蒙藥冷蒿的遺傳多樣性隨機引物多態(tài)性分析

1、蒙藥冷蒿的遺傳多樣性隨機引物多態(tài)性分析         11-04-27 11:34:00     編輯：studa20             作者：劉越 潘寧，黃怡鶴，溫婧，周廉【摘要】  目的研究內(nèi)蒙古通遼地區(qū)蒙藥冷蒿的遺傳特異性及通遼、呼和浩特、錫林郭勒3個不同地區(qū)蒙藥冷蒿的遺傳多樣性。方法采用隨機引物多態(tài)性(RAPD)方法，從17組RAP

2、D引物中篩選出13組條帶清晰、多態(tài)性明顯并且重復(fù)性好的引物用于實驗，并利用Popgen32和NTSYS軟件進行數(shù)據(jù)計算與聚類分析。結(jié)果13組引物共產(chǎn)生的209條帶中，有201條多態(tài)性帶，多態(tài)位點百分率達96.17%。 3個地區(qū)蒙藥冷蒿Ht=0.238 1， Hs=0.187 4， Dst=0.050 7，地區(qū)間的Gst=0.212 9。通過UPGMA分析，呼和浩特與錫林郭勒盟冷蒿聚為一類，通遼冷蒿單獨聚為一類。結(jié)論冷蒿具有較高的遺傳多樣性且不同地區(qū)差異明顯。冷蒿居群總的遺傳多樣性來自于居群內(nèi)(78.71%)，且居群間有基因的交流。 【關(guān)鍵詞】  冷蒿種群; 改進CTAB; RAPD;

3、 遺傳多樣性Abstract：ObjectiveTo study the genetic diversity of Atremisia frigida in Tongliao population and three different regions of Inner Mongolia (Tongliao, Hohhot, Xilingol). Methods13 groups of primers with clear, obviously polymorphic and reproducible bands were screened from the 17 groups of prim

4、ers by random amplified polymorphic DNA (RAPD) method. The bands produced by the 13 groups of primers were calculated and analyzed through Popgen32 and NTSYS software. Results 13 groups of primers generated 209 bands, including 201 polymorphic bands. The percentage of polymorphic loci was up to 96.1

5、7%. The Neis genetic diversity and Shannon's information were different in the three different regions. Total genetic diversity (Ht) of three Atremisia frigida population was 0.238 1. Genetic diversity within three populations (Hs) was 0.187 4. Genetic diversity among populations (Dst) was 0.050

6、 7. Genetic differentiation coefficient among populations (Gst) was 0.212 9. In accordance with UPGMA based on genetic distance analysis, A. frigida of Hohhot and Xilingol clustered into one category, A. frigida of Tongliao clustered into a separate category.Conclusion A. frigida has a high genetic

7、diversity, and the genetic diversities of A. frigida in three regions are different. The total genetic diversity is from the genetic variation within A. frigida populations (78.71%). Meanwhile, there are genetic exchanges among populations.Key words：Artemisia frigid population; Improved CTAB; RAPD;

8、Genetic diversity蒙藥冷蒿Atremisia frigida(蒙語：阿給)，又名小白蒿、菟毛蒿，菊科蒿屬的小灌木，是蒙醫(yī)的常用藥，主要分布在內(nèi)蒙古13。近年來，隨著中藥材標(biāo)準化進一步深入，為提高中藥質(zhì)量和臨床效果，中藥材的道地性的研究越來越受到重視46。但對民族藥的道地性研究甚少。長期以來，蒙藥冷蒿一直在民間用于出血疾病的治療7。研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地來源的蒙藥冷蒿制炭后止血效果差異顯著，而且來自荒漠草原的蒙藥冷蒿制炭后活性成分的含量偏高。目前，冷蒿藥材來源為野生冷蒿，隨著荒漠化的進程，以及藥材的大量開采，將使冷蒿變成瀕危物種。為了避免野生藥用植物的枯竭，勢必要進行藥材的規(guī)范化栽培

9、種植(GAP)，對冷蒿遺傳背景的分析，不但可以從遺傳學(xué)角度觀察引起冷蒿質(zhì)量變異的原因，也可以為冷蒿栽培種植提供理論指導(dǎo)。在PCR基礎(chǔ)上建立起來的隨機擴增多態(tài)性(random amplified polymorphic DNA，RAPD)分子標(biāo)記技術(shù)，以其技術(shù)簡單易行，分析速度快，成本低，不用進行DNA克隆、southern雜交等復(fù)雜程序的優(yōu)點，特別適合于遺傳背景不清楚的材料的研究，在中藥材鑒定與遺傳多樣性研究中應(yīng)用廣泛810。本實驗采用RAPD方法，考察冷蒿的遺傳結(jié)構(gòu)，探討冷蒿止血活性成分變異的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。1 材料2007-11分別在呼和浩特、錫林郭勒盟當(dāng)?shù)厥占漭锔伤幉?2008-09在內(nèi)蒙

10、古通遼市奈曼旗采集冷蒿植株，并用冰塊冷凍保存。3個冷蒿群體編號見表1，群體間空間距離大于500 km。2 方法2.1 基因組DNA的提取與測定基因組DNA采用改進的CTAB法11提取。DNA大小及其完整性采用標(biāo)準濃度的DNA/Hind檢測，采用SAM 3000微量紫外/可見分光光度計測定A260、A280 及A230，據(jù)此推知各樣本總DNA的含量。2.2 RAPD引物的篩選參照王靜12以及本實驗室11的方法，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，對單一DNA樣品多引物進行RAPD-PCR擴增。在Bio-RAD Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照。最后，篩選出可產(chǎn)生多態(tài)性且重復(fù)性好的引物組合。表1 材

11、料來源Tongliao)E122.16 500350450沙地31株H呼和浩特 N40.82(Hohhot)E111.81580335534.6荒漠草原藥材L錫林郭勒 N43.95(Xilingol)E115.46790295 典型草原藥材2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣，RAPD為顯性標(biāo)記，同一引物的擴增產(chǎn)物在電泳中遷移率相同的條帶被認為是同源性的，屬于同一位點的條帶按清晰可見的強帶或反復(fù)出現(xiàn)的弱帶記為1，無帶記為0，形成二元數(shù)據(jù)矩陣。根據(jù)“0-1”原始矩陣，用Popgen32軟件計算多態(tài)位點比率(P)、Nei' s遺傳多樣性指數(shù)(h*)、Shannon信息指數(shù)(I*)、總

12、群體的基因多樣性(Ht)、群體內(nèi)基因多樣性(Hs)、群體間基因多樣性(Dst)、基因分化系數(shù)(Gst)、遺傳距離(D)和遺傳一致度(I)。利用NTSYS軟件進行各品種間UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean)聚類分析，構(gòu)建聚類樹圖。3 結(jié)果用來自不同種群的個體，從王靜已經(jīng)篩選的17個引物12中，選定適用于干藥材擴增的13條(組)引物(見表2)。表2 RAPD擴增引物、序列及總擴增結(jié)果3.1 通遼居群內(nèi)部遺傳多樣性分析本課題組采用通遼31株冷蒿樣本的DNA作為通遼地區(qū)冷蒿居群內(nèi)RAPD擴增的樣本。DNA樣品的RAPD-PCR擴增。結(jié)果見圖1。圖2 通遼地區(qū)居群內(nèi)的聚類分析圖3.2 居群間遺傳多樣性分析呼和浩特、錫林郭勒冷蒿干藥材混合均勻，隨機取樣進行DNA的提取，選取DNA完整性好、含鹽量少，RAPD擴增結(jié)果穩(wěn)定的3個不同批次的D