固相肽的合成

1、固態(tài)相的合成多肽藥物的研究與開(kāi)發(fā)作為二十一世紀(jì)高新技術(shù)竟?fàn)幍闹饕?xiàng)目之一。生物活性多肽在內(nèi)源性物質(zhì)中占有非常重要的地位，除酶、受體、金屬蛋白等生物大分子外，許多合成或分離的多肽對(duì)生理過(guò)程或病理過(guò)程，對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展或治療過(guò)程有重要意義。氨基酸彼此以酰胺鍵（也稱(chēng)肽鍵）相互連接的化合物稱(chēng)作肽。一種肽含有的氨基酸少于10個(gè)就稱(chēng)作寡肽，超過(guò)的就稱(chēng)為多肽。多肽與蛋白質(zhì)只有肽鏈長(zhǎng)短之別，二者間并沒(méi)有嚴(yán)格的區(qū)分。蛋白質(zhì)是生命存在的最基本形式。可見(jiàn)多肽是生命之"橋"，蛋白質(zhì)工程從某種意義上而言就是研究多肽。事實(shí)上，肽類(lèi)藥物開(kāi)發(fā)與應(yīng)用已走出科學(xué)家們的實(shí)驗(yàn)室，變成了現(xiàn)實(shí)，并發(fā)揮著其獨(dú)特的功效

2、。例如，神經(jīng)緊張肽（NT）能降低血壓，對(duì)腸和子宮具有收縮作用；內(nèi)啡肽和腦啡肽的衍生物有著很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用；促甲狀腺素釋放激素（TRH）是一種能促進(jìn)產(chǎn)婦乳汁分泌的多肽；能治療糖尿病、胃潰瘍、胰腺炎的多肽是一種環(huán)狀的14肽；臨床上常用的催產(chǎn)素是一種多肽；已獲廣泛應(yīng)用的白蛋白多肽、胸腺肽、血清胸腺因子（FTS）等均可以引起免疫T細(xì)胞的分化；近日來(lái)在中國(guó)及日本已開(kāi)始使用的糖肽輔助治療腫瘤，其作用機(jī)理是使淋巴系統(tǒng)活化等等。應(yīng)用多肽技術(shù)開(kāi)發(fā)的醫(yī)用蛋白質(zhì)芯片（肽芯片）只有指甲蓋大小，放置了與腎炎、胃潰瘍和胃癌等相關(guān)的抗原分子，只要通過(guò)芯片閱讀儀便可檢測(cè)到有關(guān)疾病的功能狀態(tài)與變異情況。其功能已相當(dāng)于一個(gè)大型或中

3、型實(shí)驗(yàn)室、化驗(yàn)室，效率是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)檢測(cè)的成百上千倍，受檢者幾乎沒(méi)有任何痛苦。肽芯片的廣泛應(yīng)用，已在醫(yī)學(xué)臨床檢測(cè)業(yè)引發(fā)一場(chǎng)技術(shù)革命。自從1963年MERRIFIELD發(fā)展成功了固相多肽合成（SPPS）方法以來(lái)，經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)和完善，到今天這個(gè)方法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個(gè)常用技術(shù)，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。伴隨著分子生學(xué)物、生物化學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，多肽研究取得了驚人的、劃時(shí)代的飛躍。人們發(fā)現(xiàn)存在于生物體的多肽有數(shù)萬(wàn)種，并且發(fā)現(xiàn)所有的細(xì)胞均能合成多肽。同時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞也都受多肽調(diào)節(jié)，它涉及激素、神經(jīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)與生殖等各個(gè)領(lǐng)域，21世紀(jì)是一個(gè)多肽的世界，人們研究多肽，也渴望著將多肽

4、應(yīng)用到醫(yī)療、保健、檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域中去，為人類(lèi)造福。固相合成的主要設(shè)計(jì)思想是：先將所要合成肽鏈的羧末端氨基酸的羧基以共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)同一個(gè)不溶性的高分子樹(shù)脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組分經(jīng)過(guò)脫去氨基保護(hù)基并同過(guò)量的活化羧基組分反應(yīng)接長(zhǎng)肽鏈。這樣的步驟可以重復(fù)的多次進(jìn)行下去，即縮合洗滌去保護(hù)中和和洗滌下一輪縮合，最后達(dá)到所需要合成的肽鏈長(zhǎng)度。目前合成多肽的方法主要有液相合成法和固相合成法。在液相肽合成中，每次接肽以后都需要對(duì)產(chǎn)物分離純化或結(jié)晶以便除去未反應(yīng)的原料和副產(chǎn)物。這個(gè)步驟相當(dāng)費(fèi)時(shí)間而且麻煩，因操作帶來(lái)的損失往往也很大。為了減少這個(gè)麻煩并期望能夠使接肽反應(yīng)自動(dòng)化，麥瑞菲爾德（

