土壤真菌分離計數

1、兼用于土壤真菌的分離和計數：孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、麥芽浸汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)和牛膽汁瓊脂培養(yǎng)孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基是一種組合培養(yǎng)基，成分準確，其上發(fā)育的真菌數量及種類較多，放線菌及大部分細菌易被孟加拉紅和鏈霉素所抑制，但真菌菌落較小，是最常用的土壤真菌分離和計數培養(yǎng)基。然而由于孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基對真菌菌落和繁殖器官形成的限制，以及染料影響在原始平皿上正常識別某些真菌，與酸性培養(yǎng)基相比，必須轉移更多的菌落到其它的培養(yǎng)基上。PDA和MEA均為酸化的天然培養(yǎng)基，能抑制全部細菌和放線菌。但由于酸度過高。有些耐酸性較弱的真菌，在其上不能發(fā)育，因此出現的數量及種類都比孟加拉紅瓊脂培

2、養(yǎng)基上低。牛膽汁瓊脂培養(yǎng)基上菌落發(fā)育不大，放線菌和細菌也全部被抑制，數量準確，但由于結晶紫的影響，不易在培養(yǎng)基上直接鑒定。土壤真菌常用的分離方法：1、稀釋法此種方法在土壤真菌分離中最常用，用無菌水將土壤稀釋后得到10-310-4的懸浮液，將一定量稀釋懸浮液均勻涂抹于培養(yǎng)基上，菌落長成后，將單個菌落挑出、培養(yǎng)、鑒定。這種方法對土壤中產孢量大的半知菌、子囊菌和接合菌，如青霉屬Penicillium，曲霉屬Aspergillus和毛霉屬Mucor等有利，所分離到的主要是以孢子形態(tài)存在于土壤的真菌，以菌絲體形式存在的則較難分離到。這種方法分離的真菌并不能代表土壤中真菌的真實存在情況，因為部分真菌的孢子

3、和菌絲經常附著在土壤顆粒上，沒有被充分洗脫下來，因而也就無法繼續(xù)培養(yǎng)，這樣有可能丟失了很大部分真菌。2、土壤平板法將一定量土壤(一般1.55 mg)移入滅菌的培養(yǎng)皿中，涂平，然后倒入冷卻至45的培養(yǎng)基，搖勻后培養(yǎng)；或將土壤直接加在冷卻后的培養(yǎng)基表面培養(yǎng)。稀釋法分離過程中，附著在礦物粒子或埋藏在腐殖質內的真菌不易分離到，此種方法可較全面獲得土壤中的真菌，除了以休眠孢子存在的真菌還可以分離以菌絲存在的真菌。若土壤中存在腐霉（Pythium）、木霉（Trichoderma）或毛霉（Mucor）等真菌，由于生長過快，會很快覆蓋培養(yǎng)皿而不易分離得到其他生長相對慢的真菌，因此該方法對生長較快的真菌有利。3

4、、菌絲分離法一定量土壤充分沖洗后，過孔徑50m的篩，殘留篩上的土粒置于培養(yǎng)皿中，體視鏡下觀察，將黏附于土粒上的菌絲或菌絲塊取出，置于培養(yǎng)皿中，然后倒入培養(yǎng)基培養(yǎng)，將生長的新菌絲頂端切下后再培養(yǎng)，這種方法分離的真菌一般都是前兩種方法未分離到的。該方法對以下真菌的分離有利：菌絲較粗；不易斷裂；顏色較深。但這種方法獲得的分離物在培養(yǎng)過程中，經常作為不育菌絲的形態(tài)存在，難以產孢，因此無法鑒定，而且費時、費力，不是很常用。4、誘餌法這是一種生物學的方法，適合于從土壤中分離數量較少的特定真菌，即將“誘餌”埋入土壤一段時間，取出后直接培養(yǎng)以此獲得所需要的真菌。分離的真菌不同，所選用的誘餌也不同，如大麻種子就

5、是分離水生菌以及腐霉屬Pythium很好的誘餌；而鳳梨的莖和葉子能夠誘集Phytophythora cinnamomi；胡蘿卜的圓片可以誘集Thielaviopsis basicola；土豆的塊莖誘集Phytophthora infestans；喜角質的壺菌常用的誘餌為人的毛發(fā)。5、其他的分離方法孢子懸浮法：最初用來分離長蠕孢屬Helmithosporium，也適于分離其他以孢子狀態(tài)存在土壤的真菌。干燥法：通過將土樣用氯化鈣干燥后，進行分離。該種方法分離獲得的是在土壤中以孢子狀態(tài)存在的真菌，而以菌絲狀態(tài)存在的真菌則因為干燥失水死亡。埋管法和Rossi-Cholodny埋片法：這兩種方法中，生長

6、旺盛、對低氧忍耐較強的真菌比較容易分離到，較易分離以活躍菌絲存在的種類，如立枯絲核菌Rhizocotoniasolani。土壤真菌計數法直接計數法 培養(yǎng)后測定菌落數【稀釋平板法、土粒法以及最大概率數值法】間接計數法 土壤真菌染色后在顯微鏡下計數【Rossi-Cholodny埋片法、Jones-Mollison法、Thornton-Gray (Ratio)法、土壤切片法、熒光抗體法以及電子顯微鏡直接觀察法、熒光顯微鏡觀察法等】直接計數法稀釋平板法 根據土壤中真菌的數量，一般采用的稀釋度為10-110-3，同時稱取待測土樣10g左右，經105烘干8h，置于干燥器中，待冷卻后稱重，計算土壤含水量的百

