應(yīng)用抑制差減雜交法分離玉米幼苗期葉片土壤 干旱誘導(dǎo)的基因

1、應(yīng)用抑制差減雜交法分離玉米幼苗期葉片土壤 干旱誘導(dǎo)的基因李會勇1，黃素華1，趙久然2，王鳳格2，張中保1，毛毅輝1，王秀堂1，石云素1，宋燕春1，王國英1，黎 裕1，王天宇1（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081；2北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心，北京 100097）摘要：【目的】分離土壤干旱脅迫條件下玉米幼苗期葉片誘導(dǎo)表達(dá)的基因?！痉椒ā勘狙芯坷靡种撇顪p雜交（suppression subtractive hybridization，SSH）的方法，以耐旱自交系CN165為材料，構(gòu)建了土壤干旱脅迫下玉米幼苗葉片的正向抑制差減cDNA文庫。【結(jié)果】在這個文庫中，隨機(jī)挑取了672個

2、陽性克隆，并進(jìn)行PCR驗證，對所有的單克隆進(jìn)行了測序。得到了598個有效序列，經(jīng)過EST聚類分析后，共得到了80個uniESTs。其中57個為contigs。23個為singlets。BLASTN的結(jié)果表明，所有的uniESTs都可以在玉米的核酸數(shù)據(jù)庫中找到同源序列。BLASTX的結(jié)果表明：68個uniESTs和已知功能的蛋白有高度的相似性，8個uniESTs為未知功能蛋白和假定蛋白，4個uniESTs沒有蛋白質(zhì)的相似性。【結(jié)論】在這個cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了大量抗旱相關(guān)的基因，這些基因涉及到植物代謝的多種途徑。關(guān)鍵詞：玉米；干旱誘導(dǎo); 抑制差減雜交法；耐旱基因Isolating Soil Dro

3、ught-induced Genes from Maize Seedlings Leaves Through Suppression Subtractive HybridizationLI Hui-yong1, HUANG Su-hua1, ZHAO Jiu-ran2, WANG Feng-ge2, ZHANG Zhong-bao1, MAO Yi-hui1, WANG Xiu-tang1, SHI Yun-su1, SONG Yan-chun1, WANG Guo-ying1, LI Yu1, WANG Tian-yu1(1 Institute of Crop Sciences, Chine

4、se Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2Maize Research Center, Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Beijing 100097) Abstract: 【Objective】Isolation and analysis soil drought-induced genes from maize seedlings leaves. 【Method】A forward cDNA library was constructed by su

5、ppression subtractive hybridization using seedling leaves of “CN165”, a drought-tolerant maize inbred line. 【Result】In the SSH library, 672 positive clones were picked up randomly. After PCR of each clone, all the single clones were sequenced. Totally 598 available sequences were obtained. After clu

6、ster anslysis of the ESTs sequences, 80 uniESTs were obtained, among which 57 uniESTs were contigs and 23 uniESTs were singlets. The results of BLASTN showed that all the uniESTs had homologous sequences in the nr database. The BLASTX results indicated that 68 uniESTs had significant protein homolog

7、y, eight uniESTs were unknown proteins and putative proteins, and four uniESTs had no protein homology.【Conclusion】A large group of drought stress-induced genes were found in the cDNA library, which involved in many metabolism pathways.Key words: Maize seedlings; Drought stress; Suppression subtract

8、ive hybridization(SSH); uniESTs0 引言【研究意義】玉米作為全球重要的糧、經(jīng)、飼三元作物，在維護(hù)糧食安全，促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展以及為淀粉加工提供原材料上具有舉足輕重的作用。但是每年玉米因干旱造成損失約占19%左右。干旱是影響植物生長發(fā)育最重要、最普遍的逆境因子，在許多地區(qū)成為農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸1，其危害相當(dāng)于其它自然災(zāi)害之和2。增強(qiáng)植物的抗旱能力已經(jīng)成為現(xiàn)代植物育種工作急需解決的關(guān)鍵問題之一，而植物抗旱相關(guān)基因的挖掘已成為目前植物遺傳資源與品種改良研究的熱點?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物抗旱機(jī)制是由多基因控制的復(fù)雜數(shù)量遺傳性狀3。近年來，國內(nèi)外很多科學(xué)家在干旱脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)、基因

