木豆葉總黃酮測定方法的比較研究

1、植物研究2011,31(4:499 502Bulletin of Botanical Research基金項目:林業(yè)公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目(201004040;科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2009GB23600514第一作者簡介:趙恩澤(1988,男,碩士研究生,從事植物藥有效成分提取研究。*通訊作者:E-mail :fuyujie1967yahoocomcn 收稿日期:20110315木豆葉總黃酮測定方法的比較研究趙恩澤1,2金時1,2魏作富1,2魏巍1,2付玉杰1,2*(1東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室,哈爾濱150040;2東北林業(yè)大學(xué)林業(yè)生物制劑教育部工程研究中心,

2、哈爾濱150040摘要采用比色法測定木豆葉中的總黃酮含量。對三氯化鋁比色法、硼酸檸檬酸比色法和硝酸鋁比色法3種測定方法進行比較,確定了硝酸鋁比色法為木豆葉總黃酮的最佳測定方法,該方法穩(wěn)定性、精密度和重現(xiàn)性好,其RSD 分別為21%、09%和23%,應(yīng)用該方法測定木豆葉總黃酮含量為1565mg g 1DW 。本方法適用于木豆葉或其制劑中總黃酮的質(zhì)量分析檢驗,為木豆葉中黃酮的研究開發(fā)提供了質(zhì)控依據(jù)。關(guān)鍵詞木豆葉;總黃酮;比色法中圖分類號:S5672文獻標識碼:A文章編號:16735102(201104049904Comparison of the Determination Methods for

3、 TotalFlavonoids in Pigeon Pea LeavesZHAO En-Ze 1,2JIN Shi 1,2WEI Zuo-Fu 1,2WEI Wei 1,2FU Yu-Jie 1,2*(1Key Laboratory of Forest Plant Ecology of Northeast Forestry University ,Ministry of Education ,Harbin 150040;2Engineering Research Center of Forest Bio-preparation ,Ministry of Education ,Northeas

4、t Forestry University ,Harbin 150040Abstract AlCl 3,boric acid-citric acid-and Al (NO 3-based colorimetric assays were compared to determine the total flavonoids in pigeon pea leavesThe results indicated that Al (NO 3colorimetric assay was the most ap-propriate for the determination of total flavono

5、ids in pigeon pea leavesThe stability ,precision and repeatabilitywere very good ,with RSD being 21%(n =3,09%(n =3and 23%(n =5,respectivelyThe content of total flavonoids in pigeon pea leaves was 1565mg g 1DWThe method is appropriate for the quantitative de-termination of total flavonoids in pigeon

6、pea leaves and their preparationsIt can be referenced for the quality control of pigeon pea leavesKey words pigeon pea leaves ;total flavonoids ;colorimetric assay 木豆(Cajanus cajan (LMillsp系豆科(Le-guminosae 木豆屬(Cajanus 木本植物,廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū),其葉具有重要的藥用價值,在國內(nèi)外的民間醫(yī)藥中用于鎮(zhèn)痛、肝炎、結(jié)石、黃疸、小兒水痘和糖尿病等癥1 2。在現(xiàn)代醫(yī)藥中以木豆葉為單味

7、藥的通絡(luò)生骨膠囊具有活血祛瘀,通絡(luò)生骨的功效,已在臨床應(yīng)用20多年3。藥理學(xué)調(diào)查顯示木豆葉中有效活性成分主要是黃酮類和芪類化合物等4 5。其中,木豆葉中黃酮類化合物種類繁多、難于獲得全部對照品限制了單一組分含量的測定,因此總黃酮含量已成為評價木豆葉藥用質(zhì)量的重要標準。目前分光光度比色測定總黃酮的方法以其操作簡單、結(jié)果準確可靠等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中的質(zhì)量控制,并已被各國藥典收錄。但是,不同藥用植物黃酮類組成不同,其適宜的測定方法也有所區(qū)別,比如土茯苓中總黃酮適宜采用以蘆丁為對照品的三氯化鋁比色法測定6、硼酸檸檬酸法測定苦蕎中總黃酮的精確度最佳7,而衛(wèi)矛中總黃酮則適宜采用硝酸鋁比色法測定8。對于

