CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基技術(shù)手冊(cè)

1、¥ £ 0* 4“岸J一工I XgBB« _TTJ , £1 i、丿£、'1 flhJL fO_ Cj t >*_b,口.1-l 和 * doJ f *AJTfj，F(xiàn)'Ji 17!> J°f-C1-1 tATCC 'rrirw- CXL*】>；3北京清大天一生物技術(shù)有眼公司CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基技術(shù)手冊(cè)1 CHO細(xì)胞CHO細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 (Chinese Hamster Ovary , CHO) , 1957 年美國(guó)科羅拉多大學(xué) Dr. Theodore T. Puck從一成年雌性倉(cāng)鼠

2、卵巢分離獲得， 為上皮貼壁型細(xì)胞，是目前生物工程上廣泛使用的細(xì)胞系。工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用較多的是CHO-K1細(xì)胞，為轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，細(xì)胞染色體分布頻率是2n = 22，系亞二倍體細(xì)胞。ATCC保存CHO-K1細(xì)胞株，編號(hào)為CCL-61，被廣泛地用于重組DNA蛋白的表達(dá)。由于該細(xì)胞存在遺傳缺陷，無(wú)脯氨酸合成基因，不能將谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?Y-半醛，培養(yǎng)過(guò)程中需在培養(yǎng)基中添加 L-脯氨酸才能生長(zhǎng)。并且由于該細(xì)胞已經(jīng)霍亂毒素適應(yīng)，形態(tài)學(xué)有所改變。最初細(xì)胞為貼壁型細(xì)胞， 經(jīng)多次傳代篩選后，也可懸浮生長(zhǎng)。ATCC提供的CHO-K1細(xì)胞照片CHO細(xì)胞容易發(fā)生基因突變，也較易進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，是良好的哺乳動(dòng)物基因表達(dá)宿主

3、細(xì)胞，代表性細(xì)胞有二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase )營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變細(xì)胞株 (CHO/dhfr -)、轉(zhuǎn)染谷氨酰胺合成酶 (Glutamine synthetase,GS ) 基因的GS-CHO細(xì)胞。二氫葉酸還原酶是真核細(xì)胞核苷酸生物合成過(guò)程中起著重要作用的一種酶，是常用的遺傳選擇標(biāo)記之一，它可催化二氫葉 酸還原成四氫葉酸。對(duì)于 dhfr突變體細(xì)胞而言，由于不能夠合成四氫葉酸，阻斷了正常核酸代謝途徑，因此不能在常規(guī)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但若在培養(yǎng)基中加入次黃嘌吟(hypoxanthine )和胸苷(thymidine )，則突變體細(xì)胞可以借助核苷酸的補(bǔ)救合成途徑維持生長(zhǎng)。

4、利用 dhfr基因進(jìn)行篩選時(shí)，首先將重組DNA分子導(dǎo)入dhfr -表型的受體細(xì)胞，然后撤除原培養(yǎng)基中的的次黃嘌吟和胸苷，即可獲得 dhfr +并能表達(dá)外源基因的克隆細(xì)胞系。因此在挑選表達(dá)外源基因的陽(yáng)性克隆細(xì)胞時(shí)需選用不含次黃 嘌吟和胸苷的培養(yǎng)基。另外，氨甲喋吟(MTX )選擇壓力可使CHO/dhfr -細(xì)胞的外源基因的拷貝數(shù)擴(kuò)增并得到較高水平的表達(dá)。CHO-GS細(xì)胞是用含單抗蛋白等的目的基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因標(biāo)記的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞CHO,再通過(guò)L-氨基亞砜蛋氨酸(methionine sulphoximine ， MSX)等化合物選擇加壓促使 GS基因和目的蛋白基因擴(kuò)增，篩選獲

