保健食品中黃酮類化合物檢驗

1、保健食品中黃酮類化合物檢驗 (一)主要來源 黃酮類化合物(flavonoids)是以2-苯基色原酮為母核的一類物質(zhì)，指兩個苯環(huán)(a環(huán)、b環(huán))之間以一個三碳鏈(c環(huán))聯(lián)接而成的一系列化合物，其骨架可用c6-c3-c6表示。其中c環(huán)部分可以是脂鏈，也可以與b環(huán)部分形成六元或五元的氧雜環(huán)。普通黃酮類化合物按照c環(huán)的結(jié)構(gòu)分類，主要是以c環(huán)的氧化情況和b環(huán)所銜接的位置不同可分為：黃酮及黃酮醇類、雙黃酮類、及二氫黃酮醇類、查耳酮類、黃烷醇類、花色素類、異黃酮類及其他黃酮類等。目前已知的黃酮類化合物單體已有8000多種，廣泛存在于蔬菜、水果和藥用植物中。許多植物的葉、皮、根和果實中都含有一定量的黃酮類化合物

2、。保健食品中頻繁的黃酮類化合物主要有：銀杏素(ginkgetin),槲皮素(gnercetin)、兒茶素(catechin ),葛根素(puerarin )、大豆異黃酮(soy isoflavones)等。 原花青素(procyanidins)是一大類多酚化合物的總稱，是一類有著特別分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，由不同數(shù)目的黃烷-3-醇或黃烷-3,4-二醇聚合而成。原花青素在葡萄、可可豆、山楂、番荔枝、野草莓、銀杏、花生等植物中含量豐盛。早在20世紀(jì)50年月法國科學(xué)家就發(fā)覺可以從松樹皮中提取大量原花青素，其原花青素含量達(dá)85%,70年月則發(fā)覺葡萄籽提取物中原花青素含量可高達(dá)95%，是提取原花青素更好的

3、資源。目前討論最多的是葡萄籽和葡萄皮中的原花青素。 (二)理化性質(zhì) 黃酮類化合物多為結(jié)晶性固體，少數(shù)為無定型粉末。因為其母核內(nèi)形成交錯共軛體系，并通過電子轉(zhuǎn)移、重排，使共軛鏈延伸，因而展現(xiàn)不同的色彩。黃酮類化合物因分子中多具有酚羥基而顯酸性。其溶解度因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)(糖苷和苷元)不同而有很大差異。普通游離苷元不溶或難溶于水，易溶于甲醇、等有機(jī)溶劑及稀堿水溶液中。自然黃酮類化合物多以苷類形式存在，黃酮苷普通易溶于水、乙醇等極性強(qiáng)的溶劑中，難溶或不溶于苯、等有機(jī)溶劑中。有些黃酮類化合物在紫外光照耀下產(chǎn)生不同色彩的熒光。黃酮類化合物能與多種金屬離子，如鋁離子、鎂離子、鉛離子或鋯離子等發(fā)生協(xié)作生成有色

4、的協(xié)作物。 原花青素為白色粉末，溶于水、乙醇、甲醇、，不溶于乙醚、苯等，在280nm波特長有強(qiáng)汲取，在酸性溶液中加熱可降解和氧化形成花青素(anthocyanidin),花青素亦稱花色素。 (三)保健功能 黃酮類化合物含有多個酚羥基使其具有很強(qiáng)的還原性，許多黃酮類化合物已被證明有很強(qiáng)的清除活性氧自由基的能力，是自然抗氧化劑。黃酮類化合物還具有抗感染、調(diào)整免疫作用；具有降血脂和總膽固醇的作用，可顯然提高載脂蛋白a等抗動脈硬化成分含量；還通過抗細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、干預(yù)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)錄等表現(xiàn)出顯著的抑制腫瘤作用。 (四)分析辦法 黃酮化合物的測定主要有紫外可見分光光度法、熒光分光光度法、氣相色譜

