試驗(yàn)二熒光顯微鏡的基本使用方法

1、實(shí)驗(yàn)二 熒光顯微鏡的基本使用方法熒光顯微術(shù)是在細(xì)胞或組織水平上對(duì)生物大分子進(jìn)行定位和動(dòng)態(tài)觀察的最常用的實(shí)驗(yàn) 方法。它廣泛地應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)胞骨架、激素、離子等多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)或物 質(zhì)的定位和功能分析。 很多生命科學(xué)的研究工作都需要頻繁地使用熒光顯微鏡。 比如， 采用 熒光探針的原位分子雜交用于確定某個(gè)基因在組織中的表達(dá)或在染色體上的定位（ Polak et al. 1999; Andreeff and Wiley-Liss 1999 ），綠色熒光蛋白基因（ gfp ）用于了解某個(gè)基因產(chǎn)物在 組織和細(xì)胞中的特異性分布（ Chalfie et al. 1994; Haseloff and

2、 Amos 1995 ）等等。然而，在我 們接觸的一些低年級(jí)研究生中， 一些同學(xué)并沒有很好地掌握熒光顯微鏡的基本原理和使用方 法。他們拍攝的熒光顯微照片往往不能滿足國(guó)際性高水平學(xué)術(shù)刊物的要求。 這種狀況既不利 于科研效率的提高， 也限制了研究成果的發(fā)表。 因此， 了解熒光顯微術(shù)中的一些基本原理和 注意事項(xiàng)、掌握熒光顯微鏡的基本使用方法是非常重要和有意義的。本實(shí)驗(yàn)講解熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和使用方法。要求學(xué)生通過(guò)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì) DNA 的 熒光顯微顯示以及轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因擬南芥根、 莖、葉細(xì)胞的觀察掌握熒光顯微術(shù)的基本 原理和注意事項(xiàng)，熟練掌握熒光顯微鏡的使用方法。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?. 了解熒光顯微鏡

3、的基本結(jié)構(gòu)；2. 掌握熒光顯微術(shù)的基本原理和注意事項(xiàng)；3. 掌握核酸的熒光顯示技術(shù)，直觀地認(rèn)識(shí)細(xì)胞質(zhì) DNA 的存在；4. 了解綠色熒光蛋白（GFP）在蛋白質(zhì)定位等研究中的應(yīng)用，直觀地認(rèn)識(shí)GFP的熒光顯微效果。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1. 熒光顯微鏡的基本原理和結(jié)構(gòu)熒光顯微鏡的放大成像原理與普通透射光顯微鏡完全相同。 不同的是熒光顯微鏡需要另 外的激發(fā)光光源和光路。 因此， 只要加上激發(fā)光光源和光路， 再換上允許激發(fā)光通過(guò)的目鏡 （熒光顯微鏡的目鏡在透鏡玻璃的材質(zhì)上與普通透射光顯微鏡不同），一臺(tái)普通的透射光顯微鏡就可以被升級(jí)成一臺(tái)熒光顯微鏡了。 圖 2是本實(shí)驗(yàn)室使用的熒光顯微鏡的實(shí)物照片。與實(shí)驗(yàn)一使用的普通

4、透射光顯微鏡相比， 我們很容易找到熒光顯微鏡上多出來(lái)的部分。 這些就 是熒光顯微鏡的激發(fā)光光源和光路。圖 1 是常用的落射式熒光顯微鏡的激發(fā)光光源和光路示意圖。 所謂落射式是指激發(fā)光自 上而下穿過(guò)物鏡， 繼而照射材料頂面的激發(fā)方式。 這種激發(fā)方式可以得到較清晰的熒光圖像。 與之相對(duì)應(yīng)的是透射式熒光顯微鏡。 由于圖像效果不如落射式， 透射式熒光顯微鏡目前已很 少使用。w.熒光顯微鏡光路蟆式國(guó)件。它的特點(diǎn)是完全反射某個(gè)特定波段的激發(fā)光,在熒光顯微鏡的光源和光路中，最重要 的部分為 汞燈（卩、激發(fā)光擋片、激發(fā)濾色鏡 和分色鏡（見圖1、2）。汞燈發(fā)出高亮度的 全色光，是熒光顯微鏡的激發(fā)光光源。激發(fā)光擋