8、木豆葉中總黃酮的研究,僅劉中秋等9以牡荊苷為對照品采用硝酸鋁比色法對生脈成骨片中木豆葉總黃酮提取工藝進行優(yōu)化,所得結(jié)果適合以碳苷類為主的總黃酮測定(其含量為086mg g 1。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)木豆葉中除黃酮碳苷類外,還含有大量的黃酮氧苷和苷元類活性成分,因此,建立一種具有指導(dǎo)意義的木豆中總黃酮測定方法是必要的。本文通過比較三氯化鋁比色法、硼酸檸檬酸比色法和硝酸鋁比色法并對硝酸鋁比色法進行改進,以期為測定木豆葉總黃酮含量建立準確、快捷、簡便的方法,并為木豆葉質(zhì)量控制提供依據(jù)。1材料與方法11材料與主要儀器木豆葉2010年9月采自海南省東方市人工種植基地,當(dāng)年生,三出復(fù)葉,葉片卵狀披針形,全緣,

9、陰干后帶回室內(nèi)保存?zhèn)溆谩Q-250DE型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司;紫外/可見分光光度計(2550型,日本Shimadzu公司;RE-52D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠;SHB-循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司。12方法121樣品溶液的制備取木豆葉樣品,置于60烘干,粉碎,備用。精確稱取木豆葉粉末1000g,置于250mL錐形瓶中,加入50%乙醇100mL,在超聲波功率250W、溫度50 65條件下超聲提取30min3次。提取液合并,濃縮至一定體積,用等體積的石油醚連續(xù)萃取3次,脫脂,萃取后得到的水相濃縮至干,35%甲醇溶出,用045m微孔濾膜過濾,備用。1223種比

10、色法標準曲線建立及樣品測定精確稱取蘆丁和牡荊苷對照品1000mg,置于10mL容量瓶中,用無水甲醇溶解,混勻,定容,使之成為濃度為100mgmL1的溶液作為對照品儲備液。精密吸取對照品溶液00、01、02、0.3、04、05mL或樣品溶液1mL分別置10mL容量瓶中,各加01molL1三氯化鋁溶液2mL,1 molL1醋酸鉀溶液3mL,加甲醇至刻度,混勻,靜置30min,于420nm波長處測定吸光值。分別吸取對照品溶液00、01、02、03、04、05 mL或樣品溶液2mL,置于25mL容量瓶,加入等體積混合的10%檸檬酸丙酮液08%硼酸顯色液5 mL,丙酮定容至刻度后,于400nm處測定吸光

11、值。精密量取對照品溶液00、01、02、03、04、05mL或樣品溶液1mL,分別置于10mL量瓶中,加10%亞硝酸鈉溶液03mL,混勻,靜置6min;加10%硝酸鋁溶液03mL,混勻,靜置6min;加1molL1氫氧化鈉溶液4mL,加35%乙醇至刻度,混勻,靜置15min,于510nm處測定吸光值。以上述3種方法測定的對照品吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線。123穩(wěn)定性實驗取已制備樣品3份按三氯化鋁比色法、硼酸檸檬酸比色法和硝酸鋁比色法操作步驟,顯色后過濾,溫室放置0、10、20、30min、1h和3h,測定樣品溶液的吸光值,并計算RSD。124精密度和重現(xiàn)性實驗取已制備樣品9份,

12、分成3組,分別按3種比色法操作步驟顯色后過濾,測定其吸光度,每個樣品測定5次。125加樣回收率實驗取已制備樣品9份,分成3組,各加適量的對照品蘆丁,分別按3種比色法操作步驟顯色后過濾,測定其吸光度,并計算出加樣回收率。2結(jié)果與分析213種比色法標準曲線的建立以蘆丁和牡荊苷對照品配置成不同梯度濃度,每個濃度重復(fù)測定三次,取吸光值平均值,以對照品濃度(mgmL1為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線,以最小二乘法作線性回歸處理,得回歸方程分別為(A為吸光度,C為濃度mgL1:三氯化鋁比色法蘆丁與牡荊苷的標準曲線分別為:A=20575C+0009,R2=0997;A= 13.142C+0006,R2=

