人支氣管上皮細(xì)胞在呼吸道合胞病毒感染后CFTR功能及上皮修復(fù)功能研究

1、人支氣管上皮細(xì)胞在呼吸道合胞病毒感染后CFTR功能及上皮修復(fù)功能研究目的：呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV) 感染是臨床取常見的,也是兒科最常遇到的呼吸道病原之一。支氣管上皮細(xì)胞在RSV感染后，其病理改變?nèi)Q于某些離子通道的功能活性及表達(dá)密度，其是否抑制了其囊性纖維 化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(Cystic Fibrosis Transmembrane conductanceRegulator, CFTR)的表達(dá)水平和功能。我們擬建立RSV感染離體支氣管上皮細(xì)胞模型,對RSV感染支氣管上皮細(xì)胞后 CFTR的表達(dá)及功能進(jìn)行研究。方法：1)建立RSV感染離體

2、培養(yǎng)支氣管上皮細(xì) 胞模型將 原RSV病毒懸液(TCID50=10-3.82/0. 1ml)按1： 100000的濃度稀釋，得RSV病毒感染人支氣管上皮細(xì)胞模型的初始病毒濃度，以此濃度的RSV病毒感染人支氣管上皮細(xì)胞制備離體RSV病毒感染人支氣管上皮細(xì)胞模型。RT-PCF法驗證模型中RSV存在以及其轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。2)人支氣管上皮細(xì)胞感染RSV后CFTR的表達(dá)取對數(shù)生長期RSV感染人支氣管上皮細(xì)胞模型中陰性對照組細(xì)胞、RSV感染后傳代第1代的細(xì)胞和可穩(wěn)定傳代的模型組細(xì)胞，通過免疫熒光的 方法檢測RSV!定感染后細(xì)胞CFTR勺蛋白水平定位及表達(dá)；Western-blot法檢測RSV! 定感染后細(xì)胞C

3、FTR的蛋白表達(dá)；qRT-PCF法檢測RSV!定感染后 細(xì)胞CFTR的rnRNA表 達(dá)水平。3)人支氣管上皮細(xì)胞感染RSV后CFTR的功能變化取對數(shù)生長期RSV!定感染人支氣管上皮細(xì)胞模型中陰性對照組細(xì)胞、RSV感染后傳代第1代細(xì)胞和穩(wěn)定傳代 的模型組細(xì)胞，采用全細(xì)胞記錄的方法記錄RSV持續(xù)感染人支氣管上皮細(xì)胞 模型陰性 對照組和模型組細(xì)胞上CFTRC1-的變化。加入激動劑5 的forskolin以后，激活 CAMP誘導(dǎo)CFTR Cl電流,細(xì)胞被鉗制在-40mV,給予不同的電壓刺激，電壓自TOOmV逐步增到+100mV去極化電壓時程為200nls步階為20mV間隔為2S。去極化電壓結(jié)束后恢復(fù)至

4、-40mV鉗制電壓。取各個電壓狀態(tài)下最大電流值 繪制I -V關(guān)系曲線。用MQA熒光染料法檢測3組細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)C1-濃度,制備標(biāo)準(zhǔn)品,檢測標(biāo)準(zhǔn) 品C1- 濃度,繪制C”濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)d-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算出待測3組支氣管上皮細(xì)胞 中C1-濃度，同時RQA熒光染料法檢測3組細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)C”濃度熒光強(qiáng)度變化率。4) 人支氣管上皮細(xì)胞感染RSV后上皮修復(fù)功能改變制備RSV感染人支氣管上皮細(xì)胞的損 傷模型后，用顯微視頻分析BI-2000圖像/免疫組化分析系統(tǒng)分別于機(jī)械損傷后 Ohrs, 8hrs, 12hrs, 18hrs, 24hrs測量缺損面積一次，收集 所有時間點(diǎn)的缺損區(qū)域圖 像，勾畫缺損區(qū)域

5、的邊緣，以相關(guān)系數(shù)r來衡量兩者是否存在直線相關(guān)關(guān)系，繪 制時間與修復(fù)面積的直線回歸方程：Y=a+bX計算損傷修復(fù)指數(shù)(RL rep air in dex), RI值等于回歸方程中b的絕對值(RI=| b )，以此反映不同處理組之間不同的修復(fù)速度，直線的斜率為損傷修復(fù)指數(shù)，斜率越大，損 傷修復(fù)速度越快。結(jié)果：1)RSV感染離體培養(yǎng)支氣管上皮細(xì)胞模型的建立RT-PCR法驗證模型中RSV存在以及其轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在RSV感染后的RSV感染人支氣管呼吸道 細(xì)胞模 型中，最初幾代的RSV的表達(dá)水平是逐步增高的，然后維持在較穩(wěn)定水平，但是從細(xì) 胞的形態(tài)學(xué)上來觀察，并沒有引起肉眼可見的細(xì)胞病變，同時也未被