5、片用于適時(shí)地切斷激發(fā)光光路（如圖 1B），以減少樣品的熒光淬滅。激發(fā)濾色鏡是一些單色光濾鏡，用于從汞燈的全色光中 濾出激發(fā)樣品所需要的單色光。在具體的實(shí) 驗(yàn)研究中，樣品往往需要用不同的熒光物質(zhì) （染料）進(jìn)行標(biāo)記或染色，而不同的熒光物 質(zhì)可能需要不同波長(zhǎng)的激發(fā)光。因此，使用 熒光顯微鏡時(shí)需要根據(jù)樣品上標(biāo)記的熒光 染料的激發(fā)要求更換激發(fā)濾色鏡。一般的科 研用熒光顯微鏡至少需要配備三套激發(fā)濾 色鏡，即紫外光、蘭光和綠光激發(fā)濾色鏡。 分色鏡是保證熒光顯微成像質(zhì)量的關(guān)鍵部 而允許該波段以外的光，如樣品上的熒光信號(hào)自由通過(guò)（如圖1A）。分色鏡的這種特性保證了只有樣品熒光進(jìn)入目鏡光路。由于一種分色鏡只反射特

6、定波段的一種激發(fā)光，所以在熒光顯微鏡的使用過(guò)程中它也必須隨著激發(fā)濾色鏡的更換而更換。在一些廠家生產(chǎn)的熒光顯微鏡上，分色鏡和激發(fā)濾色鏡被做成了一個(gè)一鍬發(fā)光把聲（=&«）體式的組件（如本實(shí)驗(yàn)使用的顯微鏡，見圖2），以減少分別更換的麻煩。2.熒光顯微術(shù)的但它們的實(shí)驗(yàn)用圖N熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)基本原理和注意事項(xiàng)盡管熒光顯微鏡與普通透射光顯微鏡外觀相近且共用同一套成像光路，途完全不同。透射光顯微鏡用于觀察細(xì)胞或組織的結(jié)構(gòu)，而熒光顯微鏡則用于檢測(cè)細(xì)胞或組織中特定的物質(zhì)，如核酸、蛋白質(zhì)等生物分子的存在和分布。因此，熒光顯微術(shù)實(shí)際上是一種化學(xué)檢測(cè)手段。它的原理是讓細(xì)胞或組織中的特定分子帶上熒

7、光，我們通過(guò)觀察熒光信號(hào)來(lái)確定這種分子的存在和分布。雖然熒光顯微鏡與普通透射光顯微鏡的分辨率是一樣的（W0.2呵），但由于熒光可以增強(qiáng)被標(biāo)記分子的光學(xué)信號(hào)，加上熒光顯微術(shù)的強(qiáng)反差特性，一 些在透射光下無(wú)法觀察到的分子組分， 如由微管蛋白、 肌動(dòng)蛋白組成的細(xì)胞骨架等在熒光顯 微鏡下就可以被清楚地顯現(xiàn)出來(lái)?？梢?，利用熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)時(shí)， 最首要的條件是要讓被檢測(cè)的組分 “亮起來(lái)”。 在個(gè)別種類的細(xì)胞中， 一些特定的分子， 如植物葉綠體中的葉綠素、 花粉壁中的孢粉素等分 子在常見的藍(lán)色激發(fā)光下就可以發(fā)出持久、 穩(wěn)定的熒光。 因此， 檢測(cè)這類分子只需要把細(xì)胞 放到熒光顯微鏡下觀察即可。 這種除

