超敏反應的主要免疫學檢測

1、超敏反應的主要免疫學檢測 2009-11-5 956【大 中 小】【我要糾錯】 四種類型超敏反應發(fā)生的機制不同，同一抗原也可在不同條件下引起不同類型的超敏反應。四種類型超敏反應的免疫檢測方法有所不同。型超敏反應主要檢測過敏原和測定血清特異性IgE.型超敏反應的檢測重點是抗血細胞抗體。型超敏反應主要檢測循環(huán)免疫復合物。型超敏反應可用皮膚試驗來檢測。 一、過敏原皮膚試驗 皮膚試驗簡稱皮試，是在皮膚上進行的體內免疫學試驗。當試驗抗原進入致敏者皮膚時，皮膚中結合有IgE的肥大細胞或致敏T細胞就會與試驗抗原結合，引發(fā)即刻型或遲發(fā)型的皮膚超敏反應。試驗抗原也可從注射部位進入微血管，與循環(huán)中的相應抗體結合，

2、形成的免疫復合物可在局部沉積，激活補體引起炎癥。所以皮膚試驗主要用于檢測型和型變態(tài)反應，有時也用于檢測型變態(tài)反應醫(yī)學教育網搜集整理。 （一）試驗準備 首先應當制備試驗用抗原，如有合格商品可直接購買。可以作為變應原的物質種類繁多，例如動物皮毛、家禽羽毛、鴿糞、昆蟲、螨類、真菌、花粉、雜草、物理粉塵和各種食品等都可能成為變應原。 不同抗原的制備方法不同，但一般包括以下幾個步驟：收集原料；粉碎與勻漿；脫脂與提取；過濾與分離；分裝保存。分裝保存之前應對提取產物進行鑒定。首先必須經過無菌試驗、急性毒性試驗和熱原檢查，保證提取產物無明顯的毒副作用；還要測定產物的蛋白含量，用凱氏定氮法或磷鎢酸沉淀法標定出總

3、氮單位或蛋白氮單位。 試驗部位應清洗干凈，嚴格消毒，以免皮膚的不潔物引起非特異性反應或感染。當皮膚患濕疹、感染、皮炎或外傷時不宜進行皮膚試驗。正在或近日服用免疫抑制劑或抗組胺藥物者也不宜進行皮膚試驗。 （二）試驗類型及方法 皮膚試驗的最常用部位是前臂屈側，因此處皮膚較為光滑細膩，而且便于試驗操作和結果觀察。按正規(guī)作法，左右兩臂一側作試驗，另一側作對照。需要時也可選用上臂或背部皮膚。具體試驗方法可分為皮內試驗、挑刺試驗和斑貼試驗。 1.皮內試驗：將試驗抗原與對照液各0.0l0.03ml用皮試針頭分別注入皮內（不是皮下），使局部產生一個圓形小丘。當同時試驗多種抗原時，相互間至少間隔2.55cm，以

4、免強烈反應時互相混淆結果。 皮內試驗的敏感性比其他皮膚試驗高，所用抗原應適當稀釋，以免出現(xiàn)嚴重反應；當高可疑性抗原出現(xiàn)陰性結果時，應逐漸加大抗原濃度進行重復試驗。 皮內試驗是最常用的皮膚試驗。應用范圍也很廣，幾乎各類抗原及各型反應都可用皮內試驗進行測定，只是不同類型的反應觀察結果的時間和判定結果的標準有所不同。 2.挑刺試驗：也稱點刺試驗或刺痕試驗。將試驗抗原與對照液分別滴于試驗部位皮膚上，用針尖透過液滴或在皮膚上輕輕地挑刺一下，以刺破皮膚但以不出血為度；1min后拭（吸）去抗原溶液。同時試驗多種抗原時，千萬注意不要將不同的抗原液交叉混合，以免出現(xiàn)假陽性。 挑刺試驗主要用于型變態(tài)反應，該法雖比

5、皮內試驗法敏感性稍低，但假陽性較少，與臨床及其他試驗的相關性較強。 劃痕試驗是挑刺試驗的一個變型，用三棱針或注射器針頭在皮膚劃一條或多條約lcm長的創(chuàng)痕。因為劃痕的輕重與長短難于掌握一致，故不常用。 3.斑貼試驗：將試驗抗原直接貼敷于皮膚表面的方法。主要用于尋找接觸性皮炎過敏原。試驗抗原為軟膏時可直接涂沫在皮膚上；如為固體物時可用蒸餾水混合或浸濕后涂敷于皮上；如為水溶液則浸濕紗布后敷貼于皮膚上。所用抗原濃度以不刺激皮膚為原則，涂敷范圍以0.51cm為宜。涂敷后蓋以油紙或玻璃紙，用紗布或繃帶固定；如有明顯不適感可隨時打開查看，并進行適當處理。斑貼試驗主要是檢測型變態(tài)反應，敏感程度雖然不太高，但假