9、調(diào)控以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面做了大量的工作，如在擬南芥47、水稻8、大 麥9,10和高粱11中已有很多對干旱脅迫反應(yīng)的研究報道，許多重要的調(diào)節(jié)基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因和脅迫耐受基因被分離和鑒定。在玉米的水分脅迫研究中，Poroyko用SAGE的方法分離到大量玉米根尖水分脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)的基因12；Zinselmeier和Yu分別用cDNA microarray的方法分離得到了水分脅迫下玉米的胚乳、胚和花梗的特異表達(dá)的基因13,14；Zheng也用差減雜交的方法分離到玉米的根和葉中PEG脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)的基因15。隨著對非生物脅迫研究的不斷深入，在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)水平和基因表達(dá)水平上已經(jīng)鑒定出的脅迫相關(guān)的基因大

10、致上可分為兩類：一類是參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的基因；另一類是直接保護(hù)細(xì)胞免受水分脅迫傷害的基因。但是真正解析植物的抗旱機(jī)制還需要更加深入的研究?！颈狙芯壳腥朦c】植物對干旱脅迫的反應(yīng)表現(xiàn)在生理、細(xì)胞和分子水平上，隨著基因組測序技術(shù)的日益成熟和功能基因組研究的不斷深入，理解植物在干旱脅迫下的分子調(diào)控機(jī)制已經(jīng)成為可能。抑制差減雜交是新近發(fā)展起來的一種發(fā)掘和分離差異表達(dá)基因的新方法，這種方法克服了以往任何一種差減方法的技術(shù)限制，在差減雜交過程中使不同豐度cDNA的拷貝數(shù)差異趨于均衡，因此不同豐度的差異表達(dá)基因都能得到有效克隆。【擬解決的關(guān)鍵問題】在干旱脅迫條件下，植物會特異地表達(dá)一些基因，通過研究

11、這些被干旱脅迫所誘導(dǎo)的基因，可能找到植物對干旱脅迫的適應(yīng)及抵御機(jī)理，并為植物抗旱基因工程提供理論支持和目的基因。本研究以玉米耐旱自交系CN165為實驗材料，利用抑制差減雜交的方法，在土壤干旱脅迫的條件下分離和鑒定玉米幼苗期葉片誘導(dǎo)表達(dá)的基因，解析玉米幼苗期干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因的調(diào)控代謝機(jī)制。1 材料與方法1.1 植物材料與處理以抗旱玉米自交系CN165為實驗材料，種子在培養(yǎng)箱中（26）用無菌水浸泡過夜，然后移至溫室中12個大小一致的瓦盆中，5顆/盆，栽培載體為土壤、蛭石和有機(jī)肥（321）。每2個瓦盆為一組，且要求長勢一致，共分為6組，每組設(shè)一個“對照”和“處理”。正常灌溉至苗期34片葉時開始對

12、“處理”樣品停水，停水后第2、4、6、8、10、12天分別對“處理”和“對照”的葉片取樣。同時計算葉片的相對含水量。剩余葉片用液氮速凍后，70保存?zhèn)溆谩?.2 總RNA的提取和mRNA的純化分別提取6個對照和6個處理的總RNA，然后等量混合，以對照的總RNA為Driver，處理的總RNA為Tester。總RNA的提取參照TRIZOL（Invirtrogen）的操作方法，mRNA的分離參照Oilgotex（Qiagen，Germany）的操作方法。1.3 抑制差減雜交應(yīng)用Clontech的PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kits，分別反轉(zhuǎn)錄Driver和Tester的

13、mRNA，得到雙鏈cDNA。以2 mg Tester和Driver的cDNA作為起始材料來進(jìn)行抑制差減雜交。首先分別對Tester和Driver在37下用RsaI酶切1.5小時，將酶切后的Tester分成兩等份，連接上不同的接頭，Driver不與接頭相連，兩份Tester分別與過量的Driver混合，進(jìn)行第一步差減雜交，將兩份第一步差減雜交的產(chǎn)物未經(jīng)變性就混合，進(jìn)行第二步差減雜交，利用抑制性PCR 擴(kuò)增差異表達(dá)的序列，用套式引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，使差異片段得到進(jìn)一步富集。具體操作方法參照操作手冊。1.4 玉米幼苗葉片SSH文庫的構(gòu)建用QIAquick PCR Purification Ki