6、人支氣管上皮 細(xì)胞所清除。表示RSV穩(wěn)定感染離體培養(yǎng)支氣管上皮細(xì)胞模型建立成功。2)人支氣管上皮細(xì)胞感染RSV后CFTR的表達(dá)的改變?nèi)?shù)生長期RSV穩(wěn)定感染人支氣管上皮細(xì)胞模型中陰性對照組細(xì)胞、RSV穩(wěn)定感染后傳代第1代細(xì)胞和穩(wěn)定傳代的模型組細(xì)胞,通過免疫熒光的方法檢測RSV感染細(xì)胞CFTR勺蛋白水平定位及表達(dá)，并隨機(jī)選取視野，計數(shù)熒光染色陽性細(xì)胞的百分率。結(jié)果顯示 在RSV感染人支氣管上皮細(xì)胞模型陰性對照組細(xì)胞的細(xì)胞膜及胞漿中可見較多的綠色染色的CFTR并且熒光染色陽性細(xì)胞的百分率較高；在RSV穩(wěn)定感染模型傳代第1代細(xì)胞就發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞的細(xì)胞膜及胞漿中CFTF明顯減少,并且熒光染色呈陽性細(xì)胞的

7、百分率明顯減少；而在RSV穩(wěn)定感染模型組細(xì)胞中細(xì)胞膜及胞漿中CFTR表達(dá)較陰性對照組細(xì)胞明顯減少,較RSV感染模型第1代細(xì)胞也有略有減少，并且熒光染色陽性細(xì)胞的百分率也略有減少。推測RSV感染細(xì)胞后，可破壞氣道上皮結(jié)構(gòu)的完整性，致使局部氣道微環(huán)境呈失穩(wěn)態(tài)的狀態(tài)，使得氣道功能失調(diào)，改變了氣道上皮應(yīng)激應(yīng)答機(jī)制，導(dǎo)致氣道的功能和結(jié)構(gòu)重塑，形成慢性氣道炎癥和氣道病理改變。分別提取RSV感染人支氣管上皮細(xì)胞模型陰性對照組細(xì)胞、RSV感染后傳代第1代細(xì)胞和穩(wěn)定的RSV感染模型組細(xì)胞的膜蛋白，Western-blot法檢測RSV感染后細(xì)胞CFTR的蛋白表達(dá),膠片曝光結(jié)果使用Quantity one灰度掃描軟

8、件處理數(shù)據(jù),其表達(dá)強(qiáng)度用CFTR灰度值/ P -actin灰度值表示,重復(fù)3次，統(tǒng)計結(jié)果,繪制直方圖。實驗結(jié)果顯示，相對于陰性對照組細(xì)胞,RSV感染后第1代細(xì)胞和穩(wěn)定RSV持續(xù)感染的模型組細(xì)胞CFTR表達(dá)明顯降低，結(jié)果具有明顯差異，*P<0.05. 分別提取RSV感染人支氣管上皮細(xì)胞模型陰性對照組細(xì)胞、RSV感染后傳代第 1代細(xì)胞和穩(wěn)定RSV感染模型組細(xì)胞的RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA, RT-PCR法檢測RSV感染后細(xì)胞CFTR的mRNAS達(dá)水平，結(jié)果mRNAfe達(dá)=2 (_ AAt )。結(jié)果顯示,相對于陰性對 照組細(xì)胞,RSV感染后第1代細(xì)胞和穩(wěn)定RSV感染模型組細(xì)胞CFTR的mRN

9、表達(dá)明顯降低,結(jié)果具有明顯差異，*P<0.05.3)人支氣管上皮細(xì)胞感染RSV后CFTR的功能變化全細(xì)胞記錄的方法記錄RSV感染人支氣管上皮細(xì)胞模型陰性對照組 和模 型組細(xì)胞上CFTR C”的變化。結(jié)果顯示,在RSV感染的作用下,CFTRC1-電流密度增加，并具有濃度依賴性，在 10-3而為最大半數(shù)有效劑量。CFTRC1-阻斷劑glibenclamide能阻斷該電流,而非 CFTR Cl-阻斷劑DIDS不能阻斷該電流。MQA熒光染料法檢測3組細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)C1-熒光強(qiáng)度變化率,結(jié)果顯示RSV持續(xù)感染后，細(xì)胞內(nèi)C1-熒光強(qiáng)度變化率的變化相對于陰性對照組明顯減少，表示RSV感染后，調(diào)節(jié)C1-通道的通道蛋白調(diào)節(jié)功能被抑制,C1-外流降低,細(xì)胞內(nèi)C1-濃度變化率降低。4)人支氣管上皮細(xì)胞感染RSV后上皮修復(fù)功能改變結(jié)果顯示,RSV感染陰性對照組斜率絕對值較大，修復(fù)速度較快；RSV穩(wěn)定感染模型組斜率絕 對值較小，修復(fù)速度較慢。提示RSV感染HBECs后,HBECs的自身增殖、遷移及損傷修復(fù)能力較RSV感染前，有所下降，其損傷修復(fù)功能發(fā)生重塑，