1DNA重組技術(shù)的基本工具

1、11.1DNA 重組技術(shù)的基本工具1、_ 基因工程又叫做基因拼接技術(shù)或DNA 重組技術(shù)，是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過(guò)體外DNA 重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特 性從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的 _生物類型和_生物產(chǎn)品_。基因工程的理論基礎(chǔ)：（1）所有生物的 DNA 都是以 4 種脫氧核苷酸為基本單位，構(gòu)成獨(dú)特的雙螺旋結(jié)構(gòu)，且堿基互補(bǔ)配對(duì) 方式相同，這為不同 種生物的 DNA拼接成功提供物質(zhì)基礎(chǔ)。（2）所有生物共用一套密碼子，為某生物的基因能夠在其他生物細(xì)胞內(nèi)正常指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成提供可能。2、 DNA 重組技術(shù)需要哪幾種工具？限制性核酸內(nèi)切酶、DNA 連接酶、載體3、 限

2、制性核酸內(nèi)切酶的主要來(lái)源是什么？原核生物_作用特點(diǎn)是什么？識(shí)別雙鏈 DNA 分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)_識(shí)別序列往往有什么特點(diǎn)？回文序列_切出的末端分為哪兩類？ _ 黏性末端和 平末端_怎樣產(chǎn)生黏性末端和平末端？當(dāng)限制酶在識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)切開(kāi)，產(chǎn)生的是黏性末端，當(dāng)限制酶在識(shí)別序列的中心軸線切開(kāi)，產(chǎn)生的則是平末端4、 DNA 連接酶根據(jù)來(lái)源分為哪兩類？E.coliDNA 連接酶、T4DNA 連接酶作用：將兩個(gè) DNA 分子片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被 限制酶_ 開(kāi)了的兩個(gè)核苷酸之間的 磷酸二酯鍵_。兩種酶的共同點(diǎn)？ 都能連接雙鏈 DNA

3、的黏性末端_兩種酶作用的不同點(diǎn)？ E.coliDNA 連接酶只能連接黏性末端，TgDNA 連接酶 還可連接平末端，但是連接效率比較低。_5、 切割目的基因和切割運(yùn)載體的酶必須滿足什么要求？切割產(chǎn)生相同的黏性 末端6 使氫鍵斷裂的方法有哪些？加熱、DNA 解旋酶_使氫鍵生成的方法有哪些？氫鍵的結(jié)合不需要酶的催化，適宜的條件下依靠堿基之間的分子間作用力結(jié)合.使磷酸二酯鍵斷裂的方法有哪些？DNA 水解酶、限制性核酸內(nèi)切酶_使磷酸二酯鍵生成的方法有哪些？DNA 聚合酶、DNA 連接酶等_限制酶和 DNA 水解酶作用特點(diǎn)有什么不同？一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切點(diǎn)上切割 DNA 分

4、子，結(jié)果是切成兩個(gè) DNA 片段， 而 DNA水解酶是水解 DNA 分子的所有磷酸二酯鍵，使其形成單個(gè)脫氧核苷酸。 DNA 連接酶和 DNA 聚合酶作用特點(diǎn)有什么不同？DNA 連接酶是連接兩個(gè)DNA 片段，不需要模板。DNA 聚合酶是以一條 DNA 鏈為模板，將單個(gè)脫氧核 苷酸加到已有鏈的末端7、載體常見(jiàn)種類有哪些？ 質(zhì)粒、入噬菌體和動(dòng)植物病毒等_2應(yīng)該滿足哪些特點(diǎn)？有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源 DNA 片段插入其中;攜帶外源 DNA 片段的質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞后， 在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到染色體 DNA 上，隨其同步復(fù)制；有特殊的標(biāo)記基因，供重組 DNA 的鑒定 的選擇。_常用載體一

5、一質(zhì)粒質(zhì)粒是一種裸露_的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單_ 獨(dú)立于細(xì)菌_擬核_ 外，并具有自我復(fù)制能力的 雙鏈環(huán)狀 DNA 分子。1.2 基因工程的基本操作程序1、 基因工程的基本操作程序包括哪四個(gè)步驟目的基因的獲取、基因表達(dá)載體 的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定（一）、目的基因的獲取2、 主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子 _o目的基因的來(lái)源？_獲取目的基因的方法有哪些 從基因文庫(kù)中獲取、利用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增目的基因、 人工合成法3、 什么叫基因文庫(kù)：將含有某種生物不同基因的許多DNA 片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因稱為基因文庫(kù) 包括

6、哪兩大類：基因組文庫(kù)和 cDNA 文庫(kù)基因組文庫(kù)和 cDNA 文庫(kù)的差別？文庫(kù)類型cDNA 文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小小大啟動(dòng)子無(wú)有內(nèi)含子無(wú)真核生物有，原核生物無(wú)基因多少某生物的部分基因某種生物的全部基因物種間的基因交流可以部分基因可以目的基因的獲取：根據(jù)基因的有關(guān)信息：如基因的核苷酸序列、基因的 功能、基因在染色體上的位置、基因的 轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物mRNA、基因 表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等獲取目的基因。4、PCR:是_的縮寫(xiě)。是一項(xiàng)在生物體外_技術(shù)。原理：利用DNA 雙鏈復(fù)制_ 的原理。條件（前提）： 有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列設(shè) 計(jì)引物過(guò)程：目的基因受熱變性后成為 單鏈 ， 引物 與 單