5、得重組 細(xì)胞株，可在不含谷氨酰胺培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、增殖，可避免或減少細(xì)胞代謝過(guò)程中谷氨酰胺降解積累的氨對(duì)細(xì)胞的損傷、抑制作De；CHO ahiFr'ATCC提供的CHO/dhfr-細(xì)胞照片2 CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn)由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能和基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性，外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)與在原核生物中的表達(dá)存在較 大差異，因而外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)所需的元件也不同于在原核生物細(xì)胞中的表達(dá)所需的元件。外源基因在哺乳 動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)包括基因的轉(zhuǎn)錄、 mRNA 翻譯及翻譯后蛋白質(zhì)的加工等過(guò)程，如蛋白質(zhì)的糖基化、磷酸化、寡聚體的形成以 及蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵的形成等

6、比較復(fù)雜，要表達(dá)具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)如膜蛋白、抗體和具有特異性催化功能的 酶需要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行。哺乳動(dòng)物基因表達(dá)宿主細(xì)胞選擇的基本原則是來(lái)源豐富、轉(zhuǎn)化效率高、表達(dá)效果好， CHO 細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)除具有上述 的特點(diǎn)要求外，還有以下優(yōu)勢(shì)：1）外源基因被整合到宿主染色體上后，在沒(méi)有選擇壓力的情況下能穩(wěn)定保持；2）適合多種蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)，并且很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，便于下游產(chǎn)物分離純化；3）對(duì)培養(yǎng)基的要求較低，可在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)；4）細(xì)胞可進(jìn)行貼壁培養(yǎng)也可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，且具有較高的耐受剪切力和滲透壓能力；5 ）可進(jìn)行高密度大量培養(yǎng)，進(jìn)行較大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)其培養(yǎng)量可放大到 2000

7、0L 以上，是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動(dòng)物基因表達(dá)受 體細(xì)胞之一。另有研究者嘗試將類胰島素生長(zhǎng)因子 IGF 基因和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入 CHO 細(xì)胞獲得能自身分泌必需蛋白的 “超級(jí) CHO ”，無(wú) 需在培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素，細(xì)胞可在無(wú)血清培養(yǎng)基（SFM ）中生長(zhǎng)良好。3 CHO 細(xì)胞在生物制藥中的應(yīng)用目前已有多種外源基因如人組織性纖溶酶原激活劑（ tPA ）、人促紅細(xì)胞生成素（ EPO ）、乙肝表面抗原（ HBsAg ）、干 擾素Y （ IFNy）、干擾素B （ IFNB）、白細(xì)胞介素2 （ IL2 ）、凝血因子別等在 CHO細(xì)胞中得到表達(dá)。在美國(guó)已注冊(cè)的大約 73 種蛋白藥物生產(chǎn)中，應(yīng)用哺乳動(dòng)物

8、細(xì)胞培養(yǎng)的有 35 種， CHO 細(xì)胞培養(yǎng)的就占 27 種，其中包括 10 種單克隆抗體。下表是 以 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)為基質(zhì)生產(chǎn)的重組制品。hnliidUa nuficiuirFear M 叩prm'M jfDXj盹A-iLEGFfcrrt&r搏iu-glLEas daasGcizy 化Vd-bti曲陽(yáng)RlMpnly陰曲vfP霜胥Gbtitb紳IgpClLME測(cè) AVt' ¥ Sjwtb2006h -dLidygii dCb卅t 'il 4-ml1述：三MinojDtyaziTiFriloa WBPhjrrracfejliial23DSLiiferiI

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12、主y s p<xlifE«-d -n Ctih.eae h.jm 0 ror« o=nn4無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基的岀現(xiàn)是培養(yǎng)基發(fā)展歷程上的一個(gè)里程碑，其一般是在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，引入成分完全明確的或部分明確的血清替代成分，使培養(yǎng)基能滿足動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的要求，又可有效的克服因使用血清所引發(fā)的問(wèn)題。進(jìn)入20世紀(jì)80年代后，新的無(wú)血清培養(yǎng)基不斷問(wèn)世，人們經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，只要在培養(yǎng)基中增加某些適于細(xì)胞生長(zhǎng)的成分，如纖連蛋白(fibronectin )、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin, TRF )、胰島素(Insulin )和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth

13、 factor, EGF)等，不少細(xì)胞即能在無(wú)血清供應(yīng)的情況下生長(zhǎng)，尤其是CHO、雜交瘤、骨髓瘤細(xì)胞以及BHK21細(xì)胞等。某些細(xì)胞在無(wú)血清的條件下，其生長(zhǎng)和抗體的產(chǎn)量甚至較有血清培養(yǎng)時(shí)高岀數(shù)倍。目前，無(wú)血清培養(yǎng)基的研究有兩個(gè)方向：一是培養(yǎng)基中不含有任何動(dòng)物來(lái)源的添加組分；二是培養(yǎng)基中不含有不明確的添 加組分。依此可以將當(dāng)前應(yīng)用較多的無(wú)血清培養(yǎng)基歸納為以下四種：(1) 無(wú)血清培養(yǎng)基，為一般意義上無(wú)血清培養(yǎng)基，用各類可替代血清功能的生物材料配制細(xì)胞培養(yǎng)基，如牛血清白蛋白(BSA)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等生物大分子物質(zhì)，以及從血清中提取的去除蛋白質(zhì)的混合脂類以及水解蛋白等。其特點(diǎn)是培養(yǎng)基中的蛋白含量較高

14、，添加物質(zhì)的化學(xué)成分不明確，其中含有大量的動(dòng)物來(lái)源蛋白。(2) 無(wú)動(dòng)物來(lái)源培養(yǎng)基，許多商業(yè)公司開發(fā)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源培養(yǎng)基是基于生產(chǎn)重組藥物的安全考慮，培養(yǎng)基中的添加組分無(wú) 動(dòng)物來(lái)源，需要的蛋白來(lái)源于重組蛋白或者蛋白水解物，這些組分可以保障細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的需要。(3) 無(wú)動(dòng)物蛋白培養(yǎng)基，培養(yǎng)基完全不用動(dòng)物來(lái)源的蛋白，但仍有部分添加物是來(lái)源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片 段等其他衍生物。此類培養(yǎng)基組分相對(duì)穩(wěn)定，但必須添加類固醇激素和脂類前體，并且對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞是高度特異性的。(4) 化學(xué)組分限定培養(yǎng)基，此類培養(yǎng)基是目前最安全、最為理想的培養(yǎng)基，首先可以保證培養(yǎng)基批次間的一致性，其中所 添加的少量動(dòng)物來(lái)

15、源的蛋白水解物、 蛋白都是成分明確的組份。 其特點(diǎn)是培養(yǎng)基的性質(zhì)明確， 有利于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的代謝研究， 同時(shí)分離純化也比較方便。研究者對(duì) CHO 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的開發(fā)比較深入，目前有多種用于 CHO 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)的培養(yǎng)基面世，形成了很多固 定的商業(yè)配方，這些配方有的是專利保護(hù)的，有的是商業(yè)秘密。國(guó)外有部分優(yōu)秀的無(wú)血清培養(yǎng)基，但價(jià)格昂貴。CHO 細(xì)胞存在多種克隆細(xì)胞系，僅 ATCC 保存的 CHO 細(xì)胞就多達(dá) 38 種，再加上各公司或研究單位構(gòu)建的細(xì)胞，其克隆 細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)不止這些。 對(duì)于 CHO 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)而言， 由于構(gòu)建的各種高性能 CHO 細(xì)胞系不同， 不同克隆細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)要求也 都非

