細(xì)胞培養(yǎng)ppt課件

1、細(xì)胞培育根本技術(shù)細(xì)胞培育的根本概念 傳代： 細(xì)胞在培育器皿中生長一定時(shí)間后，被分開接種到新的培育器皿中。 原代培育 取自體內(nèi)新穎組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培育。 n細(xì)胞培育：運(yùn)用單個(gè)細(xì)胞懸液n組織培育：運(yùn)用組織塊O.51立方毫米或薄片厚0.2 毫米n器官培育：運(yùn)用器官原基或器官的一部分或整個(gè)器宮原代培育細(xì)胞的生命歸宿n原代培育期n傳代期n衰退期n有限細(xì)胞系，無限細(xì)胞系 n細(xì)胞系 cell linen細(xì)胞株 cell strain 培育細(xì)胞的特性n 培育細(xì)胞的生長方式n貼附生長：n 必需貼附于支持物外表才干生長。見于各種實(shí)體瘤細(xì)胞n懸浮生長：n 于懸浮形狀下即可生長，不需求

2、貼附于支持物外表。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞 每代貼附生長細(xì)胞的生長過程n游離期n貼壁期n埋伏期n對數(shù)生長期n停頓期平臺期n游離期：n 細(xì)胞接種后在培育液中呈懸浮 形狀也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。n 10分鐘一4小時(shí)n貼壁期：n 細(xì)胞附著于底物上，游離期 終了。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)貼壁。n 底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等n 血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白生長基質(zhì)，這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。n進(jìn)口塑料培育瓶涂有生長基質(zhì)化學(xué)合成的功能基團(tuán)n埋伏期n 此時(shí)細(xì)胞有生長話動(dòng)，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株埋伏

3、期一n般為624小時(shí)。n對數(shù)生長期：n 細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長，活力最正確，最適宜進(jìn)展實(shí)驗(yàn)研討。n停頓期平臺期：n 細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂n 機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性培育細(xì)胞生長的條件n1 細(xì)胞的營養(yǎng)需求n2 細(xì)胞的生存環(huán)境n 溫度: 37 n O2n CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-n pH: 7.2-7.4n 浸透壓n 3 無污染n 4 無毒 實(shí)驗(yàn)預(yù)備實(shí)驗(yàn)用品：實(shí)驗(yàn)用品：超凈任務(wù)臺，壓力蒸汽消毒器，電熱枯燥箱，濾超凈任務(wù)臺，壓力蒸汽消毒器，電熱枯燥箱，濾器，酸缸器，酸缸CO2培育箱培育箱倒置顯微鏡倒置顯微鏡酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器酶標(biāo)儀、微

4、孔板震蕩器液氮罐液氮罐自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培育瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培育板，耗材：培育瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培育板， 凍存管凍存管n壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣n電熱枯燥箱：干熱消毒160 ，2小時(shí)。主要用干玻璃n器皿消毒 n濾器：過濾除菌：大多數(shù)培育用液，如人工合成培育基、血清、 n酶液等均采用濾過法除菌 n超凈任務(wù)臺：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境n紫外燈 ：紫外線消毒。 主要用于培育室空氣、操作臺、塑料n培育皿和培育板等外表消毒 n 超凈臺n n超凈任務(wù)臺的任務(wù)原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐經(jīng)過任務(wù)

5、臺面，使任務(wù)臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。 濾 器 CO2培育箱nCO2培育箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 。n運(yùn)用CO2培育箱培育細(xì)胞時(shí)應(yīng)留意的問題：n 用螺旋口瓶培育細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。n 堅(jiān)持培育箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒n90 ，14 h)。n箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以堅(jiān)持箱內(nèi)濕度，避兔培育液蒸發(fā)。自動(dòng)雙重純水蒸餾器 純水儀酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器培 養(yǎng) 板 培育瓶n 常用玻璃器皿清洗n浸泡自來水、刷洗洗衣粉、酸泡24小時(shí)、n流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50烘干清潔液的配制2 細(xì)胞培育用液的配制水：新穎配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS：NaC