13、0999。硼酸檸檬酸比色法標準曲線:A=24670C+0007,R2=0999;A= 18277C0001,R2=0997。硝酸鋁比色法標準曲線:A=15877C0009,R2=0999;A= 12.249C+00032,R2=0994。3種方法的相關(guān)系數(shù)R2表明標準曲線在對照品濃度范圍內(nèi)線性良好。22樣品前處理對測定結(jié)果的影響3種比色法測定木豆葉中總黃酮含量如圖1所示,不同比色法和對照品過濾前后測得的結(jié)果不同。其中,硝酸鋁比色法的測量值最大,其次是三氯化鋁比色法,最小為硼酸檸檬酸比色法,因為三氯化鋁和硼酸檸檬酸比色法分別對二氫黃酮醇及其黃酮苷類和含羰基的黃酮具有專一性10 11。盡管牡荊苷為

14、木豆葉中的特征性黃酮類化合物,但因其屬于碳苷類,不適合作為總黃酮分析的對照品,因此通用的蘆丁對照品仍是最適合的。在測定樣品實驗過程發(fā)現(xiàn)硝酸鋁顯色后溶液005植物研究31卷有渾濁現(xiàn)象,因此將樣品顯色后過濾再測定吸光值。過濾后三氯化鋁和硼酸檸檬酸比色法測量值變化不大,都小于3%,而硝酸鋁比色法的以蘆丁和牡荊苷為對照品測量值分別為1565和127mg g 1DW ,減小176%和150%。這是因為木豆葉中包含花色苷類和綠原酸等化合物,在堿性條件下形成沉淀出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象 。23穩(wěn)定性比較從表1中60min 內(nèi)各方法測定吸光值中三氯化鋁比色法吸光值較明顯變化RSD 值為71%,硼酸檸檬酸和硝酸鋁比色法60

15、min 吸光值無明顯變化RSD 值分別為19%和21%。表13種方法穩(wěn)定性結(jié)果Table 1Results of stability experiments of three methods方法Method時間Time (min 0103060RSD (%三氯化鋁比色法AlCl3colorimetry043704380427042171硼酸檸檬酸比色法Boric acid-citric acid colorimetry047204730470046519硝酸鋁比色法Al (NO 3colorimetry05380539053705332124精密度比較從精密度實驗計算的三氯化鋁比色法、硼酸檸檬

16、酸比色法和硝酸鋁比色法結(jié)果分別為:16%、20%和09%(表2。說明3種方法結(jié)果都在誤差范圍內(nèi),說明測定的數(shù)據(jù)均可信,但硝酸鋁比色法的效果較好,更可靠。表23種方法精密度結(jié)果Table 2Results of precision experiments of three methods樣品編號No三氯化鋁法AlCl 3硼酸檸檬酸法Boric acid-citric acid 硝酸鋁法Al (NO 3吸光值A(chǔ)bsorbance RSD (%吸光值A(chǔ)bsorbance RSD (%吸光值A(chǔ)bsorbance RSD (%104360471053520438160473200535093043404

17、68053325重現(xiàn)性比較表3數(shù)據(jù)表明,3種方法的重現(xiàn)性較好,RSD 都小于3%,在誤差范圍內(nèi),3種方法的測定的吸光值平均值分別為0435、0471和0536。表33種方法重現(xiàn)性結(jié)果Table 3Results of repeatability experiments of threemethods樣品編號No三氯化鋁法AlCl 3硼酸檸檬酸法Boric acid-citric acid 硝酸鋁法Al (NO 3吸光值A(chǔ)bsorbance RSD (%吸光值A(chǔ)bsorbance RSD (%吸光值A(chǔ)bsorbance RSD (%10436046905352044004710535304312

18、90472240540234043604680536504340475053326加樣回收率比較3種比色法加樣回收率的結(jié)果如表4,由表可知3種方法中硝酸鋁法回收率平均值為1002%,RSD 最小為16%,在誤差范圍內(nèi)說明其測定總黃酮的準確度高。表43種比色法加樣回收率結(jié)果Table 4Results of recovery experiments of three methods加入量Addition (mg 三氯化鋁法AlCl 3硼酸檸檬酸法Boric acid-citric acid 硝酸鋁法Al (NO 3回收率Recovery (%RSD (%回收率Recovery (%RSD (%回

