淺論線粒體相關(guān)物質(zhì)與細(xì)胞凋亡

1、淺論線粒體相關(guān)物質(zhì)與細(xì)胞凋亡         【關(guān)鍵詞】  細(xì)胞凋亡;線粒體;細(xì)胞色素C;活性氧;凋亡誘導(dǎo)因子“凋亡”一詞源于希臘文，意為“花瓣或樹(shù)葉的枯落”，是1972年由病理學(xué)家Kerr等1首先提出的一個(gè)不同于壞死的死亡概念，指由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)。凋亡細(xì)胞中可出現(xiàn)各種生化改變?nèi)鐑?nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteincontaining aspartatespecific protease

2、，caspase)的激活及DNA的片段化斷裂等，其中，caspase被認(rèn)為是凋亡的主要執(zhí)行者。目前認(rèn)為凋亡主要經(jīng)過(guò)兩條死亡通路：一條是外源性通路，即死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路，此通路由死亡受體及配體系統(tǒng)激發(fā)的凋亡信號(hào)下傳至啟動(dòng)性caspase8，然后激活效應(yīng)性caspase蛋白酶而引發(fā)細(xì)胞凋亡;另一通路稱(chēng)為內(nèi)源性通路，即線粒體介導(dǎo)的凋亡通路，細(xì)胞損傷后線粒體功能障礙，膜通透性改變，凋亡蛋白包括細(xì)胞色素C(cytochromec，Cytc)、凋亡蛋白酶激活因子(apoptosis protease activation factor1，Apaf1)、caspase蛋白酶、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(apopt

3、osis induced factor，AIF)等從線粒體釋放到胞漿，隨之引起caspase瀑布式活化和細(xì)胞死亡?？梢?jiàn)，凋亡的過(guò)程復(fù)雜，涉及因素較多，其中線粒體的作用不容忽視，線粒體的結(jié)構(gòu)和功能的改變，能加速核凋亡特征的出現(xiàn)，并是控制細(xì)胞凋亡進(jìn)程的關(guān)鍵。有學(xué)者認(rèn)為線粒體在凋亡中起著中心的調(diào)控作用，在某種意義上，可以決定細(xì)胞的生存或死亡。本文綜述線粒體相關(guān)物質(zhì)：Cytc、活性氧、Bcl2蛋白家族、AIF在細(xì)胞凋亡中的作用。1 線粒體釋放Cytc與細(xì)胞凋亡Cytc由核基因編碼的多肽和線粒體編碼的亞鐵血紅素組成，定位于線粒體內(nèi)膜的外側(cè)，是線粒體呼吸鏈中傳遞電子的載體，關(guān)于它在氧化磷酸化及ATP形成中

4、的作用早已為人熟悉。1996年，得克薩斯西南醫(yī)學(xué)研究中心的王曉東小組最先提出了Cytc在細(xì)胞凋亡中的重要作用，之后的研究又證實(shí)Cytc基因敲除的細(xì)胞對(duì)凋亡具有明顯的耐受性?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為Cytc從線粒體到達(dá)胞漿是多種細(xì)胞凋亡的共同途徑。在細(xì)胞凋亡出現(xiàn)特征性的核改變之前，均觀察到線粒體跨膜電位(m)的下降。m是由線粒體內(nèi)膜兩側(cè)電子的不對(duì)稱(chēng)分布形成的，正常的m是細(xì)胞生存所必需的。m下降說(shuō)明線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)開(kāi)放，線粒體膜通透性升高，此時(shí)水和小分子物質(zhì)可自由通過(guò)，水和溶質(zhì)內(nèi)流導(dǎo)致線粒體腫脹。由于線粒體內(nèi)

5、膜向腔內(nèi)形成嵴，延展性相對(duì)較大，內(nèi)膜面積大于外膜，故水腫后外膜先破裂，位于膜間隙的Cytc便釋放入胞漿。Cytc釋放到細(xì)胞漿中后其血紅素亞鐵位點(diǎn)發(fā)生亞硝基化修飾，這種修飾有利于Cytc與Apaf1的結(jié)合，經(jīng)亞硝基化修飾后的Cytc與Apaf1的羧基端特定序列結(jié)合，同時(shí)胞漿中的dATP和(或)ATP與Apaf1的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而促進(jìn)Apaf1發(fā)生構(gòu)象變化并暴露出CARD(caspase activation and recruitment domain)，CARD是Apaf1N末端的一個(gè)Caspase募集結(jié)構(gòu)域。隨后Apaf1再與procaspase9的CARD結(jié)合。至此，Cytc、d