6、l 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 mln消化液：n 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相銜接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分別。n n 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超越一定限制會損傷細(xì)胞。n 胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25 。用濾器過濾除菌。n胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。n用含血清培育液終止其對細(xì)胞的消化作用 培育基n培育基培育液是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液，分天然培育基和合成培育基。n天然培育基：n天然培育基有血

7、清、血漿、和組織提取液如雞胚和牛胚浸液。n優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培育效果好n缺陷：來源受限。n 成分復(fù)雜，影響對某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。n 易發(fā)生支原體污染 合成培育基n 合成培育基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培育基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。n 合成培育基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。n 優(yōu)點(diǎn)：規(guī)范化消費(fèi)，組分和含量相對固定。n 本錢低 n 缺陷： 短少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需求。 n 人工合成培育基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁衍，還需補(bǔ)充一定量的天然

8、培育基如血清。n n n血清中含有：n多種蛋白質(zhì)白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等n多種金屬離子n； 激素；n 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。n各種生長因子n轉(zhuǎn)移蛋白n不明成分n普通說來含5小牛血清的培育基對大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死但支持細(xì)胞生長普通需加 10血清n對于血清支持細(xì)因生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚n血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子，同對也存在細(xì)胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培育基中培育的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反響。n在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研討領(lǐng)域，迫切需求用無血清培育基培育細(xì)胞n無血清培育基的主

9、要研制戰(zhàn)略：在根底培育基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長因子 、結(jié)合蛋白 、貼壁和擴(kuò)展因子 等。n無血清培育基由根底培育基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。n1975年，Sato初次勝利地用無血清培育基培育了垂體細(xì)胞株，近20多年來已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系在無血清培育基中勝利地生長和增殖。n無血清細(xì)胞培育基的運(yùn)用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可反復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。n向無清培育液中能促進(jìn)細(xì)胞系生長的補(bǔ)加物都是獨(dú)特的。適用于某種細(xì)胞株的培育液，很能夠不適宜另一種細(xì)胞株的生長。即使同源組織的不同細(xì)胞株，所需補(bǔ)加物也不同。 n 無血清培育基尚處于研討階段，難以推行。n 目

10、前，絕大多數(shù)人工合成培育基運(yùn)用時(shí)還需添加血清 n血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。n常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。n優(yōu)質(zhì)血清的規(guī)范：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。n血清的滅活消除補(bǔ)體活性：56 ，30 分鐘n血清的消毒：過濾除菌n抗菌素的運(yùn)用：n 在培育液配制后，培育液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制能夠存在的細(xì)菌的生長。n 通常是青霉素和鏈霉素結(jié)合運(yùn)用。培育基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終運(yùn)用濃度為每毫升100單位。n 慶大霉素：每毫升100單位方便、廣譜、穩(wěn)定完全培育基的組成n根底培育基 80一95n血清 5一20n碳酸氫鈉 2.0 g/

11、Ln青、鏈霉素 各100卑位毫升培育基的配制 RPMI-1640培育粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 過濾除菌。 調(diào)理pH值至7.2 加血清終濃度 10 細(xì)胞傳代方法n 根據(jù)細(xì)胞生長的恃點(diǎn)，傳代方法有3種。n 1懸浮生長細(xì)胞傳代n 離心法傳代：離心1000轉(zhuǎn)/分去上清，沉淀物加新培育液后再混勻傳代。n 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培育液去除l2一23，然后用吸管直接吹打構(gòu)成細(xì)胞懸液再傳代。n 2 半懸浮生長細(xì)胞傳代Hela細(xì)胞n 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長景象，但貼壁不牢，可用直接吹n打法使紉胞從瓶壁零落下來，進(jìn)展傳代。n 3

