細(xì)胞凋亡途徑

1、彼岸花 524332169細(xì)胞的凋亡凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis , lAPs)是細(xì)胞內(nèi)一類獨(dú)特的抗凋亡蛋白家族，包括XIAP, C-IAP1, C-IAP2，神經(jīng)元凋亡抑制蛋白(NIAP) ,ML-IAR Apollon 和 survivin。IAPs通過在體外或體內(nèi)抑制不同的caspases而抗細(xì)胞凋亡。與其他的可抑制上游caspases的蛋白不同，IAPs是唯一的內(nèi)源性 caspase抑制物【1】。Survivin(生存素)是凋亡抑制蛋白家族中的成員，是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，于1997年由耶魯大學(xué) Alfieri【2】等用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體1(eff

2、ector-cell protease receptor 1, ERP-1)在人類基因庫的雜交中分離出來，Survivin大量表達(dá)于胚胎及嬰幼兒組織中，在正常的分化組織中幾乎檢測不到【3】，然而卻在60余種腫瘤細(xì)胞株和大部分人體腫瘤組織過度表達(dá)。1.Survivin的分子結(jié)構(gòu)IAP家族蛋白一般在 N末端含有23個(gè)串聯(lián)的含有 Cys/ His的保守冠狀病毒IAP重復(fù) 序列結(jié)構(gòu)域(Baculovirus IAP Repeat, BIR,發(fā)揮著極為重要的凋亡抑制作用。IAPs家族發(fā)揮抗凋亡作用的機(jī)理是通過BIR功能區(qū)之間的連接序列直接與Caspases家族蛋白結(jié)合，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。多數(shù)IAPs的

3、C末端還含有一個(gè)環(huán)指狀結(jié)構(gòu)域(RING-finger domain)能夠與兩個(gè)鋅原子形成配位鍵。這一鋅指結(jié)構(gòu)對(duì)于IAPs家族蛋白抗凋亡的功能密切相關(guān)。只有包含BIR2功能區(qū)的IAPs蛋白分子才具有結(jié)合和抑制死亡蛋白酶的功能，單一BIR1, BIR3或環(huán)指結(jié)構(gòu)以及它們的任意組合蛋白體均無此效應(yīng)。Ambrosini等【4】測定并繪出了 Survivin基因完整的基因圖譜，全長14796 bp，位于距離端粒約3%的位置。Survivin基因與EPR-1基因的編碼區(qū)序列高度互補(bǔ)，位于染色體17q25的同一基因族，含有3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子，編碼產(chǎn)生1個(gè)由142個(gè)氨基酸組成的胞漿蛋 白，分子量約為16.

4、 5kD。Survivin只含有一個(gè)BIR區(qū)域，C末端有一個(gè)a卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，不 含環(huán)指狀結(jié)構(gòu)域【5】。Survivin是唯一具有剪接異構(gòu)體的IAP基因，一個(gè)是序列中缺少外顯子3的survivin- EX3另一個(gè)是把部分內(nèi)含子2作為隱蔽的外顯子的survivin-2B。兩者序列的改變導(dǎo)致了相應(yīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了顯著變化，survivin- EX3仍保留抗凋亡特性，survivin-2B抗凋亡功能則顯著下降 。2004年Badran A等7發(fā)現(xiàn)survivin的另一新剪接異構(gòu)體survivin-3B,survivin-3B含有5個(gè)外顯子，比survivin多3B外顯子，survivin-3B包

5、含單一的BIR,這對(duì)于其抗調(diào)亡作用致關(guān)重要。最近，包含兩個(gè)外顯子，3'為197bp的內(nèi)含子的survivin-2 a發(fā)現(xiàn)【8】。其終止密碼在第2內(nèi)含子，編碼產(chǎn)生74個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。survivin的剪接異構(gòu)體的功能尚不清 楚，初步認(rèn)為survivin- EX與線粒體依賴性凋亡通路有關(guān)，另外，證實(shí)survivin-2 a能減弱survivin的抗凋亡活性7。Survivin的異構(gòu)體如圖 1。彼岸花 524332169Um* 斗 rnUhJK *uwf vin_ w $ nNEm<mi 3 E*on 4 mRNA fturvivin 2B*-«. I LMMt4 1XUT