6、ATP、Aapf1和procaspase9組成聚合體稱(chēng)為凋亡復(fù)合體(apoptosome)。procaspase9與其周?chē)技钠渌黳rocaspase9相互靠近，發(fā)生自水解而活化，活化的Caspase9再激活下游的Caspase效應(yīng)分子procaspase3、procaspase6和procaspase7，這些蛋白酶通過(guò)多個(gè)途徑作用于細(xì)胞骨架蛋白、DNA修復(fù)調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白等，引起細(xì)胞DNA修復(fù)功能喪失、核酸內(nèi)切酶激活、DNA片段化等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。關(guān)于procaspase9的來(lái)源，有研究發(fā)現(xiàn)，它位于線粒體內(nèi)膜上，在凋亡刺激信號(hào)的作用下才釋放入胞液。2 線粒體產(chǎn)生活性氧與細(xì)胞凋

7、亡活性氧(reactive oxygen species，ROS)包括超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥自由基等。ROS增多的機(jī)制包括黃嘌呤氧化酶增多、線粒體功能受損、中性粒細(xì)胞聚集和兒茶酚胺氧化等。在凋亡發(fā)生時(shí)，線粒體呼吸鏈電子傳遞障礙是產(chǎn)生ROS的主要原因。眾所周知，Cytc是呼吸鏈中傳遞電子的重要載體，能將電子從復(fù)合體傳給復(fù)合體，凋亡初期，Cytc從線粒體釋放到胞漿，線粒體內(nèi)Cytc減少，則電子從Cytc傳遞給復(fù)合體減少，而導(dǎo)致線粒體內(nèi)電子超載，過(guò)量的電子從呼吸鏈中逃逸出來(lái)，并與O2作用產(chǎn)生超氧陰離子。大量的超氧陰離子進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2和其它ROS?？梢?jiàn)Cytc釋放導(dǎo)致線粒體內(nèi)的Cytc缺乏，是

8、促進(jìn)ROS生成的主要原因。反之，ROS引起的脂質(zhì)過(guò)氧化破壞線粒體膜，又促進(jìn)了Cytc的釋放，二者形成正反饋，共同參與細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。線粒體DNA(mtDNA)與核DNA相比缺乏組蛋白保護(hù)，容易受到ROS的損傷，大量產(chǎn)生的ROS使mtDNA編碼的呼吸鏈復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，電子傳遞效率降低，影響氧化磷酸化及ATP生成，出現(xiàn)線粒體功能異常，線粒體膜通透性改變，Apaf1、Cytc等凋亡蛋白釋放，caspase激活，最終細(xì)胞經(jīng)內(nèi)源性通路走向凋亡。此外，呼吸鏈復(fù)合物功能異常及電子傳遞障礙又生成大量ROS，形成惡性循環(huán)。除損傷mtDNA引起凋亡外，ROS本身還可使線粒體膜脂質(zhì)過(guò)氧化、膜流動(dòng)性降低、

9、線粒體內(nèi)外膜蛋白過(guò)氧化，蛋白質(zhì)交鏈，造成MPTP開(kāi)放，線粒體膜通透性升高，m下降，線粒體凋亡相關(guān)物質(zhì)釋放，引起細(xì)胞凋亡10。2蛋白家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡Bcl2蛋白家族主要位于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，根據(jù)Bcl2家族成員結(jié)構(gòu)和功能的不同分為三大類(lèi)：促凋亡成員，如Bax和Bak;抗凋亡成員，如Bcl2和BclXL;BH3only死亡蛋白，如Bid等。其中前兩種類(lèi)型在細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。3.1 Bcl2家族促凋亡蛋白的作用Bax通常以非活性單體的形式存在，其C末端的螺旋結(jié)構(gòu)隱藏在其BH13結(jié)構(gòu)域所形成的疏水性裂縫中。當(dāng)損傷因素刺激后，Bax發(fā)生構(gòu)象的改變，暴露螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋結(jié)構(gòu)的C末端插入到