16、常的不同，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求往往是個(gè)性化的。另外， CHO 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的不同培養(yǎng)階段、重組 CHO 細(xì)胞構(gòu)建的各個(gè)階段，細(xì) 胞代謝所需的營(yíng)養(yǎng)或限制因素也是不同的，即同一細(xì)胞系在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程也需要使用不同的培養(yǎng)基，需要與之相對(duì)應(yīng)的個(gè)性化 培養(yǎng)基( Customed Cell Culture Medium)。5 CHO 細(xì)胞無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分培養(yǎng)基( SAF-CHO-G-004 )其實(shí)個(gè)性化培養(yǎng)基并不新鮮，在國(guó)外生物制藥企業(yè)普遍采用個(gè)性化培養(yǎng)基，世界著名的生物制藥公司(如 Amgen 、Genetech )往往和培養(yǎng)基企業(yè)合作，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)基的客戶定制方式，研制最適合自身細(xì)胞特點(diǎn)的個(gè)性化細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用于

17、生產(chǎn)實(shí)踐，用于提高細(xì)胞產(chǎn)率和生產(chǎn)效率。另有數(shù)據(jù)顯示，國(guó)際上的細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)，個(gè)性化、定制培養(yǎng)基占其培養(yǎng)基業(yè) 務(wù)的 90% 以上，目錄培養(yǎng)基不足 10% 。北京清大天一生物技術(shù)有限公司依托于在細(xì)胞培養(yǎng)基研發(fā)和動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方面具有豐富經(jīng)驗(yàn)的研發(fā)團(tuán)隊(duì)，潛心研 究，開發(fā)研制了多種個(gè)性化培養(yǎng)基，通過(guò)在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用已取得可喜的成果，如 CHO 細(xì)胞無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分細(xì)胞培養(yǎng)基 (SAF-CHO-G-004 )就是其中之一。5.1 CHO 細(xì)胞無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分培養(yǎng)基( SAF-CHO-G-004 )的特點(diǎn)SAF-CHO-G-004 (代碼： SAF108 )是北京清大天一生物技術(shù)有限公司開發(fā)的新

18、一代 CHO 細(xì)胞無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分細(xì)胞培養(yǎng)基，能支持多種CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)維持，可廣泛應(yīng)用于CHO細(xì)胞的無(wú)血清懸浮培養(yǎng)及抗體、重組蛋白的生產(chǎn)過(guò)程。細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品的生產(chǎn)、檢驗(yàn)嚴(yán)格執(zhí)行GMP管理和IS09001管理體系，符合生物制藥原輔料要求，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。1） SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基系無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分培養(yǎng)基，不含有血清替代物、動(dòng)物來(lái)源蛋白等動(dòng)物來(lái)源組分，化學(xué) 成分明確，保證了細(xì)胞培養(yǎng)中原輔料的使用安全性；2） SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基能支持多種 CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)、維持，具有較為廣泛的適用性；3 ）適用于實(shí)驗(yàn)研究和大規(guī)模培養(yǎng)應(yīng)用；4） 根據(jù)用戶的不同使用，可定制SAF-CH

19、O-G-004 培養(yǎng)基，以滿足CHO/dhfr -、GS-CHO等不同系統(tǒng)的應(yīng)用需求;5）有多種包裝規(guī)格可供選擇，滿足不同用戶的使用需求。5.2 CHO 細(xì)胞無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)效果使用SAF-CHO-G-004 細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)已馴化過(guò)的 CHO細(xì)胞，圖1是CHO細(xì)胞接種密度為2X 10 5cells/ml時(shí)的細(xì)胞 生長(zhǎng)曲線，可以看到，經(jīng)過(guò) 3 -4天的培養(yǎng)過(guò)程，細(xì)胞密度可提高到細(xì)胞 4-5 X 106cells/mI ，細(xì)胞活率超過(guò)90 %，細(xì)胞擴(kuò)增 了二十多倍。圖2是細(xì)胞批培養(yǎng)的葡萄糖和乳酸代謝情況。圖3和圖4分別表示培養(yǎng)了 96小時(shí)（4天）的CHO臺(tái)盼藍(lán)染色和細(xì)胞顯微照片，細(xì)胞