8、提供必要的激發(fā)光外不需要任何處理， 物質(zhì)自身可以直 接發(fā)出的熒光被稱為 自發(fā)熒光 。然而，絕大多數(shù)生物分子并不具備給出自發(fā)熒光的特性。要想觀察和檢測(cè)這些分子，必 須通過(guò)人為的操作給這些分子帶上熒光。 這個(gè)過(guò)程被稱為熒光標(biāo)記。 少數(shù)生物分子由于其分 子上特殊的結(jié)構(gòu)， 很容易與一些可以被激發(fā)出熒光的小分子化合物形成緊密的結(jié)合。這種結(jié)合為熒光標(biāo)記提供了一種簡(jiǎn)便的途徑。 比如， 細(xì)胞中重要的大分子物質(zhì)核酸具備與小分子熒 光化合物溴化乙錠直接結(jié)合的特點(diǎn)。 這種結(jié)合為核酸的熒光標(biāo)記提供了直接的標(biāo)記分子。 我 們把熒光標(biāo)記分子與細(xì)胞組分直接結(jié)合而使細(xì)胞組分帶上的熒光稱為直接熒光 。除了溴化乙錠以外，可以與核

9、酸直接結(jié)合的熒光小分子化合物還有很多。比如熒光顯微 術(shù)中常用的 DAPI 、YO-PRO-1 以及 SYBR Green 1 等等（2）。這些熒光小分子化合物通常具 有較強(qiáng)的核酸結(jié)合特性并能發(fā)出足夠強(qiáng)度的熒光。 我們可以根據(jù)它們的不同特點(diǎn)， 如激發(fā)光 和熒光的波長(zhǎng)、對(duì) DNA 和 RNA 的選擇結(jié)合能力以及抗淬滅特點(diǎn)等進(jìn)行選擇使用。利用自發(fā)熒光和直接熒光進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)組分定位的實(shí)驗(yàn)方法非常簡(jiǎn)單。在細(xì)胞生物學(xué)的研究中， 絕大部分細(xì)胞組分， 如細(xì)胞內(nèi)各種功能不同的蛋白質(zhì)等既不能發(fā)出自發(fā)熒光，也不能與熒光小分子化合物結(jié)合。在這種情況下，需要制備待檢測(cè)蛋白質(zhì)的抗體（一級(jí)抗體），使之與細(xì)胞內(nèi)的待檢測(cè)蛋白結(jié)合

10、后， 再用藕聯(lián)有熒光素的二級(jí)抗體去標(biāo)記一級(jí)抗體。這種方法被稱作 間接熒光法 。具體的實(shí)驗(yàn)操作見后面的實(shí)驗(yàn)四。 理論上間接熒光法可以用于細(xì)胞內(nèi)所 有蛋白質(zhì)的檢測(cè)和定位。上面已經(jīng)提到了熒光的淬滅。在熒光顯微術(shù)中，所有的熒光染料或熒光素都會(huì)發(fā)生淬滅 現(xiàn)象。 它表現(xiàn)為細(xì)胞上的標(biāo)記熒光信號(hào)在最初開啟激發(fā)光的時(shí)候強(qiáng)度較高，明顯易見， 而隨著觀察（激發(fā)光照射）時(shí)間的延長(zhǎng)，信號(hào)逐漸減弱甚至完全消失。顯然，淬滅現(xiàn)象不利于實(shí) 驗(yàn)結(jié)果的詳細(xì)觀察和記錄。 我們因此必須盡量減少樣品上熒光信號(hào)的淬滅。一些有機(jī)化合物具有延緩淬滅的作用， 被稱為淬滅保護(hù)劑。 在熒光染液或樣品的封片緩沖液中適量添加淬滅 保護(hù)劑可以在一定程度上