14、t對正向差減雜交cDNA片段的第二輪PCR產(chǎn)物純化處理后，連接到pMD18-T載體（TaKaRa）上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109中，在涂有IPTG/X-gal的含AMP的LB平板上、37避光恒溫培養(yǎng)過夜，隨機(jī)調(diào)取白色陽性克隆672個。1.5 DNA測序和序列分析經(jīng)菌液PCR擴(kuò)增驗證后，對所有陽性克隆在3730自動測序儀（ABI Prism）上測序，用PHRED程序?qū)λ鶞y序列進(jìn)行分析，以消除載體序列、接頭序列和低于100 bp的EST序列。對篩選的序列進(jìn)行BLASTN和BLASTX分析，并進(jìn)行功能注釋。2 結(jié)果與分析2.1 干旱脅迫下玉米幼苗的表型性狀在玉米幼苗34葉片期時，筆者開始

15、對其進(jìn)行10天的干旱脅迫處理，在脅迫初期（14 d），葉片在午時葉片卷曲，但是早晚還能恢復(fù)展開狀態(tài)；進(jìn)入脅迫中期（58 d），午時卷曲的葉片不能在早晚恢復(fù)展開狀態(tài)，脅迫后期（812 d），葉片進(jìn)入永久萎靡階段：葉尖變黃、下部葉片始黃化，干枯。其間葉片相對含水量由斷水前的87%持續(xù)下降到50%（圖1）。每個點代表平均值加標(biāo)準(zhǔn)差Bars are mean±SD of five samples圖1 玉米幼苗期干旱脅迫12天葉片相對含水量的變化。Fig. 1 Changes of leaf relative water content (RWC) in maize seedings stag

16、e subjected to drought stress treatment for 12 days 2.2 總RNA和mRNA的檢測用BECKMAN公司的紫外分光光度儀DU800測定總RNA, 在260 nm和280 nm測量吸光度值，OD260/OD280 的比值為1.82.0，表明總RNA純度較高。用含有甲醛的變性瓊脂糖凝膠檢測總RNA的完整性，28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍（圖2），表明總RNA的完整性良好，可用于后續(xù)試驗。mRNA完整性和大小也通過甲醛變性的瓊脂糖凝膠電泳檢測，呈現(xiàn)彌散條帶（圖3），表明純化效果良好，可用于cDNA合成。2.3 玉米幼苗葉片抑制差減雜交文庫的構(gòu)

17、建對隨機(jī)挑選的672個白色陽性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖4）表明，這些克隆大部分為單克隆，只有極少數(shù)的克隆表現(xiàn)為多帶（結(jié)果沒有顯示），可D DT T圖2 Driver（D）和Tester（T）的總RNAFig. 2 Total RNA of Driver (D) and Tester (T)D DT T圖3 Driver（D）和Tester（T）的mRNAFig. 3 mRNA of Driver (D) and Tester (T)kb2.001.000.750.500.250.100.EXIN圖 4 菌液PCR擴(kuò)增檢測抑制差減cDNA文庫外源插入片段的長度Fig. 4 Identific

18、ation of inserted fragments of the subtracted cDNA library by PCR表1 玉米幼苗葉片干旱脅迫下部分誘導(dǎo)表達(dá)的基因Table 1 Genes expressed in maize seedlings during drought stress克隆編號Clone No.登錄號Accession No.功能注釋Function annotation物種SpeciesEvalue參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)途徑的基因Genes involved in signaling and regulatory pathwaysL13-C1AAV90624.1

19、DREB 2APennisetum glaucum3.00E-27L8-H1AAS87371zinc finger proteinOryza sativa (japonica cultivar-group)1.00E-57L13-B4AAA86945.1carbonic anhydraseZea mays4E-59L8-F7AAV90623Rab7Pennisetum glaucum4.00E-94L13-B5BAD33211.1putative chlorophyll a/b-binding proteinOryza sativa (japonica cultivar-group)1E-37

20、L13-C6XP_468022.1putative KOW domain-containing transcription factorOryza sativa (japonica cultivar-group)5.00E-73L8-F5AAC24574shaggy kinase homologZea mays8.00E-36L8-C11AAR20887circadian oscillator componentOryza sativa (japonica cultivar-group)2.00E-46L2-H9XP_482865.1putative Hec1 proteinOryza sat

21、iva (japonica cultivar-group)4.00E-23L6-A12ABA99861.1protease hhoa, chloroplast precursor, putativeOryza sativa (japonica cultivar-group)4.00E-95L7-E12BAD33787.1BRI1-KD interacting protein 120Oryza sativa (japonica cultivar-group)5.00E-21L8-F11BAB88215putative secretory acid phosphatase precursorOry