7、鏈 結(jié)合, 在 DNA 聚合酶_ 的作用下延伸形成 DNA，如此重復(fù)循環(huán)多次。方式： 指數(shù)擴(kuò)增，約為2no6 人工合成法適用條件：基因比較小,核苷酸序列已知。3（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建1、基因工程的核心是基因表達(dá)載體的構(gòu)建_構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以 遺傳給下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用_ 。表達(dá)載體的組成： 目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因_啟動(dòng)子：位于基因的 首端 ，它是 RNA 聚合酶 的識(shí)別和結(jié)合部 位，驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA_ 。終止子：位于基因的 尾端，終止轉(zhuǎn)錄 。標(biāo)記基因：作用是 鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基 因的

8、細(xì)胞篩選出來(lái)（三） 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1、 轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。2、 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通 道法采用得最多的是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，農(nóng)桿菌的特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和 裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染力；農(nóng)桿菌的的 Ti 質(zhì)粒的 T-DNA 可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體上。使目的基因的遺傳特性得以 穩(wěn)定維持 和 表達(dá)3、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞1方法： 顯微注射_ 技術(shù)。2操作程序：目的基因表達(dá)載體提純 一從雌性動(dòng)物體內(nèi)取 0_ （或受精卵）顯微注射受精卵發(fā)育早期培養(yǎng)雌性動(dòng)物的 輸卵管 或子宮

9、內(nèi) 新性狀動(dòng)物4、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞1原核生物特點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、潰傳物質(zhì)相對(duì)較少_2轉(zhuǎn)化：第一步：用 Ca+處理，使細(xì)胞處于 一種能吸收周?chē)h(huán)境中 DNA分子的生理狀態(tài)_，這種細(xì)胞稱為 感受態(tài)細(xì)胞_ ;第二步：將重組表達(dá)載體 DNA 分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在 一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收 DNA 分子，完成轉(zhuǎn)化過(guò)程。（四） 目的基因的檢測(cè)與鑒定1、 檢測(cè)：檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物 DNA是否插入的目的基因，這是目的基因能否在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。方法：采用DNA 分子雜交技術(shù)。如顯示 雜交帶則表明目的基因已插入染色體 DNA 中。2檢測(cè)目的基因是否 轉(zhuǎn)錄出 mRNA ;方

10、法：采用分子雜交技術(shù)。3檢測(cè)目的基因是否_ ;方法：從轉(zhuǎn)基因生物中提取 蛋白質(zhì) ，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行 抗原-抗體雜交 ，若有_ 的出現(xiàn)，表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品。42、 鑒定：除分子水平檢測(cè)外，還可以進(jìn)行個(gè)體水平鑒定。例如，一個(gè)抗蟲(chóng)或 抗病的目的基因?qū)胫参锛?xì)胞后，是否賦予了植物抗蟲(chóng)或抗病特性，需要做抗蟲(chóng)或者抗病的接種實(shí)驗(yàn)_,以確定是否具有抗性及抗性的程度， 又如，有的基因工程產(chǎn)品需要與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行活性比較，以確定 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的功能 活性是否與天然產(chǎn)品相同_1.3 基因工程的應(yīng)用植物基因工程技術(shù)主要用于提高農(nóng)作物的抗逆 能力,以及改良農(nóng)作物的 品質(zhì)和利用植物生產(chǎn)藥物 等方面乳腺生物反應(yīng)

11、器的構(gòu)建：將藥用蛋白 基因與乳腺蛋白基因 的 啟動(dòng)子 等調(diào)控組件重組在一起，通過(guò)顯微注射等方法，導(dǎo)入哺乳動(dòng)物 的 受精卵中，然后,將受精卵送入母體內(nèi)，使其生物發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。用動(dòng)物器官來(lái)解決人類器官移植的問(wèn)題，最大難題是免疫排斥，利用基因工程方法對(duì)豬的器官進(jìn)行改造，方法是將器官供體基因組導(dǎo)入某種調(diào)節(jié)因 子，以抑制 抗原決定 基因的表達(dá)，或設(shè)法除去 抗原決定 基因，再結(jié)合 克隆 技術(shù),培育出沒(méi)有免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆豬器官。基因治療是把正?；?導(dǎo)入病人體內(nèi)，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達(dá)到治療疾病的目的。目前處于初_ 階段。1、4 蛋白質(zhì)工程的崛起1、基因工程在原則上只能生產(chǎn) 自然界中已經(jīng)存在的蛋白質(zhì),天然蛋白質(zhì)的 結(jié)構(gòu)和功能_ 合 特定物種生存的需要，卻不一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要。2、 蛋白質(zhì)工程的目標(biāo)是：根據(jù)人們對(duì)蛋白質(zhì)功能的特定需求，對(duì)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)。由于基因決定蛋白質(zhì)，因此要對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)改造， 最 終還必須通過(guò) 基因 來(lái)完成。3、天然蛋白質(zhì)的合成過(guò)程：基因-表達(dá)（轉(zhuǎn)錄和翻譯）-形成氨基酸序列的多肽鏈 -形成具有高級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋 白質(zhì)-行使生物功能4、蛋白質(zhì)工程的基本途徑：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)-設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列-找 到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列5、 蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律 及其 與