11、延緩淬滅。 但實(shí)際上良好的熒光顯微觀察操作習(xí)慣對(duì)于減少信號(hào)的 淬滅更為有效。首先，熒光的淬滅與激發(fā)光的照射時(shí)間成正比。因此，我們應(yīng)該盡量減少觀察時(shí)間外激 發(fā)光對(duì)樣品的照射。 在本實(shí)驗(yàn)使用的熒光顯微鏡的左側(cè)有一個(gè)激發(fā)光擋片調(diào)節(jié)柄（見圖 2）。利用該調(diào)節(jié)柄可以完全阻斷激發(fā)光光路。 在正式觀察樣品之前， 激發(fā)光光路應(yīng)該處于完全阻 斷狀態(tài)。否則， 在我們將樣品放到載物臺(tái)上， 移動(dòng)樣品臺(tái)將樣品調(diào)整到物鏡位置， 找到要觀 察的細(xì)胞并進(jìn)行調(diào)焦的過(guò)程中， 樣品上的熒光可能已經(jīng)發(fā)生了相當(dāng)程度的淬滅。 為了避免觀 察前不必要的淬滅， 上述一系列操作需要在透射光源下進(jìn)行。 此外， 當(dāng)眼睛離開物鏡進(jìn)行記規(guī)范錄或?qū)@微

12、鏡交給合作實(shí)驗(yàn)者觀察時(shí)，要隨手阻斷激發(fā)光光路。實(shí)踐結(jié)果表明，熟練、 和合理的觀察操作可以將樣品淬滅對(duì)觀察和記錄造成的影響降低到最小限度。另外，熒光信號(hào)的淬滅還與激發(fā)光的強(qiáng)度成正比。因此，在可以觀察到熒光信號(hào)的情況 下，應(yīng)該盡量降低激發(fā)光的強(qiáng)度。這樣做還有利于降低背景（利用拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)非常 重要）。在本實(shí)驗(yàn)使用的熒光顯微鏡的右側(cè)還有一個(gè)激發(fā)光擋片調(diào)節(jié)柄（見圖2），用于部分阻斷激發(fā)光。激發(fā)光的強(qiáng)度降低后，樣品的淬滅時(shí)間可以得到有效的延長(zhǎng)。3.細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì) DNA的直接熒光染色和觀察本實(shí)驗(yàn)選用 Y0-PR0-1（3）作為熒光染料檢測(cè)迎春花成熟花粉（4）細(xì)胞中的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)DNA。前面說(shuō)過(guò)，

13、可用于 DNA熒光標(biāo)記的染料很多。本實(shí)驗(yàn)選用Y0-PR0-1的原因有兩條：1）其激發(fā)波長(zhǎng)（491 nm蘭光）與顯微鏡配置的濾鏡系統(tǒng)相符；2）其熒光不易淬滅。S ul A NF| S ul YO-PRO-1掛入花粉一 Q%B33.理春花花扮細(xì)胞的坯.片廉色法實(shí)驗(yàn)按下述方法（參見圖 3）操作：1）取 一干凈的載玻片，在其中央同一位置滴置濃度 為1ug/ml的Y0-PR0-1和3%的戊二醛各 5ul ； 2）用小鑷子從迎春花中取一個(gè)花藥，將適量 花粉（約100粒）抖入載片上的液滴；3）輕蓋蓋玻片，盡量避免封入氣泡；4）用拇指透過(guò)雙層濾紙用力推壓該片；5）5分鐘后在蘭色激發(fā)光下觀察。上述操作的意圖是讓

14、新鮮花粉在推壓力 量的作用下瞬間朝一個(gè)（推壓）方向破裂，其 中的花粉細(xì)胞在涌出花粉的同時(shí)被壓成一個(gè) 薄層并同時(shí)被固定和染色。操作方法雖然簡(jiǎn)單， 但要得到理想的制樣結(jié)果必須注意下面的要 點(diǎn)。第一，細(xì)胞質(zhì) DNA量少且布局分散，需 要將細(xì)胞質(zhì)制備成足夠薄的薄層（理論上接近于線粒體的直徑最為理想）時(shí)才能清楚地觀察到其中線粒體、質(zhì)體 DNA的熒光信號(hào)。這是在熒光顯微鏡下能否觀察到細(xì)胞質(zhì)DNA的關(guān)鍵。因此，每次制片不宜取過(guò)多數(shù)量的花粉，否則其對(duì)蓋片的支撐力較大，不易制備出足夠薄的薄層樣品?；陬愃频脑?，蓋片與載片之間的花粉宜分散不宜成堆。第二，用力推壓的目的是讓花粉朝一個(gè)方向裂開并形成細(xì)胞質(zhì)薄層。如果

