guān)的蛋白的變化呢？本研究就此問題進(jìn)行探討。 資料和方法 1 樣品來源：正常人肌肉標(biāo)本10份，取于10例骨折手術(shù)病人的肢體骨骼肌。MG患者肌肉標(biāo) 本17份，取于17例全身型MG患者，無(wú)呼吸肌受累，其中8例伴胸腺瘤，9例伴胸腺增生。肌肉取自MG患者胸腺切除手術(shù)切口周圍的骨骼肌，標(biāo)本均于-27保存。 2 蛋白的提取及濃度的測(cè)定：蛋白按常量及微量?jī)煞N方法進(jìn)行提取。常量提取：肌肉樣品取米粒大小置微量玻璃勻漿器，加入100 l肌球蛋白提取液Gubstraub溶液(0.3 mol/L KCl，0.10 mol/L KH2PO4，0.05 mol/L K2HPO4,pH 6.5)，冰浴下制成勻漿，

10、吸出肌肉勻漿，加50 l提取液洗滌，合并勻漿液并放置4過夜，10 000×g離心15 min，上清液再經(jīng)25 000×g離心10 min，按Spector5方法測(cè)定蛋白濃度。微量提取：將低溫貯存的肌肉標(biāo)本移至4冰箱，放置片刻使其軟化，取一小塊肌肉置解剖鏡下滴加含20甘油的生理鹽水，剝?nèi)〖±w維10根左右，放置0.5 ml Ep管底部，加入10 l Gubstraub溶液，4過夜，離心后吸取上清液，蛋白定量后冷凍保存。        3 肌球蛋白的部分純化：基本按Konagaya等6方法進(jìn)行。簡(jiǎn)言之

11、，取正常人與MG患者肌肉各1塊（約10 mm3），按上述常量提取法獲得蛋白上清液， 該上清液以14倍體積的預(yù)冷無(wú)離子水稀釋，混勻后10 000×g離心 10 min，沉淀用100 l Gubstraub溶液溶解，再以9倍體積的預(yù)冷無(wú)離子水稀釋，混勻后10 000×g離心10 min，沉淀用50 l Gubstraub 溶液溶解。 4 蛋白的單相電泳分析：基本按Laemmli7 方法進(jìn)行非連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。制膠及電泳緩沖液均為含 0.1SDS的Tris/Gly, pH 8.3。常量電泳分析蛋白加樣量均為30 g,凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。微量電泳分析

12、加樣量均為1 g, 蛋白檢測(cè)基本按Kirkeby等8方法進(jìn)行銀染。 5 蛋白雙向電泳分析：基本按任惠民等9方法進(jìn)行。第1向等電聚焦的膠長(zhǎng)約40 mm，直徑0.7 mm，凝膠濃度為5（含4 pH 3.510.0的ampholyte, 5%甘油和1尿素）。蛋白加樣量為30 g，凝膠上蛋白用銀染顯色。 6 蛋白分析及統(tǒng)計(jì)方法：將所需比較的蛋白譜帶經(jīng)生物電泳圖像分析儀掃描并計(jì)算密度。檢測(cè)結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。 結(jié)果 1 肌肉蛋白的微量和常量分析電泳圖譜：圖1左側(cè)為常量提取的肌肉蛋白電泳圖譜，圖1右側(cè)為微量提取的肌纖維蛋白經(jīng)電泳分離的銀染圖譜。2種方法分析的結(jié)果均顯示，相對(duì)分子

13、質(zhì)量約25 000蛋白譜帶濃度在正常肌肉中明顯高于MG肌肉。  2 正常人肌肉與MG患者肌肉25 000蛋白水平的比較：常量電泳分析，25 000蛋白譜帶經(jīng)掃描計(jì)算，密度在正常肌肉中為4.14±1.33， MG肌肉中為2.02±1.08, 差異有非常顯著意義(P0.001)。微量電泳分析，25 000蛋白譜帶密度在正常肌肉中為4.26±2.58, MG肌肉中為1.32±0.79,差異亦有非常顯著意義(P0.001)。 3 蛋白的雙向電泳圖譜：圖2A為正常人及MG患者肌肉蛋白的雙向電泳圖譜。從圖2A可看出單相SDS-PAGE圖譜所顯示的25 00

14、0譜帶至少由2個(gè)蛋白成分組成，正常肌肉與MG肌肉中有明顯差異的是1個(gè)偏堿的蛋白成分。圖2B為提取的肌肉蛋白與部分純化的肌球蛋白提取物雙向電泳圖譜。可以看出，有差異的25 000蛋白與肌球蛋白提取物獲得的蛋白成分無(wú)關(guān)。&nbs p;討論 人們很早就對(duì)MG患者肌肉的形態(tài)學(xué)特征及與肌肉收縮有關(guān)的重要化學(xué)物質(zhì)，如肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白等進(jìn)行了研究。雖然發(fā)現(xiàn)MG患者血清中抗肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白等抗體滴度高于健康人10, 但迄今仍沒有充分的證據(jù)說明MG患者肌細(xì)胞中調(diào)控肌纖維收縮的粗絲、細(xì)絲和Z帶等形態(tài)學(xué)特征以及與肌肉收縮有關(guān)的蛋白合成發(fā)生了明顯的改變，即使是在MG患者胸腺組織，也未發(fā)現(xiàn)肌樣細(xì)胞