6、陽性較少，結果的可信度大。 （三）結果判定及分析 1.型變態(tài)反應在抗原刺激后2030min內觀察結果。挑刺試驗的陽性反應以紅暈為主，皮內試驗的陽性反應則以風團為主，判定標準見有關文獻。 2.IV型變態(tài)反應在接觸抗原后2472h內觀察結果。皮內試驗的陽性結果以紅腫和硬結為主，斑貼試驗的陽性結果以紅腫和水皰為主。判定標準見有關文獻。有時候，機體對某變應原可能同時存在多種類型的反應。例如在做青霉素皮內試驗時，30min內觀察呈陰性反應，但在58h可能會出現(xiàn)型變態(tài)反應，反應的外觀現(xiàn)象介于型與型變態(tài)反應之間；甚至還可能出現(xiàn)型變態(tài)反應。 3.假性結果：在一定條件下，皮膚反應的結果可能與機體的實際情況不符，

7、即出現(xiàn)假陽性或假陰性等不真實的結果。 出現(xiàn)假陰性的常見原因有：試驗抗原的濃度過低，或者因各種原因失效；試驗時正確服用免疫抑制劑或抗組胺藥物（后者可通過設立組胺陽性對照而判斷出來）；操作誤差，例如皮內試驗時注射過深進入皮下，注入抗原量過少等；皮試季節(jié)選擇不當，例如花粉季節(jié)過后，抗花粉抗體水平可下降。 出現(xiàn)假陽性的常見原因有：試驗抗原不純，在 提取、配制，甚至在試驗過程中被其他抗原污染，引起交叉反應；試驗溶液配制不當，過酸或過堿都會對皮膚產生非特異性刺激；皮膚反應性過強，例如被試者患有皮膚劃痕癥，或者有既往過敏的痕跡等；操作不當，例如注入少量空氣也可出現(xiàn)假陽性。 （四）應用與評價 皮膚試驗屬于活體

8、試驗，雖然影響因素眾多，卻能反應機體各種因素綜合作用的實際免疫狀態(tài)；并且簡單易行，結果的可信度大；這些優(yōu)點是其他方法難以替代的，所以在臨床和防疫工作中都經常應用。 1.尋找變應原：變態(tài)反應防治的重要原則之一是回避變應原，而回避的前提是明確變應原。確定變應原的常用方法是各種類型的皮膚試驗。例如支氣管哮喘和蕁麻疹等均可用皮膚試驗來幫助診斷。但食物過敏與皮膚試驗的相關性較差，這可能是因為食物的抗原提取液與腸吸收的物質有所不同，或食物過敏并非IgE所介導；而且食物過敏的變應原容易發(fā)現(xiàn)，一般不必作皮膚試驗。 2.對患者首次注射某批號的青霉素、鏈霉素預防藥物或疫苗過敏或其他易過敏藥物之前，必須做過敏試驗；

9、如果患者呈陽性反應（即使是可疑陽性），就應更換其他抗生素。注射異種抗血清（例如抗破傷風血清和抗狂犬病血清）前也必須做過敏試驗，如果呈陽性反應就需要換用精制抗體；或進行脫敏治療（少量多次注射，使抗原逐漸中和血液中的抗體）。 3.評價宿主細胞免疫狀態(tài)：在可疑免疫缺陷病、腫瘤或器官移植時，了解患者的細胞免疫狀態(tài)對疾病診斷和預后判斷都有重要意義。這種情況下可以使用共用抗原結核菌素（OT或PPD）或雙鏈酶（SD-SK）進行皮膚試驗；或使用人工合成的二硝基氯苯（DNCB）或二硝基氟苯（DNFB）等先進行致敏再作皮膚試驗，這樣可消除抗原接觸史不同所致的誤差醫(yī)學教育網搜集整理。 4.傳染病的診斷：對某些可疑的