19、收率Recovery(%RSD(%001971971985002997219873899616003102310571024從上述比較實驗可知經(jīng)過濾的硝酸鋁比色法為測定木豆葉中總黃酮的最佳方法,本法以蘆丁為對照品,紫外檢測波長為510nm ,標準曲線的相關(guān)1054期趙恩澤等:木豆葉總黃酮測定方法的比較研究系數(shù)R2=0999,在60min內(nèi)檢測穩(wěn)定,精密度相對標準偏差為09%。重現(xiàn)性實驗相對標準偏差為23%,平均加樣回收率為1002%,用本法測定木豆葉中總黃酮含量為1565mgg1DW。3結(jié)論比色法是測定總黃酮的快捷、簡便、成本較低的方法。本研究發(fā)現(xiàn)三氯化鋁比色法和硼酸檸檬酸比色法由于具有一定的

20、專屬性,在測定木豆葉中總黃酮時測定值偏小,與土茯苓12和銀雀樹葉13中總黃酮結(jié)果相似。但實驗中發(fā)現(xiàn)硝酸鋁比色法在加入反應(yīng)試劑后有渾濁現(xiàn)象,是因為花色苷和綠原酸的影響14,實驗經(jīng)過濾除去雜質(zhì)對硝酸鋁比色法進行改進,測定木豆葉中總黃酮數(shù)據(jù)準確、穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好。參考文獻1鐘小榮木豆的利用價值J中藥研究與信息,2001,3(8:472Habib M A,Anisuzzaman A S M,Khan M R I,et alChem-ical and pharmacological characterization of hypolipidemic compound from Cajanus caja

21、nJJournal of Pharmacolo-gy,2010,5:34383袁浩,賴小平,何偉,等通絡(luò)生骨膠囊的研制與開發(fā)J中國醫(yī)藥學(xué)報,2004,19:88904袁捷木豆葉及提取物用于制備骨性關(guān)節(jié)炎藥物的用途PCN:200510117299X5Amarteifio J O,Munthali D C,Kanrikari S K,et alThe composition of pigeon peas(Cajanus cajan(LMillsp grown in BotswanaJPlant Foods for Human Nutrition, 2002,57:1731776王晉黃,池汝安,陳少

22、峰,等土茯苓中提取總黃酮的工藝研究J植物研究,2006,26(3:3703737端允,薛長暉硼酸一檸檬酸法測定苦蕎粉中黃酮類化合物的含量J廣州化工,2010,38(6:1631658孫學(xué)斌,程明,李娜,等衛(wèi)矛不同有效部位總黃酮含量及抗氧化性的研究J植物研究,2007,27(5:6196219劉中秋,周華,林勵,等生脈成骨片中木豆葉提取工藝研究J中成藥1998,20(3:7910龍躍,寇嫻,程素霞,等三氯化鋁比色法測定中草藥雀兒舌頭中總黃酮研究J鄭州大學(xué)學(xué)報:工學(xué)版,2010, 31(4:11311511劉佳佳,李子騏,華輝,等硼酸檸檬酸比色法測銀杏枝葉中黃酮苷含量J食品與發(fā)酵工業(yè),2004,2

23、5(6: 424412李玉琪,李玉蓮,張莉,等赤土茯苓中總黃酮的含量測J解放軍藥學(xué)學(xué)報,2000,16(4:21121313馬柏林,梁淑芳,李飛躍銀鵲樹葉中總黃酮的提取與含量測定西北林學(xué)院學(xué)報,2005,20(3:13713914曾凡駿,陳松波,曾里,等一種改進的銀杏黃酮紫外分光光度檢測方法的研究J食品科學(xué),2004,24(11:櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰櫰102104(上接498頁11張恒慶,安利佳,祖元剛紅松RAPD實驗中各組成成分含量對實驗結(jié)果的影響J植物研究,1999,19(2: 18318812Nei MAnalysis of gene diversity in subdivided popu