6、R rrtRNA survivin x£k3-* 立 &MHR 工品 mRNA *urvivin 3ES詢3Z -玄 ura r II1H N A Murvivifi t圖1: Survivin異構(gòu)體外顯子結(jié)構(gòu) Survivin基因片段有4個(gè)外顯子；Survivin-2B則在2,3 號(hào)外顯子間多出 2B外顯子；Survivin- EX顯示3號(hào)外顯子缺失，并且讀碼框架延伸至ORF的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）； Survivin-3B除含survivin常規(guī)片斷所有的外顯子外，在3,4號(hào)外顯子之間多一外顯子3B。survivin-2a包含兩個(gè)外顯子，3'為

7、197bp非翻譯區(qū)（3'UTR）。Survivin與其他IAP家族成員不同有以下三點(diǎn)，哺乳動(dòng)物的lAPs中往往含有重復(fù)23次的BIR單元，這一序列是其凋亡抑制作用的基本要素，而survivin是迄今發(fā)現(xiàn)的IAPs中惟一的含單個(gè)BIR單元的成分；Survivin的BIR中含有對(duì)抑制凋亡有重要作用的氨基酸殘基 Pro、Trp和cys, survivin通過這些殘基與 caspase-3和caspase-7結(jié)合抑制 caspase的活性， 阻止多種凋亡信號(hào)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；survivin中還含有一個(gè)獨(dú)特的由42個(gè)氨基酸嚴(yán)格排序形成的雙螺旋區(qū)域。其可能與survivin的抗凋亡功能有關(guān)。2.

8、Survivin組織分布Survivin的分布不同于凋亡抑制蛋白家族其它成員，與IAPs在正常成人組織中廣泛分布的模式相反，生理狀態(tài)下，在成人除子宮內(nèi)膜組織、胎盤、胸腺、結(jié)腸基底內(nèi)皮細(xì)胞【9】、血管再生術(shù)時(shí)的神經(jīng)干細(xì)胞【10】中發(fā)現(xiàn)存在不同程度的survivin基因表達(dá)外，大多數(shù)組織均測不到survivin基因表達(dá)，它只分布于胚胎組織和腫瘤組織。Survivin在絕大多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)，包括肺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，胃癌，食管癌，胰腺癌，肝癌，膀胱癌，子宮癌， 以及卵巢癌，非霍其金淋巴瘤，白血病，神經(jīng)母細(xì)胞瘤，腦瘤，嗜鉻細(xì)胞瘤，軟組織肉瘤， 黑色素瘤和其他皮膚癌?！?】并且發(fā)現(xiàn)survivin的表

9、達(dá)也發(fā)生在癌前病變的組織中。研究表 明survivin的表達(dá)增高出現(xiàn)在腫瘤發(fā)展的早期，并且在發(fā)生侵襲前就可出現(xiàn)表達(dá)上升11。隨著腫瘤的發(fā)展，Survivin的表達(dá)量也隨之增高，與Survivin能夠抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡、促使腫 瘤發(fā)展有關(guān)。Survivin的表達(dá)與腫瘤患者的耐藥性、預(yù)后及5年生存率呈正相關(guān)。3. Survivin調(diào)控細(xì)胞周期Surv ivin的表達(dá)與細(xì)胞增殖有關(guān)，能夠同時(shí)調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡。Kobayashi等12發(fā)現(xiàn)，有細(xì)胞增殖的組織均有survivin的表達(dá)。Survivin在胚胎組織中規(guī)律性表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長、分化。Survivin是已知的IAP家族中惟一與紡錘體微管