5、Merrifield）于1963年發(fā)展成功了固相肽合成方法，他用這個(gè)方法獲得了結(jié)晶的LeuAlaGlyVal四肽。與之差不多同時(shí)，勒辛格（Letsinger）和柯?tīng)杻?nèi)特（Kornet）也用固相載體經(jīng)不同的化學(xué)途徑合成了LeuGly。以后又經(jīng)過(guò)麥瑞菲爾德本人以及其它實(shí)驗(yàn)室對(duì)這個(gè)方法進(jìn)行不斷的改進(jìn)和完善，使之到今天已經(jīng)成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個(gè)常用的技術(shù)。為此麥瑞菲爾德獲得了1984年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。固相合成的基本原理多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過(guò)程，合成一般從C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。過(guò)去的多肽合成是在溶液中進(jìn)行的，但自從1963年Merrifield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來(lái)，

6、經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個(gè)常用技術(shù)，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。其基本原理是：先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)同一個(gè)不溶性的高分子樹(shù)脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過(guò)脫去氨基保護(hù)基并同過(guò)量的活化羧基組分反應(yīng)，接長(zhǎng)肽鏈。重復(fù)（縮合洗滌去保護(hù)中和和洗滌下一輪縮合）操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長(zhǎng)度，最后將肽鏈從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，經(jīng)過(guò)純化等處理，即得所要的多肽。其中-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保護(hù)的稱(chēng)為BOC固相合成法，-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保護(hù)的稱(chēng)為FMOC固相合成法。條件選擇將固相合成與其他技術(shù)分開(kāi)來(lái)的最

7、主要的特征是固相載體，能用于多肽合成的固相載體必須滿(mǎn)足如下要求：必須包含反應(yīng)位點(diǎn)（或反應(yīng)基團(tuán)），以使肽鏈連在這些位點(diǎn)上，并在以后除去；必須對(duì)合成過(guò)程中的物理和化學(xué)條件穩(wěn)定；載體必須允許在不斷增長(zhǎng)的肽鏈和試劑之間快速的、不受阻礙的接觸；另外，載體必須允許提供足夠的連接點(diǎn)，以使每單位體積的載體給出有用產(chǎn)量的肽，并且必須盡量減少被載體束縛的肽鏈之間的相互作用。用于固相法合成多肽的高分子載體主要有三類(lèi)：聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹(shù)脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇類(lèi)樹(shù)脂及衍生物，這些樹(shù)脂只有導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)，才能直接連上（第一個(gè)）氨基酸。根據(jù)所導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)的不同，又把這些樹(shù)脂及樹(shù)脂衍生物分為氯甲基樹(shù)脂、羧基樹(shù)脂、

8、氨基樹(shù)脂或酰肼型樹(shù)脂。BOC合成法通常選擇氯甲基樹(shù)脂，如Merrifield樹(shù)脂；FMOC合成法通常選擇羧基樹(shù)脂如王氏樹(shù)脂。氨基酸的固定主要是通過(guò)保護(hù)氨基酸的羧基同樹(shù)脂的反應(yīng)基團(tuán)之間形成的共價(jià)鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)的，形成共價(jià)鍵的方法有多種：氯甲基樹(shù)脂，通常先制得保護(hù)氨基酸的四甲銨鹽或鈉鹽、鉀鹽、銫鹽，然后在適當(dāng)溫度下，直接同樹(shù)脂反應(yīng)或在合適的有機(jī)溶劑如二氧六環(huán)、DMF或DMSO中反應(yīng)；羧基樹(shù)脂，則通常加入適當(dāng)?shù)目s合劑如DCC或羧基二咪唑，使被保護(hù)氨基酸與樹(shù)脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基樹(shù)脂或酰肼型樹(shù)脂，卻是加入適當(dāng)?shù)目s合劑如DCC后，通過(guò)保護(hù)氨基酸與樹(shù)脂之間形成的酰胺鍵來(lái)完成氨基酸的固定。保護(hù)脫除要成