10、傳染病，用某種病原體的特異性抗原進行皮膚試驗可以起到診斷或鑒別診斷的作用。例如對布氏菌病和軟下疳等細菌感染、對某些病毒感染和真菌感染、以及某些寄生蟲感染均有一定的意義。 另外，還有一些反應機制不同于變態(tài)反應的中和性皮膚試驗，例如診斷白喉的錫克試驗和診斷猩紅熱的狄克（Dick）試驗等。 二、血清lgE的檢測 IgE是介導型變態(tài)反應的抗體，因此檢測血清總IgE和特異性IgE對型變態(tài)反應的診斷和過敏原的確定很有價值。 （一）血清總IgE的測定 正常情況下血清IgE僅在ngml水平，用常規(guī)測定IgG或IgM的凝膠擴散法檢測不出IgE，必須用高度敏感的放射免疫 測定法及酶聯(lián)免疫測定法和化學發(fā)光法等進行檢

11、測。 1.放射免疫吸附試驗（IRST）：是將抗IgE吸附到固相載體上用以檢測血清IgE的方法，故又稱固相放射免疫測定（SPRIA）。臨床常用雙抗體夾心法，多以濾紙為載體。將抗IgE抗體偶聯(lián)到經溴化氰活化的濾紙上，使其與待檢血清及IgE參考標準進行反應；洗滌后加入125I標記的抗人IgE，再經洗滌后測定濾紙片的放射活性，其測定值與標本中的IgE含量呈正相關。 2.酶聯(lián)免疫測定法：測定血清IgE時也常用雙抗體夾心ELISA法，操作方便，敏感性也很高，在臨床上經常應用。 3.間接血凝試驗：用抗IgE致敏紅細胞，將標本血清做系列稀釋后與致敏紅細胞反應。此法更加簡便易行，便于普及，但敏感性比上兩法稍低。

12、 4.化學發(fā)光法：用化學發(fā)光物質標記抗IgE，與血清中的IgE反應后，通過化學發(fā)光分析，計算出IgE含量。此法敏感性特異性均較好。 （二）特異性IgE的測定 過敏患者的血清中存在著具有變應原特異性的IgE稱之為特異性IgE，如對牛奶過敏者則有針對牛奶變應原的IgE；對蒿草花粉過敏者，則有針對該花粉的IgE，該抗體只能與該變應原特異性結合。因此需要用純化的變應原代替抗IgE進行檢測。 sIgE檢測方法有許多種，目前臨床上常用的有ELISA，F(xiàn)EIA，免疫印跡等。隨著sIgE測定技術的完善，此項測定已日趨商品化，開發(fā)了各種檢測系統(tǒng)，如CAP過敏原檢測系統(tǒng)，Master過敏原檢測系統(tǒng)，Px過敏原檢測

13、系統(tǒng)等，這些測定系統(tǒng)包括了儀器、試劑、計算機軟件處理系統(tǒng)。國內目前應用最多的是CAP檢測系統(tǒng)。 1.放射變應原吸附試驗（RAST）：將純化的變應原與固相載體結合，加入待檢血清及參考對照，再與同位素標記的抗IgE抗體反應，然后測定固相的放射活性，通過標準曲線求出待檢血清中特異性IgE的含量，或在標本放射活性高于正常人均數(shù)加3s時判為陽性。 2.酶聯(lián)免疫測定法試驗：原理及步驟基本同RAST，僅是最后加入酶標記的抗IgE，利用酶底物進行顯色。測定結果的表示也與RAST相同。 3.CAP檢測系統(tǒng)：CAP，一個很小的塑料帽狀物，其內置有多孔性、彈性和親水性的纖維素粒，此粒多孔，吸咐了更多的變應原，加人血

14、清，血清中的sIgE就會和變應原結合，再加入酶標抗人IgE，再加入熒光顯色系統(tǒng)，在熒光分光光度計上測定熒光強度，計算機提供相應軟件，自動計算出結果。報告sIgE含量。 （三）臨床意義 1.血清總IgE：血清總IgE水平一般用國際單位（IU）或ng表示，1IU=2.4ng，相當于WH0標準凍干血清制劑0.00928mg內所含的IgE量。正常人群IgE水 平受環(huán)境、種族、遺傳、年齡、檢測方法及取樣標準等因素的影響，以致各家報道的正常值相差甚遠。嬰兒臍帶血IgE水平小于0.5IUml，出生后隨年齡增長而逐漸升高，12歲時達成人水平。成人血清IgE水平約在20200IUml之間，一般認為大于333IU