10、相關(guān)的蛋白質(zhì)，有絲分裂的紡錘體對(duì)有絲分裂早期的染色體分離起重要作用，它具有監(jiān)測有絲分裂紡錘體聚集的作用，survivin的表達(dá)存在細(xì)胞周期調(diào)控依賴性，在G2/M期其表達(dá)顯著升高，與有絲分裂紡錘體微管蛋白，著絲點(diǎn)胞內(nèi)中心體相關(guān)【13】。在有絲分裂初期，survivin可能是通過其梭基端的卷曲螺旋與組成有絲分裂紡錘體的微管蛋白特異性結(jié)合，與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CDK4形成survivin-CDK 4復(fù)合體，使得p21從與CDK4的復(fù)合體中釋放出來與線粒體caspase-3結(jié)合，間接抑制其活性，而阻止細(xì)胞凋亡，使 caspase-3不能有效地水解微管結(jié)構(gòu)蛋白，因而維持了 紡錘體的完整性，確保細(xì)胞有絲分裂

11、正常進(jìn)行，從而導(dǎo)致多核細(xì)胞紡錘體蓄積【14】。如干擾 survivin與微管的結(jié)合，可致survivin抗凋亡活性喪失。【15】Surv ivin主要通過兩種方式作用于細(xì)胞周期：使細(xì)胞周期免受p21蛋白的抑制。Survivin蛋白、丫微管蛋白和P21蛋白結(jié)合成復(fù)合物，共同定位于中心粒。P21蛋白被結(jié)合在 中心粒上，細(xì)胞周期的負(fù)向調(diào)節(jié)減弱，細(xì)胞進(jìn)行分裂的速度加快。而Survivin蛋白受到拮抗時(shí),P21發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的功能，使細(xì)胞周期阻滯在分裂期。與周期素依賴蛋白激酶CDK4結(jié)合，導(dǎo)致P21蛋白自CDK4的解離。P21緊密結(jié)合于G期和S期的蛋白激酶(CDK4和CDK2), 抑制其活性，對(duì)細(xì)胞增

12、殖停留在G1期具有重要的作用。而 P21的解離使CDK4活化，細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，最終導(dǎo)致大量細(xì)胞無限制增殖。Survivin如果過度表達(dá)，細(xì)胞失去正常增殖周期中凋亡 開關(guān)”的限制，造成細(xì)胞增殖增加，凋亡減少，細(xì)胞增殖與凋亡的平衡打破，最 后導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。Survivin的表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴性，只在細(xì)胞周期的G2/M期表達(dá)。在有絲分裂的開 始，surv ivin與紡錘體的微管蛋白特異性結(jié)合，維護(hù)有絲分裂的正常進(jìn)行。干擾surviv in和微管蛋白的反應(yīng)，可致survivin抗凋亡活性的喪失，增加Caspase-3的活性，導(dǎo)致細(xì)胞的G2/M期凋亡， 細(xì)胞分裂異常，伴有多倍體細(xì)胞形成。這些結(jié)果提

13、示，在細(xì)胞周期的G2/M期,survivin能對(duì)抗異常因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而在腫瘤細(xì)胞中survivin的過度表達(dá)，則可能使細(xì)胞克服這個(gè)凋亡 的調(diào)控點(diǎn)而利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞，完成異常的有絲分裂。Surv ivin參與細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡有兩條途徑：外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑。外源性凋亡途徑，又稱為死亡受體通路，是由胞外腫瘤壞死因子(TNF)超家族的死亡配體如TNFa FasLZCD95L、TWEAK和TRAIL引發(fā)的。這些配體和相關(guān)的細(xì)胞表面死亡受體(分別是 TNFR Fas/ CD95 DR3 DR4/ DRS結(jié)合，使受體三聚化 (receptor clustering )并激活， 三聚化的死亡受體