10、線粒體的外膜，隨后，線粒體外膜上Bax多聚化，形成膜通道11，通過(guò)此通道，Cytc便從線粒體釋放出來(lái)。還有研究認(rèn)為12，Bax可能作用于電壓依賴(lài)性陰離子通道(voltagedependent anion channel，VDAC)，使VDAC結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。VDAC是MPTP的組成部分，VDAC結(jié)構(gòu)發(fā)生改變后，MPTP失去電壓依賴(lài)性和對(duì)離子通透的選擇性，從而導(dǎo)致Cytc釋放。Bak在受到凋亡信號(hào)刺激后也能發(fā)生空間構(gòu)象的改變，但不同于Bax，因?yàn)樵诰€粒體外膜已含有Bak錨定序列。正常情況下Bak的活性受到VDAC和Bcl2家族的抗凋亡蛋白Mcl1(myeloid cell leukemia1)的抑

11、制。當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)啟動(dòng)后，在Bid、Bim和Bad的作用下，Bak空間構(gòu)象改變，錨定在線粒體外膜的部分發(fā)生寡聚化，形成膜通道，引起Cytc等凋亡物質(zhì)的釋放1314。         3.2 Bcl2家族抗凋亡蛋白的作用當(dāng)外源性或內(nèi)源性的刺激因子作用于細(xì)胞線粒體時(shí)，Bcl2和BclXL發(fā)揮抗凋亡作用，主要有：可直接與線粒體外膜上的VDAC結(jié)合，但與Bax的作用效果不同，Bcl2、BclXL與VDAC結(jié)合后，可保持線粒體膜的完整性，抑制MPTP的開(kāi)放，穩(wěn)定m，從而抑制Cytc的釋放，同時(shí)也阻止了其它凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)的釋出15

12、;BclXL可以和Cytc直接結(jié)合而減少Cytc的釋放16;Bcl2可抑制線粒體內(nèi)氧自由基的生成，從而減少ROS導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡;Bcl2可與Apaf1和Caspase9結(jié)合并固定于線粒體上，阻止caspase級(jí)聯(lián)激活16;Bcl2抑制Bax等促凋亡蛋白在線粒體的定位及寡聚化，從而抑制Cytc的釋放17;有研究表明，Bcl2表達(dá)增強(qiáng)時(shí)，線粒體對(duì)Ca2+的耐受性提高，可減少鈣超載引起的細(xì)胞凋亡。4 線粒體釋放AIF與細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis induced factor，AIF)是一種黃素蛋白，同細(xì)菌的氧化還原酶有很高的同源性，成熟型相對(duì)分子量為57kD。正常情況下，AIF定位

13、于線粒體雙層膜間隙中，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)因素刺激時(shí)，AIF經(jīng)MPTP從線粒體釋放到胞漿中，繼而進(jìn)入胞核中。在核內(nèi)AIF可激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，活化的內(nèi)切酶可作用于核小體連接區(qū)，使DNA斷裂為核小體倍數(shù)大小即180200bp的片段18。有研究顯示，向細(xì)胞中微量注射AIF也能引起染色質(zhì)降解，且這種作用不被Caspase抑制劑所抑制，表明AIF不依賴(lài)于Caspase起作用，而是在Cytc釋放的上游階段發(fā)揮作用19。此外，AIF還可反饋放大MPTP的滲透性，誘導(dǎo)線粒體釋放Cytc等凋亡蛋白，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl2蛋白家族能通過(guò)調(diào)控MPTP的開(kāi)放控制AIF釋放，但不能抑制已釋放的AIF的促凋亡作用20。

14、5 結(jié)語(yǔ)細(xì)胞凋亡的過(guò)程與線粒體關(guān)系密切。眾多線粒體相關(guān)因素如Cytc、活性氧、Bcl2蛋白家族、AIF等參與凋亡的同時(shí)，彼此聯(lián)系、相互影響，形成的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞凋亡。然而，現(xiàn)今仍有很多問(wèn)題有待進(jìn)一步闡明，如某些具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控機(jī)制還不十分清楚。目前，以線粒體為靶位的治療方法已逐步引起關(guān)注，相關(guān)問(wèn)題的解決，不僅對(duì)于研究細(xì)胞凋亡本身具有重要的理論意義，也為臨床治療癌癥、防治器官缺血/再灌注損傷等，提供了新的思路和方法?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Kerr JF，Wyllie AH，Currie AR.Apoptosis：a basic biological phenomenon

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