15、推壓的用力方向不明顯 （豎直施壓）則花粉會(huì)在其四周發(fā)生多個(gè)小破口，導(dǎo)致花粉細(xì)胞質(zhì)四分五裂，不易觀察到典型的花粉細(xì)胞。第三，盡管推壓必須用力且拇指需要在濾紙隔層上橫向滑動(dòng)，但推壓過(guò)程中一定不要使蓋片和載片之間產(chǎn)生滑動(dòng)，否則花粉細(xì)胞質(zhì)會(huì)破碎變形，導(dǎo)致制樣失敗。迎春花的成熟花粉由一個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和兩個(gè)精細(xì)胞組成。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)散開后占據(jù)很大面積，其細(xì)胞核性狀不規(guī)則且熒光較弱。 兩個(gè)精細(xì)胞呈長(zhǎng)條狀， 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有明顯的點(diǎn)狀熒 光，即細(xì)胞質(zhì) DNA的熒光。仔細(xì)觀察這些熒光點(diǎn)，可以發(fā)現(xiàn)它們中有較大和較小的兩種。實(shí)驗(yàn)證明這兩種熒光亮點(diǎn)分別發(fā)自質(zhì)體和線粒體DNA （5）。如果樣品中只能看到精細(xì)胞的形狀而無(wú)法看到其

16、細(xì)胞質(zhì)中的熒光亮點(diǎn)，則說(shuō)明樣品的厚度沒有達(dá)到觀察細(xì)胞質(zhì) DNA 的“足 夠薄”的要求，需要重新制片。此時(shí)應(yīng)該注意減少花粉量或加大推壓力度。需要說(shuō)明的是， 花粉細(xì)胞質(zhì)經(jīng)一次推壓未達(dá)到“足夠薄”的厚度時(shí)，再次推壓并不能有效地使其厚度變薄。 此時(shí)只能再取新鮮花粉重新制片。4. 綠色熒光蛋白（ GFP ）轉(zhuǎn)基因擬南芥活組織和細(xì)胞的觀察綠色熒光蛋白是一種水母體內(nèi)編碼的小分子蛋白， 具有在激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光的特性。 該蛋白經(jīng)過(guò)一定的氨基酸改良后，熒光強(qiáng)度得到了明顯提高。由于綠色熒光蛋白分子量小， 通過(guò)基因操作的方法將之與動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)多數(shù)蛋白質(zhì)進(jìn)行融合后并不影響這些蛋白質(zhì)的功 能或構(gòu)象。 因此， 利用綠色

17、熒光蛋白技術(shù)理論上可以為絕大多數(shù)已知基因序列的蛋白質(zhì)提供 熒光標(biāo)記。 近年來(lái)， 綠色熒光蛋白在細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能以及基因或蛋白的功能等研究中得到 了越來(lái)越普遍的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)選用一種將綠色熒光蛋白定位到線粒體膜上的轉(zhuǎn)基因擬南芥（ 6），觀察其幼苗植株的熒光特性及線粒體在根組織不同細(xì)胞、葉肉細(xì)胞及葉表皮細(xì)胞中的分布。實(shí)驗(yàn)的操作方法如下： 1） 取一干凈的載玻片，在其中央同一位置放一大滴蒸餾水；2）用小鑷子從培養(yǎng)皿內(nèi)拔一棵 2-4 葉齡的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗， 在另一放有水的培養(yǎng)皿內(nèi)洗凈幼 苗根部的瓊脂糖后將其轉(zhuǎn)移到載片上的水滴中； 3）輕蓋蓋玻片，盡量避免封入氣泡； 4）取 一棵同樣大小的未轉(zhuǎn)基因的擬南