14、通過死亡域(deathdomain)募集銜接蛋白如TRADD和(或)FADDt銜接蛋白通過死亡效應(yīng)域(deathefecterdomain , DED)與 pro caspase8形成復(fù)合物，稱為死亡誘導(dǎo) 信號(hào)復(fù)合物(death inducing signaling complex , DISC。Pro-caspase-8 具有弱的催化活性，在 DISC中局部濃度升高，可發(fā)生自我剪接并活化?；罨腸aspase8釋放到胞質(zhì)中啟動(dòng) caspase 的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游的效應(yīng)caspase,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。激活的caspase8能使胞質(zhì)中的Bid 斷裂成tBid , tBid轉(zhuǎn)移到線粒體上，誘導(dǎo)細(xì)胞

15、色素C從線粒體釋放進(jìn)人胞質(zhì)，從而把死亡受體通路和線粒體通路聯(lián)系起來，有效地?cái)U(kuò)大了凋亡信號(hào)。內(nèi)源性凋亡途徑，又稱為線粒體/細(xì)胞色素C介導(dǎo)的通路，線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)控制中心，它不僅是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細(xì)胞凋亡調(diào)控中心。實(shí)驗(yàn)表明了細(xì)胞色素C從線粒體釋放是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。釋放到細(xì)胞漿的細(xì)胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關(guān)因子1 (Apaf-1)結(jié)合，使其形成多聚體，并促使 pro-caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體(apoptosome),之后激活caspase-9,被激活的caspase-9能激活其它的 caspase如caspase-3等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡【16

16、】。Survivin可能主要通過兩條途徑來抑制細(xì)胞凋亡：直接抑制凋亡終末效應(yīng)酶Caspase-3和Caspase-7的活性來阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程；Survivin與周期蛋白激酶CDK4, CDK2相互作用阻斷凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Survivin直接作用 Caspase,主要通過抑制 Caspasc-3和Caspasc-7的活性，Survivin也可通過P21間接抑制Caspase Survivin與細(xì)胞周期調(diào)控因子 CDK4結(jié)合,導(dǎo)致CDK2 / cyclin - E 激活和核糖體（Rb）磷酸化，Rb磷酸化后啟動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入周期，加快G1/S期的轉(zhuǎn)換，使P21從Survivin-CDK4復(fù)

17、合物中釋放出來，與線粒體 pro-caspase-3結(jié)合，抑制caspase-3活 性，阻止線粒體釋放Cyt-c,抑制細(xì)胞凋亡。一般而言，哺乳動(dòng)物lAPs阻斷了細(xì)胞死亡的一個(gè) 普通環(huán)節(jié)，即線粒體 Cyt-c的釋放，直接抑制了終末效應(yīng)酶Caspase-3, Caspase-7干預(yù)了Caspase-9的活性。同時(shí)survivin抵消了一大類凋亡刺激物的作用，包括IL-3、Fas Bax、Caspase-3 Caspase -7 Caspase -8和 TNF 等15。5. Surv ivin-治療腫瘤的新靶點(diǎn)近年來，研究者注重于通過抑制survivin的表達(dá)從而達(dá)到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自發(fā)凋亡或者增強(qiáng)腫瘤

18、細(xì)胞對(duì)于凋亡因子的敏感性。多種抗凋亡方法被應(yīng)用在腫瘤的治療中，包括反義寡核苷酸、核酶、細(xì)胞周期阻斷劑、siRNA survivin基因治療具有良好的靶向性、特異性及安全性。5.1反義寡核酸技術(shù)反義寡核苷酸（Antisense oligonucleotides，ASODN）可以圭寸閉凋亡抑制基因的過表達(dá)，并增強(qiáng)化療藥物誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡，這正是當(dāng)今腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)的一種新策略，目前備受關(guān)注。在許多腫瘤比如在肝癌、胃癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤中應(yīng)用 ASODN技術(shù)，均證實(shí)可抑制survivin 的表達(dá)。Kan war【17】等證實(shí)應(yīng)用 ASODN能增強(qiáng)鼠EL-4胸腺淋巴瘤細(xì)胞對(duì)于免疫治療的敏 感性，導(dǎo)入表達(dá)反