22、za sativa (japonica cultivar-group)6.00E-82L8-C2XP_482468.1putative methylcrotonyl-CoA carboxylase beta chain, mitochondrial precursorOryza sativa (japonica cultivar-group)1E-103編碼脅迫耐受蛋白的基因Genes encoded protein conferring stress toleranceL7-A5BAD73668.1putative heat shock protein 82Oryza sativa (jap

23、onica cultivar-group)1.00E-89L7-C12CAA55184.1heat shock protein 70 kDaZea mays5.00E-24L7-A7AAL83988.1putative heat shock proteinOryza sativa4.00E-42L7-G5AAV59379.1putative early-responsive to dehydration stress protein (ERD4)Oryza sativa(japonica cultivar-group)1.00E-114L8-A11XP_480189.1 putative LH

24、Y proteinOryza sativa (japonica cultivar-group)7E-69L7-A1AAF91388.1SocEMyxococcus xanthus4.00E-18L6-C1NP_565965.1hydrolaseArabidopsis thaliana7.00E-27L8-F4NP_914832putative selenium binding proteinOryza sativa (japonica cultivar-group)4.00E-71L2-D9XP_549860.1 putative prolyl endopeptidaseOryza sativ

25、a (japonica cultivar-group)3.00E-18L6-A6AAX96187.1Similar to seven transmembrane protein Mlo4Oryza sativa (japonica cultivar-group)7.00E-25L8-H3AAT75245putative cullin proteinOryza sativa (japonica cultivar-group)2.00E-92L13-F1XP_469739.1 putative RNA-binding proteinOryza sativa3.00E-84參與結(jié)構(gòu)和功能代謝合成途徑

26、中的一些酶Enzymes present in pathways leading to the synthesis of functional and structural metabolitesL8-F10AAK98692Putative serine palmitoyltransferaseOryza sativa3.00E-26L13-D6NP_922378.1putative trehalaseOryza sativa (japonica cultivar-group)5E-113L2-B4BAD82666.1 putative aldose reductaseOryza sativa

27、(japonica cultivar-group)1.00E-27L16-C1CAA81349.1Triose phosphate/phosphate translocatorZea mays3.00E-133L7-C1AAC80272.2glyceraldehyde phosphate dehydrogenaseVibrio fischeri0.001L13-C2AAW50989.1 ribosomal protein L7Triticum aestivum2.00E-44L13-A6XP_470900.1putative RNA polymerase IIIOryza sativa( ja

28、ponica cultivar-group)1.00E-19L12-B11XP_464028.1putative SMC3 proteinOryza sativa(japonica cultivar-group)4.00E-108L13-F9NP_178634.2RNA binding / aconitate hydratase/ hydro-lyase/ iron ion binding / lyaseArabidopsis thaliana4.00E-59L2-3NP_567950.1MCCB (3-METHYLCROTONYL-COA CARBOXYLASE); biotin carbo

29、xylaseArabidopsis thaliana3.00E-46L2-A1NP_564781.1ubiquitin-protein ligase/ zinc ion bindingArabidopsis thaliana4.00E-68L2-E10CAD23143.1H+-transporting ATP synthaseOryza sativa2.00E-24L2-H1BAB02957.1zinc metalloprotease (insulinase family)Arabidopsis thaliana1.00E-120L6-B9ABA96372.1arabinoxylan arab

30、inofuranohydrolase isoenzyme AXAH-IIOryza sativa (japonica cultivar-group)3.00E-157L6-E4AAV44044.1putative diphosphate-fructose-6-phosphate 1-phosphotransferaseOryza sativa (japonica cultivar-group)1.00E-129L7-E11NP_922302.1kinesin-like proteinOryza sativa (japonica cultivar-group)8.00E-21L7-H12AAG4

31、0328.1myo-inositol 1-phosphate synthaseZea mays9.00E-32L8A12AAU44107.1putative ketol-acid reductoisomeraseOryza sativa (japonica cultivar-group)7E-48L8-A3AAC63962.1pyruvate dehydrogenase kinase isoform 2; PDK2Zea mays5E-119L8-B1AAA33498.1pyruvate,orthophosphate dikinaseZea mays1E-129L8-B4NP_919692pu