20、形態(tài)飽滿、健康。5 4 £ I O圖1.CHO細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖2. CHO細(xì)胞批培養(yǎng)葡萄糖和乳酸代謝情況圖3培養(yǎng)96hr的臺(tái)盼藍(lán)染色的 CHO細(xì)胞圖4培養(yǎng)第96hr的CHO懸浮細(xì)胞5.3 CHO細(xì)胞無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分細(xì)胞培養(yǎng)基使用說(shuō)明5.3.1 成分無(wú)機(jī)鹽氯化鈣、五水硫酸銅、七水合硫酸亞鐵、氯化鉀、六水合氯化鎂、五水硫酸鎂、氯化鈉、無(wú)水磷酸二氫鈉、無(wú)水磷酸氫二鈉、七水合硫酸鋅等氨基酸L-鹽酸精氨酸、L-胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-鹽酸組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-鹽酸賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-天門冬酰胺、L-天門冬氨酸

21、、L-鹽酸半胱氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸等維生素維生素Bi、維生素B2、維生素B12、維生素C、維生素H、鹽酸吡哆醇、鹽酸吡哆醛、肌醇、葉酸等其它無(wú)水葡萄糖、HEPES、丙酮酸鈉、亞油酸、硫辛酸、胰島素、亞硒酸鈉、植物蛋白等SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基毎升標(biāo)示量27.80g ，含L-谷氨酰胺、次黃嘌吟和胸苷，可根據(jù)客戶使用需求定制不含谷氨酰胺或次黃嘌呤、胸苷的無(wú)血清培養(yǎng)基，具體的成分、標(biāo)示量等詳見對(duì)應(yīng)產(chǎn)品的說(shuō)明書。5.3.2 貯存2 C- 8 'C冷藏，干燥、密封、避光貯藏?！举A存期限】：暫定一年。5.3.3配制方法（以1L包裝為例）-30 C）到950毫升，輕微攪拌溶解;2

22、. 2）加入1.9克碳酸氫鈉；3. 3）輕微攪拌溶解，加注射用水至1 升;4. 4）如有必要，用1mol / L氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)pH至所需值;5. 5）用0.2濾膜正壓過(guò)濾除菌；6. 6）溶液應(yīng)在2 °C -8 C下避光保存5.3.4 SAF-CHO-G-004培養(yǎng)基不同NaHCO 3加量的pH、滲透壓參考對(duì)照表SAF-CHO-G-O的pH、秦透壓筆再對(duì)黑丟7,47276 86.6O. 6 46J265.85 65 40460400350300250200150100501,9 Z 3 Z7 3, 13.5pis 浮逮玉TCim031 94. 34. 7靈醱矍踴舊丄）5.4

23、CHO 細(xì)胞無(wú)血清馴化在含血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的 CHO細(xì)胞可經(jīng)過(guò)一定的細(xì)胞馴化過(guò)程，適應(yīng)SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)。已經(jīng)適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)的 CHO細(xì)胞可直接在SAF-CHO-G-004中實(shí)現(xiàn)無(wú)血清培養(yǎng)培養(yǎng)，建議前二代的細(xì)胞密度不低于54 X10 cells/ml 。細(xì)胞的無(wú)血清馴化過(guò)程如下：1. 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁 CHO細(xì)胞，活率大于95%，開始進(jìn)行無(wú)血清馴化。2. 細(xì)胞馴化可以在方瓶（T-flask ）、搖瓶（shake-flask ）或轉(zhuǎn)瓶（spinner-bottle）中進(jìn)行。3. 將無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基的按1 : 1 (V/V )的比例進(jìn)行混合，接種密度為2 4 X10 cells/ml的細(xì)胞，在37 'C、5 % CO 2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。4. 根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)和活率情況，在降血清的每一階段可穩(wěn)定傳代1 3代，接種密度維持在 2-