19、義寡核酸質(zhì)粒的細(xì)胞相比于對(duì)照組抑制生長明顯，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，李紅玲等選擇B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株 Rajj作為模型，脂質(zhì)體介導(dǎo)survivin ASODN轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果survivin ASODN抑制了 Rajj細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo) Rajj細(xì)胞的凋亡，且survivin mRNA和蛋白表達(dá)均明顯 下降。蔡真等的研究同樣表明，survivin ASODN能明顯抑制增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并提高細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。5.2核酶核酶（Ribozyme,Rz）是一類具有核酸內(nèi)切酶活性的RNA分子，可特異地與靶RNA序列結(jié)合并加以切割，使mRNA表達(dá)水平下降，從而抑制靶基因的功能。Pennati等18報(bào)道了核酶介導(dǎo)的S

20、urvivin表達(dá)抑制方法，該核酶以Survivin mRNA的3'端外顯子1中CUA-110為靶點(diǎn)，將核酶的編碼序列替換了n 型腺病毒VA1基因中心區(qū)域的一部分，使其能在細(xì)胞內(nèi)得到表達(dá)； 同時(shí)構(gòu)建莫洛尼氏反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，在其3 '端長末端重復(fù)序列（long terminal repeat , LTR編碼VA1核酶組件，從而獲得高表達(dá)效率。轉(zhuǎn)導(dǎo)之后可獲得兩邊 LTR都含有核酶表達(dá)組件的雙拷貝 質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞DU-154和PC-3植入裸鼠右側(cè)肋下的腫瘤 模型，核酶介導(dǎo)的Survivin表達(dá)抑制能引起 Caspase-9依賴的細(xì)胞凋亡和腫瘤生長抑制19

21、5.3細(xì)胞周期阻斷劑細(xì)胞周期的運(yùn)動(dòng)受細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的控制，這些調(diào)節(jié)因子在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)常常 發(fā)生異常改變。在腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期正調(diào)控因子過表達(dá)，如周期蛋白（Cyclin,主要是CyclinD1、Cyclin E1）和周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin dependent kinases，主要是 CDK4 CDK6）oCyclinD的主要功能是促使細(xì)胞通過G1期，Cyclin D激活CDK4 CDK6，使細(xì)胞渡過 G1期進(jìn)入S期。在這個(gè)過程中，Cyclin D- CDK4復(fù)合物是渡過 G1期所必需的。在腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子低表達(dá)或失活，如細(xì)胞周期蛋白依賴性進(jìn)入S期。在這個(gè)過程中，C

22、yclin D-CDK4復(fù)合物是渡過 G1期所必需的。在腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子低表達(dá)或失活，如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitor ， CKI,主要 INK4A, INK4B, KIP1)。CKI 通過與CDK或CyclinCDK復(fù)合物結(jié)合，抑制CDK的活性，阻止細(xì)胞增殖、分化。P21蛋白為CKI重 要成員，相對(duì)分子質(zhì)量為21 000。p21蛋白C端抑制DNA復(fù)制必需因子增殖細(xì)胞核抗原(prolife-erating-cell nuclear antigen , PCNA, N 端抑制 Cyclin E CDK2,并且 N 端 Cyclin E- CDK2抑制區(qū)也抑制細(xì)胞生長20。p21蛋白在細(xì)胞DNA受到損傷時(shí)，細(xì)胞快速做出反應(yīng)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期的過程中起到關(guān)鍵作用。正在分裂的細(xì)胞周期存在著多個(gè)檢查點(diǎn)，用來不讓受損的DNA進(jìn)行復(fù)制以及受損的染色體不發(fā)生凝集。 當(dāng)發(fā)現(xiàn)損傷，檢測點(diǎn)發(fā)出信號(hào)，通過Cyclin D1被APC降解，釋放出F21,對(duì)Cyclin E/CDK2復(fù) 合物產(chǎn)生抑制，完成了早期快速抑制的過程使細(xì)胞停止生長，進(jìn)行修復(fù)，當(dāng)細(xì)胞無法修復(fù)時(shí)，細(xì)胞凋亡機(jī)制將被啟動(dòng)，避免將DNA損傷帶到子代