32、tative transposaseOryza sativa (japonica cultivar-group)1.00E-16L8-C8AAC62456.1alanine aminotransferaseZea mays4E-86L8-C9XP_476534immunophilin/FKBP-type peptidyl-prolyl cis-trans isomerase-like proteinOryza sativa (japonica cultivar-group)6.00E-24L8-F8XP_466819putative lysyl-tRNA synthetaseOryza sat

33、iva (japonica cultivar-group)6.00E-162L8-G4XP_468293GCN5-related N-acetyltransferase (GNAT) family protein-likeOryza sativa (japonica cultivar-group)3.00E-69能是在菌液培養(yǎng)的過程中出現(xiàn)了交叉污染。在所有的單克隆中插入的cDNA片段大部分集中于600 bp左右，極個別片段大于1 kb或者在200 bp左右，這和RsaI的酶切結(jié)果吻合，并且證明差減后的二次擴(kuò)增產(chǎn)物在連接、轉(zhuǎn)化過程效果較好。2.4 抑制差減雜交文庫中誘導(dǎo)表達(dá)的基因筆者對隨機(jī)挑取的

34、所有陽性單克隆進(jìn)行了測序后，共得到了598個有效序列。經(jīng)過EST聚類分析后，共得到了80個uniESTs。其中57個為contigs，23個為singlets。BLASTN的結(jié)果表明，所有的uniESTs都可以在玉米核酸數(shù)據(jù)庫中找到同源序列。BLASTX的結(jié)果表明：68個uniESTs和已知功能的蛋白有高度的相似性，8個uniESTs為未知功能蛋白和假定蛋白；4個uniESTs沒有蛋白質(zhì)的相似性，這可能是新基因或者由于序列位于變異豐富的3末端或5-UTR而無法查到與其它物種基因的同源性。在和已知功能有相似性的uniESTs中，筆者發(fā)現(xiàn)了大量和干旱脅迫相關(guān)的基因。部分克隆及同源基因可能編碼的蛋白

35、質(zhì)見表1。3 討論在分子水平上，植物對干旱脅迫的反應(yīng)表現(xiàn)在有大量的基因參與植物本身代謝調(diào)節(jié)的各種途徑。當(dāng)前對非生物脅迫特別是干旱脅迫的研究集中在以下幾個方面：（1）參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)代謝途徑的基因16,17；（2）編碼脅迫耐受蛋白的基因18；（3）參與結(jié)構(gòu)和功能代謝合成途徑中的一些酶1921。雖然許多重要的基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但是構(gòu)建一個清晰的植物逆境脅迫下的代謝網(wǎng)絡(luò)圖仍需要大量的工作。因此發(fā)掘玉米干旱脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)的基因，明確基因之間的相互作用對了解玉米的抗旱機(jī)制和創(chuàng)育新的抗旱玉米品種有重要的指導(dǎo)意義。抑制差減雜交技術(shù)可被用于分離兩個mRNA群體間差異表達(dá)的基因22，近年來該技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)

36、用，并且有許多成功的報道。本研究利用抑制差減雜交技術(shù)克隆玉米自交系CN165幼苗期葉片干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因，建立了一個抑制差減雜交cDNA文庫。在這個SSH文庫中，有參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)途徑的基因，如DREB2A 的表達(dá)被脫水或高鹽脅迫誘導(dǎo)（10 h后達(dá)到峰值），且兩者都不依賴ABA。產(chǎn)生的DREB轉(zhuǎn)錄因子可激活具有DRE順式作用元件的一系列目的基因，如rd29A、cor15a、rd17、kin1 等。這些基因表達(dá)的產(chǎn)物在植物抗逆反應(yīng)中發(fā)揮著不同的作用，從而使得植株的抗逆性增強(qiáng)23；鋅脂蛋白是一類具有指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，其中C2H2型的雙鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子首先被Lippuner證明是與鹽脅迫

37、相關(guān)。Sakamoto等也證明這種類型的轉(zhuǎn)錄因子不僅和高鹽脅迫相關(guān)，而且受冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。在擬南芥中，只有AZF2受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，AF1、AF3、STZ則不受ABA的誘導(dǎo)，因此認(rèn)為AZF2可能是依賴于ABA的信號途徑的調(diào)節(jié)，而其它3個可能不參與ABA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑24,25；碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）普遍存在于原核生物和高等生物中。參與了不同的生物學(xué)過程，包括pH的調(diào)節(jié)、CO2的轉(zhuǎn)運、離子的交換、呼吸、光合作用、CO2的固定26。研究表明：CA在鹽藻細(xì)胞質(zhì)膜中是一種是受高鹽誘導(dǎo)的蛋白 質(zhì)27。編碼脅迫耐受蛋白的基因，如熱激蛋白（HSP）是一類在有機(jī)體內(nèi)受到高溫等逆

