葛根芩連湯上清液與沉淀中異黃酮類成分指紋圖譜的研究

1、葛根芩連湯上清液與沉淀中異黃酮類成分指紋圖譜的【論文集】研究                                          作者：譚曉梅閆琰羅佳波張瑋 【關(guān)鍵詞】葛根芩連湯；,指紋

2、圖譜；,上清液；,沉淀 摘要：目的通過(guò)應(yīng)用三維高效液相色譜，建立葛根芩連湯上清液和沉淀中異黃酮指紋圖譜的方法，明確其上清液和沉淀中異黃酮類成分的異同，以便進(jìn)一步探討該方的配伍規(guī)律。方法葛根素、大豆苷元用甲醇溶解制成對(duì)照品溶液，葛根藥材水煎液、葛根芩連湯上清液、沉淀用二甲基亞砜溶解制成供試品溶液，采用三維高效液相譜對(duì)葛根芩連制劑進(jìn)行指紋圖譜實(shí)驗(yàn)研究，流動(dòng)相為甲醇水乙腈梯度洗脫，掃描波長(zhǎng)為200400nm。結(jié)果在梯度洗脫條件下，葛根芩連湯上清液的HPLC指紋圖譜中有6個(gè)標(biāo)識(shí)性共有峰，葛根芩連湯沉淀的HPLC指紋圖譜中有4個(gè)標(biāo)識(shí)性共有峰。但峰面積僅占上清液的8%（以葛根素計(jì)）。結(jié)論葛根芩連湯配伍產(chǎn)生

3、的沉淀中亦有異黃酮類有效部位，但與上清液比較，含量較低。說(shuō)明君藥葛根中異黃酮類成分與方劑中的其他物質(zhì)絡(luò)合而產(chǎn)生沉淀，且該沉淀溶于二甲基亞砜。 關(guān)鍵詞：葛根芩連湯；指紋圖譜；上清液；沉淀 葛根芩連湯原載于東漢張仲景傷寒論中，由葛根、黃芩、黃連、炙甘草4味中藥組成。其處方為：葛根15g，黃芩9g，黃連9g，甘草(炙)6g。其中葛根為君藥，黃芩、黃連為臣藥，炙甘草為使藥。功效主要是表里雙解，清熱止痢。中藥配伍在煎煮過(guò)程中，其成分發(fā)生復(fù)雜的變化，其中沉淀反應(yīng)是中藥配伍共煎時(shí)常見(jiàn)的變化。日本學(xué)者于1978年首次報(bào)道黃連配伍甘草、大黃時(shí)小檗堿等生物堿在煎劑中的含量大幅度下降1。其沉淀能溶于二甲基亞砜，部分

4、溶于吡啶、稀酸、稀堿，微溶于冷甲醇、乙醇，不溶于氯仿、石油醚、在熱甲醇中能不斷溶解，冷后又生成沉淀2。沉淀使煎液中有效成分的含量降低，且有研究表明，黃連黃芩配伍產(chǎn)生的沉淀，能夠在胃腸內(nèi)溶解3，但葛根芩連湯配伍后究竟是哪些成分發(fā)生沉淀反應(yīng)，目前尚未有明確的結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)試圖通過(guò)指紋圖譜的方法，探明其上清液與沉淀中異黃酮成分的異同，以明確沉淀物中是否有異黃酮類成分。 1儀器與試藥 美國(guó)惠普HP1100高效液相色譜儀，G1315A紫外可見(jiàn)光二級(jí)管陣列檢測(cè)器，離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），甲醇(分析純，天津大茂學(xué)試劑廠)、甲醇（色譜純，MERCK)，乙腈(色譜純)，葛根素對(duì)照品753200007、大豆苷元

5、對(duì)照品1502200101(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；葛根、黃芩、黃連、甘草藥材由廣東省致信藥材公司提供,經(jīng)本校中藥鑒定教研室劉傳明講師鑒定,分別為豆科植物野葛PuerarialobataOhwi,唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi干燥根莖,毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.干燥根莖,豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.干燥根莖(蜜炙)。 2方法 2.1葛根芩連湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶劑的制備葛根15g，黃芩9g，黃連9g，甘草6g，燒杯中加水400ml,先煎葛根20min,余藥共煎30min,煎兩次,趁熱120