15、(myoid cells)的數(shù)目和結(jié)構(gòu)以及對(duì)肌球蛋白、肌鈣蛋白等抗體的染色反應(yīng)與正常人有明顯的差別11。因此，目前對(duì)MG的研究主要集中在對(duì)AChR的結(jié)構(gòu)、抗體與抗原免疫學(xué)特征、應(yīng)答AChR功能喪失的免疫學(xué)機(jī)制等方面。那么，MG患者肌細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)，特別是DNA與蛋白是否真的沒有發(fā)生改變呢？答案是否定的。  近年來，我們從肌肉中已經(jīng)篩選到5個(gè)新的基因片段，并證實(shí)其中有3個(gè)基因在正常人與MG患者肌肉中的表達(dá)有明顯的差異3。最近我們用SDS-PAGE分析了PBS提取的正常人骨骼肌及MG患者骨骼肌的蛋白成分，發(fā)現(xiàn)正常人肌肉中有一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量約25 000的蛋白的水平明顯高于MG患者肌肉。

16、在本研究中，我們改用肌球蛋白提取液Gubstraub溶液提取正常與MG患者肌肉的蛋白成分，亦發(fā)現(xiàn)MG患者肌肉中相對(duì)分子質(zhì)量約25 000蛋白譜帶水平明顯低于正常肌肉，經(jīng)掃描計(jì)算，該譜帶密度在正常人肌肉與MG患者肌肉中的差異有非常顯著意義（P0.001）。雙向電泳顯示，該譜帶是由數(shù)個(gè)等電點(diǎn)十分接近的蛋白成分構(gòu)成（圖2A），并且它們不是肌球蛋白的輕鏈成分（圖2B）。 在過去的研究中，我們?cè)鴮?duì)正常及交叉神經(jīng)支配的大鼠快、慢肌單纖維的肌球蛋白輕鏈特征進(jìn)行過探討。發(fā)現(xiàn)在正常大鼠中，快肌和慢肌的收縮速度和肌球蛋白輕鏈的數(shù)目是由快、慢肌本身決定的，與肌纖維的ATP酶染色分型無(wú)關(guān)12。在交叉神經(jīng)支配后，即快肌

17、用慢肌神經(jīng)支配，慢肌用快肌神經(jīng)支配后，原先為快肌的肌球蛋白輕鏈類型隨時(shí)程逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槁〉妮p鏈類型；反之，原先為慢肌的輕鏈類型則轉(zhuǎn)變?yōu)榭旒〉妮p鏈類型13。因此，我們認(rèn)為神經(jīng)支配對(duì)肌肉的收縮起著十分關(guān)鍵的作用。然而，對(duì)MG患者肌肉而言，它們?nèi)允苌窠?jīng)的支配，為何其收縮功能卻發(fā)生了明顯的改變呢？用AChR功能的喪失解釋MG患者肌肉衰弱與易疲勞的原因似乎很有道理，但是為何MG患者經(jīng)血漿置換、藥物治療甚至休息后，肌肉的收縮狀況會(huì)得以改善？即使改善是短暫的。此外，為何AChR抗體陰性患者臨床表現(xiàn)亦與AChR抗體陽(yáng)性患者相同。我們認(rèn)為，MG患者肌肉的收縮功能發(fā)生障礙的原因除AChR 功能喪失外，勢(shì)必還有其他原

18、因，很可能與MG肌肉內(nèi)的某些物質(zhì)缺乏，或者合成與消耗的失衡有很大關(guān)系。盡管目前我們尚未能確定用Gaubstraub溶液提取的肌肉蛋白和用PBS提取的肌肉蛋白成分中所發(fā)現(xiàn)MG缺少的25 000蛋白是否為同一物質(zhì)，但由于它們?cè)贛G患者肌肉中明顯缺少，就有必要闡明該蛋白缺少的原因以及它與MG發(fā)病和發(fā)展的關(guān)系，并對(duì)該蛋白的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行深入的研究。        需要指出的是，為了更客觀地反映出正常與MG肌肉蛋白成分是否存在差異，在本研究中，我們采用了雙盲法進(jìn)行電泳分析和譜帶密度掃描。在進(jìn)行常量分析的同時(shí)，也采用了超微量分

19、析，以保證本研究結(jié)果的客觀性、可比性。然而，MG患者肌肉中25 000蛋白的減少是否具有特異性，以及它在肌無(wú)力發(fā)病機(jī)制中的意義有待進(jìn)一步研究。      參考文獻(xiàn) 1，Hofstad H, Gilhus NE, Matre R, et al. Non-receptor muscle antibodies in myasthenia gravis are of Ig1 and Ig4 subclasses. Autoimmunity, 1992， 12: 271-276. 2，Skeie GO, Pandey JP, Aarli JA, et a

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