38、境刺激后大量表達(dá)的蛋白，是植物短期適應(yīng)逆境脅迫的必需組成成分，對減輕逆境脅迫引起的傷害有很大的作用。有機(jī)體在受到逆境脅迫后，體內(nèi)變性蛋白急劇增加，熱激蛋白可以與變性蛋白結(jié)合，維持它們的可溶狀態(tài)，在有Mg2 +和ATP的存在下使解折疊的蛋白質(zhì)重新折疊成有活性的構(gòu)象。在筆者構(gòu)建的SSH文庫中，發(fā)現(xiàn)了3個熱激蛋白：HSP、HSP82、HSP70。其中HSP70的作用最為重要，它不僅對植物的正常生長發(fā)育、抗熱、抗冷有促進(jìn)作用，而且還具有分子伴侶功能，在依賴ATP蛋白質(zhì)的折疊和裝配中起作用28，還有早期反應(yīng)脫水蛋白4（ERD4）等。參與結(jié)構(gòu)和功能代謝合成途徑中的酶，如絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（serine p

39、almitoyl- transferase）是產(chǎn)生內(nèi)源植物鞘氨醇（phytosphingosine）的關(guān)鍵酶，植物鞘氨醇的主要作用是在熱脅迫下阻止植物蛋白質(zhì)水解，鞘脂類物質(zhì)還是真核細(xì)胞脅迫反應(yīng)的第二信使29；海藻糖酶（trehalase）普遍存在于許多植物的不同組織中，在花粉和豆類植物根的節(jié)結(jié)中高度表達(dá)，植物在非生物脅迫的條件下，海藻糖（trehalose）的含量會急劇增加，從而影響蔗糖的代謝，抑制細(xì)胞壁的合成，海藻糖酶的主要功能就是分解毒性海藻糖，以保護(hù)細(xì)胞或細(xì)胞膜免受非生物脅迫造成的傷害30。還有H+轉(zhuǎn)運ATP合成酶（H+-transporting ATP synthase），水解酶（hy

40、drolase），絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶，脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶（prolyl endopeptidase），丙酮酸脫氫酶激酶異構(gòu)體2（PDK2）等都參與植物逆境脅迫適應(yīng)的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。但另外一些酶類物質(zhì)在植物逆境脅迫研究中還沒有相關(guān)的報道。4 結(jié)論在筆者構(gòu)建的SSH文庫中，許多uniESTs是已知功能的非生物脅迫誘導(dǎo)的基因。這充分說明干旱脅迫反應(yīng)和其它非生物逆境脅迫反應(yīng)在分子水平上存在著很大的相關(guān)性，在抗逆境的某些代謝途徑上表現(xiàn)一致。所有的非生物脅迫在亞細(xì)胞水平上都可以歸納為離子脅迫、氧化脅迫和滲透脅迫。這些脅迫都會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子和滲透失衡，功能蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和細(xì)胞膜系統(tǒng)破壞，從而激活相應(yīng)的信號受體，

41、然后發(fā)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和級聯(lián)放大，下游的轉(zhuǎn)錄因子和相應(yīng)的誘導(dǎo)基因開始表達(dá)或顯著增加表達(dá)量，通過調(diào)節(jié)多條代謝途徑使植物本身盡量適應(yīng)脅迫反應(yīng)。然而還有一部分是未知功能和沒有蛋白同源性的基因，有待于進(jìn)一步深入的研究和探討。目前，對各個基因表達(dá)譜的分析正在進(jìn)行，同時筆者已經(jīng)克隆到了ERD4的基因，并且成功轉(zhuǎn)化到擬南芥中驗證其功能（未發(fā)表）。另外筆者還選擇了SSH文庫中部分基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析和探討其等位基因的功能。References1李智念, 王光明, 曾之文. 植物干旱脅迫中的ABA研究. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究, 2003, 21: 99-104. Li Z L, Wang G M, Zeng Z W. The

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