5、法和高效液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法及示波極譜法等。 保健食品中總黃酮含量的測定，常用的是紫外或可見分光光度法，其操作簡便、迅速。通常有兩種辦法，一是將樣品提取液挺直在360nm波特長測定吸光度值，是目前我國“保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范”推舉辦法。二是在樣品提取液中加入顯色劑()后生成紅色協(xié)作物，最大汲取峰向長波長移動，與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。后者抗干擾能力較強(qiáng)，特異性好。 大豆異黃酮包括游離型苷元和結(jié)合型糖苷兩類共12種，大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、大豆黃素和大豆黃苷是其中比較重要的化合物，通常采納高效液相色譜法測定其含量。 原花青素的測定普通采納分光光度法、hplc法、hplc-

6、ms等。正丁醇-鹽酸法對原花青素化學(xué)結(jié)構(gòu)的依靠性比較大，不相宜低聚原花青素的測定。在香草醛-硫酸法中，的加入會引起反應(yīng)體系放熱，從而導(dǎo)致原花青素的氧化分解，而使測定結(jié)果偏低。香草醛-鹽酸法對原花青素的測定具有特異性，特殊是對于類物質(zhì)測定效果較好，但因為葡萄籽的來源不同，因此，所用鹽酸、香草醛的濃度、顯色時光、溫度也不同。鐵鹽催化分光光度法操作簡便，是目前我國“保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范”的推舉辦法。 二、保健食品中總黃酮檢驗 (一)分光光度法 1原理保健食品中的總黃酮用乙醇超聲波提取，聚酰胺粉吸附柱分別凈化，用苯洗脫雜質(zhì)后，總黃酮用甲醇洗脫，以蘆丁為對比品，于360nm波特長測定吸光度值，標(biāo)準(zhǔn)

7、曲線法比色定量。 2分析步驟稱取一定量的試樣，加乙醇定容，搖勻后，超聲波提取。吸取上清液加聚酚胺粉吸附，于水浴上揮去乙醇，然后轉(zhuǎn)入層析柱。先用苯洗脫雜質(zhì)，然后用甲醇洗脫總黃酮，收集甲醇洗脫液，定容。 于360nm波特長測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中總黃酮的含量。 3辦法解釋取樣前應(yīng)盡可能研磨至細(xì)，才干達(dá)到較好的提取效果。凈化不時用的聚酸胺吸附劑有3060目和1430目兩種粒度，不同粒度的聚酞胺吸附效果有差異。因此，在測定時，應(yīng)采納同一規(guī)格的聚酰胺粉。 (二)鋁協(xié)作物分光光度法 1原理黃酮類化合物中的3-羥基、4-羥基、5-羥基、4-羰基或鄰二位酚羥基，在堿性條件下

8、，可與a13+ 生成紅色協(xié)作物，于510nm波特長測定吸光度值，與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。 2分析步驟 (1)樣品處理：對于固體樣品，稱取一定量樣品，加入回流提取，過濾，用乙醚洗滌濾渣。將濾渣中乙醚揮干，加入80乙醇回流，過濾，用熱水洗滌濾渣，合并濾液，冷卻定容。 對于液體樣品(含酒精的液體樣品，先于水浴上揮去乙醇，用水補(bǔ)足至樣品原始體積)，精密吸取一定量樣品，用乙醚萃取脫脂、脫色素，樣液供測定。 (2)測定：取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)用法液和樣品提取液分離加30乙醇。在標(biāo)準(zhǔn)系列和樣液中加5%nano2溶液，搖勻，再加入10%al (no3)3溶液，搖勻后加4%naoh溶液搖勻，放置1020分鐘，于510nm波