7、分數。用混菌法和刮刀法將土壤懸液接種在培養(yǎng)皿中，重復4次，于2830恒溫箱中培養(yǎng)57d，選取菌落數在10100的培養(yǎng)皿進行計數(剔除擴散性真菌菌落占據瓊脂表面15%的培養(yǎng)皿)。最大概率數值法以煙草黑腐病菌根串珠霉(Thielaviopsis basicola)為例，取烘箱干燥土樣10g。用每毫升含60g金霉素的滅菌蒸鎦水配制每級10倍的稀釋液至10-5或10-6。在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿內放3片10mm厚的胡蘿卜片，用直徑23mm的打孔器在上面打出一凹穴，加入稀釋液1mL，重復3次。接種67d，記錄發(fā)病胡蘿卜餅數目。若26次稀釋度中獲得陽性結果(5， 4， 2， 0， 0)。以p1為5， p2為4，

8、 p3為2的值，查表得近似值2.2。土粒法 對于不產孢子的真菌，采用將土粒接種在選擇性培養(yǎng)基上的方法來分離計數。取少量土樣加無菌水調成糊狀，用圓頭玻璃棒在平板上點樣，適溫下培養(yǎng)一定時間后，觀察生長情況，結果以百分數表示。此方法只能得到不同土壤之間同類真菌數量的比較粗略的數據。間接計數法Rossi-Cholodny埋片法將載玻片埋在土壤中，經過一定時間后鏡檢測定載玻片表面生長的微生物的半定量方法。真菌一般放大400600倍，每枚標本片觀察100400個視野，以檢出真菌的視野數與總視野數之比表示生育量(檢出頻率%)。此方法適用于測定不同時期不同土壤中真菌菌絲體豐度，然而不能測定每單位重量土壤的菌數

9、(生育量)。毛細管法根據微生物利用土壤本身的毛細管系統(tǒng)輸送的空氣和養(yǎng)分而生存的原理。將滅菌的毛細管插入融化的0.2%瓊脂中，然后安裝在支架上，插入土壤中，一定時間后取出，用5%碳酸赤蘚紅染色，在顯微鏡下觀察。此方法能顯示出天然生境下的微生物區(qū)系，并分離出許多未能為平板法所揭示的微生物種，但得不出單位重量土壤中所含真菌數量。不過，反映出的數量仍可作為不同土壤之間的相對比較。Jones-Mollison法依據Thornton(1934)等人的觀點將土壤懸浮液與溶化的瓊脂充分混合，再制成薄片，使土壤粒子與菌體均勻分散，提高測定總菌數的精確度。本方法適用于土壤中的真菌的菌絲量的檢出頻率的測定。以上3種

10、方法由于菌體和有機物質同樣被染色，要求操作熟練，但制成的標本保存時間較長。上述3種顯微鏡直接計數法用酸性染料染色可將菌體和土壤顆粒分開，但無法區(qū)分活菌和死菌。熒光顯微觀察法Strugger(1948)利用吖啶橙熒光顯微鏡技術區(qū)分活菌和死菌。一般情況下，活菌比死菌吸收染料少，在熒光鏡下分別顯示亮綠色和暗紅色。此法可進行土壤真菌的定量測定。克拉西里尼科夫提出在土壤樣品表面，直接滴加吖啶橙溶液，在落射光照明的顯微鏡下觀察，可以在不破壞土壤結構的情況下研究真菌在土壤中空間分布的狀況。還可利用添加熄滅劑來減弱土體的自體發(fā)光。Fradkin等觀察小麥根腐病菌禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativ

11、us)和其它植物病原菌的分生孢子與菌絲繁殖時，用吖啶橙或銪螯合物染色，在熒光顯微鏡下可以明顯區(qū)分真菌的各種結構。常用的熒光染料還有異硫氰酸、1-苯胺、8-萘酚磺酸鎂鹽、二醋酸鹽和萘啶酮酸，其中后兩者只染活的微生物。熒光抗體法用抗體和熒光素結合制成的熒光抗體試劑處理土壤樣品，熒光抗體和存在于樣品中的相應抗原產生特異性反應，在熒光顯微鏡下產生特定的熒光。如果事先制備多種模式的熒光抗體。就可對土壤樣品中的相應抗原進行檢驗。并且熒光抗體可長期保存。本方法由熒光抗體的制備和熒光抗體標本的染色兩部分組成，適用于涂抹標本、印片標本、土壤本身、埋片和土壤切片。真菌多使用菌絲的勻漿作為抗原來制備抗體。熒光抗體的

12、染色方法有直接法、間接法及補體法等。本方法可進行土壤真菌的定量測定，并且能夠了解土壤真菌的組成情況。電子顯微鏡直接觀察法利用電子顯微鏡觀察土壤懸液，用熱吸附法制片，可觀察到少見的真菌。此方法比稀釋平板法的測定結果高幾百倍。但改變了土壤的自然狀態(tài)，且不能得到純培養(yǎng)，不能直接作菌種的鑒定。土壤切片法利用各種固定劑在不破壞土壤結構的條件下將土壤樣本固定，制成觀察微生物的剖面或薄片，再進行鏡檢。自從Kubiena(1938)用塑性物質固定土壤，做了直接觀察土壤微生物的試驗以來，其后Haarlov & Weis-Fogh(1953， 1955)等人試驗以瓊脂固定制作土壤薄片。Mindermpn(1956)用明膠固定土壤，再以氟化氫處理，除去砂質，可制成7.510m的薄片，再用J