9、功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對(duì)暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護(hù)，同時(shí)對(duì)氨基酸側(cè)鏈上的活性基因也要保護(hù)，反應(yīng)完成后再將保護(hù)基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多采用烷氧羰基類(lèi)型作為氨基的保護(hù)基，因?yàn)檫@樣不易發(fā)生消旋。最早是用芐氧羰基，由于它需要較強(qiáng)的酸解條件才能脫除，所以后來(lái)改為叔丁氧羰基（BOC）保護(hù)，用TFA（三氟乙酸）脫保護(hù)，但不適用含有色氨酸等對(duì)酸不穩(wěn)定的肽類(lèi)的合成。1978年，chang Meienlofer和Atherton等人采用Carpino報(bào)道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作為氨基保護(hù)基，F(xiàn)moc基對(duì)酸很穩(wěn)定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫去，近年來(lái)，F(xiàn)

10、moc合成法得到了廣泛的應(yīng)用。羧基通常用形成酯基的方法進(jìn)行保護(hù)。甲酯和乙酯是逐步合成中保護(hù)羧基的常用方法，可通過(guò)皂化除去或轉(zhuǎn)變?yōu)殡乱员阌糜谄瑪嘟M合；叔丁酯在酸性條件下除去；芐酯常用催化氫化除去。對(duì)于合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側(cè)鏈功能基的氨基酸的肽來(lái)說(shuō)，為了避免由于側(cè)鏈功能團(tuán)所帶來(lái)的副反應(yīng)，一般也需要用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基將側(cè)鏈基團(tuán)暫時(shí)保護(hù)起來(lái)。保護(hù)基的選擇既要保證側(cè)鏈基團(tuán)不參與形成酰胺的反應(yīng)，又要保證在肽合成過(guò)程中不受破壞，同時(shí)又要保證在最后肽鏈裂解時(shí)能被除去。如用三苯甲基保護(hù)半胱氨酸的S-，用酸或銀鹽、汞鹽除去；組氨酸的咪唑環(huán)用2,2,2-三氟-1-芐氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰

11、基乙基保護(hù)，可通過(guò)催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛烷氧羰基（Adoc）保護(hù)，用冷的三氟乙酸脫去。固相中的接肽反應(yīng)原理與液相中的基本一致，將兩個(gè)相應(yīng)的氨基被保護(hù)的及羧基被保護(hù)的氨基酸放在溶液內(nèi)并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經(jīng)常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強(qiáng)的失去劑（如碳二亞氨）形成對(duì)稱(chēng)酸酐等方法來(lái)形成酰胺鍵。其中選用DCC、HOBT或HOBT/DCC的對(duì)稱(chēng)酸酐法、活化酯法接肽應(yīng)用最廣。 裂解及合成肽鏈的純化 BOC法用TFA HF裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基，F(xiàn)MOC法直接用TFA，有時(shí)根據(jù)條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也被采用。合成肽鏈進(jìn)一步的精制、分離與

12、純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細(xì)管電泳等。 HPLC分析純化分析HPLC使用柱子和泵系統(tǒng)，可以經(jīng)受傳遞高壓，這樣可以用極細(xì)的微粒（3-10 m）做填料。由此多肽要在幾分鐘內(nèi)高度被分析。HPLC分兩類(lèi)：離子交換和反相。 離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現(xiàn)出相反電荷。分離是一種電荷相互作用，通過(guò)可變PH， 離子強(qiáng)度， 或兩者洗脫出多肽，通常， 先用低離子強(qiáng)度的溶液，以后逐漸加強(qiáng)或一步一步加強(qiáng)，直到多肽火柱中洗脫出。離子交換分離的一個(gè)例子使用強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱。如sulfoethylaspar

13、timide通過(guò)酸性PH中帶正電來(lái)分離。反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過(guò)疏水作用連到柱上，用降低離子強(qiáng)度洗脫， 如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價(jià)吸附到硅上的碳?xì)渫殒湗?gòu)成，這種鏈長(zhǎng)度為G4-G8碳原子。 由于洗脫是一種疏水作用。大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。 然而，總體實(shí)踐中， 這兩類(lèi)柱互變無(wú)多少顯著差別，別類(lèi)載體由碳水化合物構(gòu)成， 比如苯基。典型的操作常由兩綬沖劑組成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA-H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見(jiàn)分析和純化用柱為4.6×250mm(3-10 m)和22×250mm(10 m). 如果用徑向填柱，那么大小是8×100（3-10 m）和25×250mm(10 m)。大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸， 稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸鈉/氨，TFA/TEA，磷酸鈉或鉀，異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑，但要注意一點(diǎn)：硅反相柱料不能長(zhǎng)