15、ml（800ngml）時為異常升高。 與IgE升高相關的常見疾病有：過敏性哮喘、季節(jié)性過敏性鼻炎、特應性皮炎、藥物性間質性肺炎、支氣管肺曲菌病、麻風、類天皰瘡及某些寄生蟲感染等。上述疾病時IgE升高的程度并不一致，在過敏性支氣管肺曲菌病時最為顯著，其值可達500020000ngml，除了此病和特應性皮炎以及在花粉季節(jié)之外，任何血清總IgE水平大于5000ngml的患者均應考慮寄生蟲感染的可能性。 2.特異性IgE：slgE測定是體外檢測變應原的重要手段。主要用于型超敏反應的診斷。其試驗的靈敏度及特異性都很高、特別是對花粉、螨類、寵物皮屑、牛奶、雞蛋、堅果等變應原的sIgE測定，靈敏度和特異性都

16、在90%以上，有的甚至接近l00%.根據sIgE含量可確定患者變應原種類，可評價患者過敏狀態(tài)，脫敏治療的療效，對哮喘的診斷和鑒別診斷有重要幫助。 RAST（放射變應原吸附試驗）是目前公認的檢測型變態(tài)反應的有效方法之一，具有特異性強、敏感性高、影響因素少、對患者絕對安全等優(yōu)點；不但有助于過敏性哮喘的診斷，對尋找變應原也有重要價值。RAST與皮膚試驗和支氣管激發(fā)試驗的符合率在80%左右，但不能完全代替后兩種試驗，因為活體試驗還能反映嗜堿性粒細胞和靶細胞的反應性。 但是RAST也有許多缺點：費用昂貴、花費時間長、放射性同位素易過期而且污染環(huán)境、不同來源試劑盒的參比血清不同而不易相互比較、待檢血清含有

17、相同特異性IgG時可干擾正常結果。目前國內應用較少。 因此一般只在下列情況下才做RAST：皮試結果難以肯定，但需提供進一步的診斷證據者；不適宜做皮試或激發(fā)試驗者，例如老年、幼兒、妊娠婦女、患有皮膚病、對變應原有嚴重過敏史或正服用抗過敏藥物以及重病者；觀察脫敏治療效果或研究變態(tài)反應機制。 ELISA法與RAST有相似的優(yōu)點，而且還有獨特的長處，如沒有同位素污染、酶標抗體可長期保存，因此在國內應用較多。用ELISA測試屋塵和一些花粉的結果與RAST符合率較高，且與臨床也較符合，但與皮膚試驗的符合率可能不夠理想。 CAP吸咐變應原有單價，有多價，如多價霉菌，多價食物（Fx5E，含6種食物過敏原），多

18、價羽毛等，多價變應原陽性后，再進一步確定單個變應原成分。目前國內應用較多醫(yī)學教 育網搜集整理。 三、抗血細胞抗體的檢測 血細胞抗體是型變態(tài)反應的主要介質，檢測抗血細胞抗體對型變態(tài)反應的診斷有重要的意義，具體方法和臨床分析參見臨床血液學和臨床基礎檢驗學以及凝集反應等有關章節(jié)。主要包括Rh抗體檢測、抗紅細胞、血小板、白細胞等。 四、循環(huán)免疫復合物的檢測 型超敏反應的發(fā)生主要是由循環(huán)免疫復合物（CIC）引起，通過檢測CIC可以證實某些疾病是否與型超敏反應有關，也可幫助分析判斷疾病的進程及轉歸醫(yī)學教育網搜集整理。 （一）抗原特異性免疫復合物的檢測 抗原特異性免疫復合物的檢測是通過檢測免疫復合物中抗原特

19、異性來檢測CIC.優(yōu)點是特異性高，通過檢測可以了解引起免疫復合物病的抗原。但在大多數(shù)情況下，免疫復合物中的抗原性質不太清楚或非常復雜，所以抗原特異性方法并不常用。 （二）抗原非特異性免疫復合物的檢測 抗原非特異性免疫復合物的檢測僅是檢測血清中循環(huán)免疫復合物，方法很多。 （三）臨床意義 判定免疫復合物為發(fā)病機制的證據有三：病變局部有IC沉積；CIC水平顯著升高；明確IC中的抗原性質。第三條證據有時很難查到，但至少要具備前兩條，單獨CIC的測定不足為憑。人體在健康狀態(tài)下也存在少量的CIC（大約l020gml），其生理與病理的界限不易區(qū)分。另外，CIC檢測的方法太多，其原理各不相同，用一種方法測定為陽性，另一種方法檢測可能為陰性；但與免疫組化法一起檢測，其意義就大得多。 目前已經明確系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、部分腎小球腎