9、特長測定吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中總黃酮的含量。 3辦法解釋 (1)nano2濃度在2%8范圍內(nèi)吸光度相對穩(wěn)定，因此，采納nano2濃度為5%。 (2)隨al(no3)3溶液濃度的增強(qiáng)吸光度值上升，當(dāng)濃度在8%12時，吸光度值相對穩(wěn)定，故選用10%al(no3)3。 (3)顯色后，在室溫低于25的環(huán)境中，吸光度值在2小時內(nèi)保持穩(wěn)定。 三、保健食品中大豆異黃酮檢驗 1原理保健食品中的大豆異黃酮(包括大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、大豆黃素和大豆黃苷)經(jīng)制備、提取、過濾等前處理后，采納梯度洗脫，c18柱分別，紫外檢測器檢測。按照色譜峰的保留時光定性，峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。 2分析步驟

10、 (1)樣品處理：精確稱取適量粉碎、混勻的固體試樣或混勻的液體樣品，加入適量甲醇，超聲提取20分鐘，然后用甲醇定容，混勻，上清液經(jīng)0.45um濾膜過濾后備用。 (2)測定：色譜條件為反相c18柱(250mm×4.6mm, 5um)；檢測波長：260nm；流淌相：a液為,b液為磷酸水溶液(ph=3)；梯度洗脫：010分鐘，12%a+88%b18%a+82%b;1023分鐘，18%a+82%b24%a+76%b; 2330分鐘，24%a+76%b30%a+70%b; 3055分鐘，30%a+70%b80%a+20%b ; 5560分鐘，80%a+20%b12%a+88%b；柱溫：30；流

11、速：1ml/min。 取大豆異黃酮的混合標(biāo)準(zhǔn)用法液和試樣凈化液舉行高效液相色譜分析，以保留時光定性，用峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，分離計算試樣中的大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、大豆黃素和大豆黃苷的含量和大豆異黃酮的總量。3辦法解釋本辦法適用于以大豆異黃酮為主要功效成分的保健食品及保健食品原料中大豆異黃酮的含量測定。 四、保健食品中原花青素檢驗 (一)鐵鹽催化分光光度法 1原理原花青素經(jīng)熱酸處理，并在硫酸鐵銨的催化作用下，水解生成紅色的花青素(花色素)。在最大汲取波長546nm處測定吸光度值，計算試樣中原花青素含量。 2分析步驟對于固體試樣，精確稱取研細(xì)、混勻的試樣，加入，超聲波提取，甲醇定容

12、，搖勻，離心后取上清液備用。 對于含油試樣，用甲醇分?jǐn)?shù)次攪拌洗滌，直至甲醇提取液無色，加甲醇定容備用。對于口服液，吸取適量樣液，甲醇定容，搖勻供分析用。 用甲醇配制原花青素標(biāo)準(zhǔn)系列。將與鹽酸按95：5的體積比混合后，加入硫酸鐵銨溶液，再加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液或樣液，混勻，置沸水浴回流，精確加熱40分鐘后，立刻置冰水中冷卻，于546nm波特長測定吸光度值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。 3辦法解釋 (1)原花青素水解氧化為花色素，水解程度隨溫度的上升而增大，在100時達(dá)到最大值。該反應(yīng)隨加熱時光的增長，花色素含量增強(qiáng)，當(dāng)加熱40分鐘時，花色素含量達(dá)到最大值，所以應(yīng)嚴(yán)格控制水解的溫度和時光。 (2)硫酸鐵銨起催化劑

13、的作用，未用法鐵鹽與用法鐵鹽相比，樣品的測定值降低近40%。 (3)本法最低檢出量為3 ug，最低檢出濃度為3ug/ml，最佳線性范圍：3150ug/ml。 (二)高效液相色譜法 1原理在酸性條件下，將試樣中原花青素單體或聚合物加熱水解使c-c鍵斷裂生成深紅色的花色素離子，用高效液相色譜-紫外可見檢測器舉行檢測，以保留時問定性，峰高或峰面積定量。 2.分析步驟 (1)樣品處理：對于固體試樣，加入甲醇超聲波提取，用甲醇定容，取上清液備用。對于液體試樣，吸取適量樣液，加甲醇定容。對于含油試樣，用少量二氯甲烷使試樣溶解，加甲醇定容，搖勻。 (2)測定：色譜條件為c18色譜柱(150mm×4.6mm)；柱溫：35；紫外