6、目濾布濾過(guò),合并濾液。90定容至1000ml,靜置室溫后，于冰箱4內(nèi)靜置24h，取出，離心以3000r/min，得到上清液，定容到1000ml，為供試品溶液1；沉淀于烘箱內(nèi)50干燥24h后，加適量二甲基亞砜使溶解，定容到1000ml，過(guò)濾，得供試品溶液2。 2.2色譜條件甲醇水乙腈梯度洗脫4，5檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。結(jié)果見(jiàn)表1。依據(jù)DAD檢測(cè)的三維圖譜,選擇可將全譜物質(zhì)均能檢測(cè)到的250nm作為最后的檢測(cè)波長(zhǎng)(圖13)。 表1梯度洗脫條件（略） 圖1葛根藥材水煎液（略） 圖2葛根全方上清液（略） 圖3葛根芩連全方沉淀（略） 2.3對(duì)照溶液的制備     

7、60;                    2.6精密度實(shí)驗(yàn)取對(duì)照藥材溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰共有15個(gè)，其中6個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于1%，其共有峰的峰面積占總峰面積的78%83%，各譜圖相似度為0.999。結(jié)果見(jiàn)圖4。 圖4對(duì)照藥材指紋色譜圖（略） 2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)平行做6份湯劑，同供試品1的制備方法，測(cè)定，測(cè)得峰共有18個(gè)，其中6個(gè)主要峰保留時(shí)間RSD小于1%，共有峰占總峰面積的56%62%，

8、各譜圖相似度為0.9920.995，表明其重復(fù)性實(shí)驗(yàn)較好。結(jié)果見(jiàn)圖5。 圖5葛根芩連湯上清液重復(fù)性考察指紋色譜圖（略） 2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液1，分別在0，2，4，6，8，12，24h，測(cè)得其中6個(gè)主要峰保留時(shí)間RSD小于2%，共有峰占總峰面積的55%67%，各共有各譜圖相似度為0.9890.997，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)圖6。 圖6葛根芩連湯上清液穩(wěn)定性考察指紋色譜圖（略） 3結(jié)果 葛根藥材水煎液中在250nm左右有最大吸收的物質(zhì)有6種，其紫外吸收行為如圖1，指紋圖譜見(jiàn)圖7，葛根芩連全方水煎液的上清液中最大吸收為250nm的主要吸收峰的紫外吸收行為見(jiàn)圖1，指紋圖譜見(jiàn)圖8，葛

9、根芩連全方沉淀中最大吸收在250nm附近的主要吸收峰，其紫外吸收行為見(jiàn)圖3，沉淀的指紋圖譜見(jiàn)圖9。 圖7葛根藥材水煎指紋圖譜（略） 圖8葛根全方上清液指紋圖譜（略） 圖9葛根芩連全方沉淀指紋圖譜（略） 4討論 由圖79指紋圖譜可以看出，葛根芩連全方上清液與葛根水煎藥材均具有特征性色譜16號(hào)峰，而葛根芩連全方沉淀中僅有36號(hào)峰，上清液中1號(hào)峰、2號(hào)峰、5號(hào)峰在所有峰中所占組分較藥材中高（以葛根素為1計(jì)），4號(hào)峰較藥材中低，6號(hào)峰兩者含量相當(dāng)。從總體上講，上清液與沉淀中葛根素含量之和與藥材單煎的含量相當(dāng)。沉淀產(chǎn)生的原因可能是由于黃連中生物堿類成分為堿性，而葛根中的異黃酮類成分呈酸性，全方煎液為酸性

10、，可能由于煎煮過(guò)程中pH值的改變而產(chǎn)生沉淀。黃連中的小檗堿、巴馬丁、藥根堿、黃連堿均為季銨堿，其結(jié)構(gòu)中的氮原子以離子狀態(tài)存在，同時(shí)含有以負(fù)離子形式存在的羥基，而葛根中的葛根素具有7位酚羥基，大豆苷元具有4位酚羥基6，可能與氮離子絡(luò)合形成絡(luò)合物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，配伍后葛根也與方劑中其他藥物發(fā)生沉淀反應(yīng)，產(chǎn)生的沉淀中存在異黃酮類成分，但含量較低，可能是因?yàn)槿街苿┲泻悬S芩黃酮類、甘草酸類成分，三者存在競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步探討，在制備成方制劑的過(guò)程中，不能夠簡(jiǎn)單將沉淀拋棄處理。 參考文獻(xiàn)： 1野口衛(wèi).漢方制劑分析技術(shù)(胡寶華譯)M.北京：人民衛(wèi)生出版社，1986：39. 2齊粱，彭嘉柔，濮訓(xùn)生，等.黃連一黃芩藥對(duì)煎煮液沉淀物的分析J.中國(guó)中藥雜志，1999，24（6）：352. 3任謙，李建榮，張廣平，等.瀉心湯沉淀物在人工