18、芥幼苗做對(duì)照， 按上面的方法清洗根部并封入蓋片與載片之 間的水中； 5） 用蘭色激發(fā)光，在 4 倍物鏡下觀察轉(zhuǎn)基因幼苗根莖葉上不同部位的熒光分布 情況并與未轉(zhuǎn)基因的幼苗進(jìn)行比較（為了減少淬滅，此項(xiàng)觀察要盡量快）；6）從載物臺(tái)上取下樣品放到試驗(yàn)臺(tái)上， 用拇指透過(guò)雙層濾紙垂直向下用力擠壓蓋片， 使蓋片與載片之間的擬 南芥幼苗扁平變形； 7）用 40 倍物鏡觀察幼苗根、莖和葉片細(xì)胞中線粒體的分布；8） 另取一片擬南芥葉片，用小鑷子撕取一小塊葉片表皮，以上述同樣的方法制樣，觀察表皮細(xì)胞、 氣孔保衛(wèi)細(xì)胞及附帶被撕下來(lái)的少量葉肉細(xì)胞中線粒體的分布。通過(guò)上面的觀察，請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)報(bào)告上解釋為什么整體根組織上的綠色

19、熒光在根尖處最強(qiáng)， 而離開根尖部位往上后逐漸減弱。本實(shí)驗(yàn)還要求以文字和繪圖的方式描述所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并加以適當(dāng)?shù)姆治?。參考閱讀Polak JM, McGee J, McGee JO (1999) In situ hybridization: principles and practice. Oxford University Press (2 nd edition).Andreeff M, Pinkel D (1999) Introduction to fluorescence in situ hybridisation: principles and clinical applications

20、. Wiley-Liss.Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263: 802-805.Haseloff J, Amos B (1995) GFP in plants. Trends in Genetics 11: 328-329.Sodmergen, Bai HH, He JX, Kuroiwa H, Kawano S, Kuroiwa T (1998) Potential for

21、 biparental cytoplasmic inheritanee in Jasminum officinale and Jasminum nudiflorum . Sex Plant Reprod 11: 107-112.Sodmergen, Niu JG, Li LJ, He JX, Guo FL (1999) Applieation of YO-PRO-1 as an epifluoreseent dye for in situ deteetion of small amount DNA in plant cells. J Plant Res 112: 117-122.注釋：（1）熒

22、光顯微鏡需要高亮度的全色光作為激發(fā)光光源，所以使用特制的汞燈。汞燈除了亮 度和全色光特性以外，還發(fā)出巨大的熱量。因此，在使用熒光顯微鏡的過(guò)程中，不要 用手觸摸汞燈燈室，以免發(fā)生灼傷。同時(shí)，不要用顯微鏡罩、書本、衣物等遮蓋燈室， 以避免火災(zāi)或散熱不良造成的燈泡損壞（關(guān)機(jī)后也不要馬上罩起顯微鏡）。更換燈泡時(shí)，不要用裸手直接觸摸燈泡（需配戴干凈的棉質(zhì)手套），也不能用眼睛直視亮起的燈泡。否則留在燈泡上的指紋有可能導(dǎo)致燈泡散熱不勻而爆炸；亮起的燈泡也可能造 成眼底灼傷。此外，汞燈燈泡價(jià)格昂貴，且平均壽命只有200小時(shí)。因此在確認(rèn)不再使用熒光顯微鏡時(shí)應(yīng)及時(shí)把汞燈光源關(guān)掉。但由于開關(guān)次數(shù)同樣與燈泡的壽命直接相 關(guān)，在關(guān)掉公共實(shí)驗(yàn)室的熒光顯微鏡光源前應(yīng)確認(rèn)已無(wú)他人繼續(xù)使用。關(guān)掉光源或斷 電等造成光源意外關(guān)閉后，需等待至少15分鐘方可重新開啟光源。（2 ）核酸的熒光染料或與核酸緊密結(jié)合的