12、貼壁生長細(xì)胞傳代n 采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。貼壁生長細(xì)胞傳代方法：n1 吸光培育瓶中的培育液n2 參與1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)n靜置2-10 min顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測。n3 吸去胰蛋白酶液，參與培育液。n4 用吸管汲取瓶內(nèi)培育液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，構(gòu)成細(xì)胞懸液。n5 汲取1/101/40細(xì)胞懸液，接種于新的培育瓶內(nèi)。n6 加適量新穎培育液于接種了細(xì)胞懸液的新培育瓶內(nèi)。n7 將后者放入培育箱中培育。細(xì)胞計(jì)數(shù)n血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞nCoulter計(jì)數(shù)儀：人工計(jì)數(shù)培育細(xì)胞活力測定n細(xì)胞活力測定是腫瘤體外研討中運(yùn)用最廣的技術(shù)手段之

13、一。 n任何培育瓶內(nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形狀上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。n1 細(xì)胞克隆構(gòu)成率實(shí)驗(yàn) 單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體構(gòu)成肉眼可見的克隆。克隆構(gòu)成卒用來表示細(xì)胞的增殖才干 n 克隆構(gòu)成率比克隆構(gòu)成數(shù)接種細(xì)胞數(shù)n缺陷：操作繁瑣n優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確、可靠2臺盼藍(lán)法n 活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占n細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞恬力 n n已淘汰3 四唑鹽MTT比色法n四唑鹽MTT商品名為噻唑藍(lán)，n 四吐鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽復(fù)原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜DMSO能溶解堆積在細(xì)胞

14、中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測定OD值n MTT法簡單快速、準(zhǔn)確，廣泛運(yùn)用于新藥挑選、細(xì)胞毒牲試n驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。n操作步驟n 1單細(xì)胞懸液接種于96孔培育板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培育基總量200微升96孔培育板每孔容積370微升，37、5nCO2培育箱中培育一段時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q議培育時(shí)間n 2參與2毫克毫升的MTT液50微升孔；繼續(xù)培育3小時(shí)。n 3吸出孔內(nèi)培育液后，參與DMSO液150微升孔，將培育板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。n 4酶標(biāo)儀檢測各孔OD值檢測波長570納米。記錄結(jié)果，繪制n操作步驟n 1單細(xì)胞

15、懸液接種于96孔培育板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培育基總量200微升96孔培育板每孔容積370微升，37、5nCO2培育箱中培育一段時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q議培育時(shí)間n 2參與2毫克毫升的MTT液50微升孔；繼續(xù)培育3小時(shí)。n 3吸出孔內(nèi)培育液后，參與DMSO液150微升孔，將培育板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。n 4酶標(biāo)儀檢測各孔OD值檢測波長為570 nm。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線細(xì)胞凍存和復(fù)蘇n細(xì)胞低溫冷凍儲存是細(xì)胞室的常規(guī)任務(wù)。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保管相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。凍存和復(fù)蘇的原那么：慢凍快融n當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變

16、化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)成冰晶。n n 假設(shè)緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐漸脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會呵斥細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶構(gòu)成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。慢凍程序n規(guī)范程序：n 當(dāng)溫度在-25 以上時(shí)， 12 /minn 當(dāng)溫度達(dá)-25 以下時(shí)， 510 /minn 當(dāng)溫度達(dá)-100時(shí)，可迅速放入液氮中n 細(xì)胞凍存器n簡易程序：n 將冷凍管管口要朝上放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，經(jīng)過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12 的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮外表，停30分鐘后，直接投人液氮中。低溫維護(hù)劑的運(yùn)用n在細(xì)胞凍存時(shí)參與溫維護(hù)劑，能大大提高凍存效果。n常用的低溫維護(hù)劑是DMSO，它是一種浸透性維護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前顯顯露細(xì)胞外，在胞外構(gòu)成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。細(xì)胞凍存方法n1預(yù)先配制凍存液： 含20