多肽合成技術(shù)

1、多肽合成技術(shù)多肽化學(xué)已經(jīng)走過(guò)了一百多年的光輝歷程，1902年，Emil Fischer首先開(kāi)始 關(guān)注多肽合成，由于當(dāng)時(shí)在多肽合成方面的知識(shí)太少，進(jìn)展也相當(dāng)緩慢當(dāng)時(shí)合成采用了苯甲酰，乙酰保護(hù)，脫去相當(dāng)困難，而且容易導(dǎo)致肽鏈斷裂。直到1932年，Max Bergmann等人開(kāi)始使用芐氧羰基（Z）來(lái)保護(hù)a -氨基，該保護(hù)基可以在催化氫化或氫溴酸的條件下定 量脫除，多肽合成才開(kāi)始有了一定的發(fā)展。到了20世紀(jì)50年代，隨著越來(lái)越多的生物活性多肽的發(fā)現(xiàn)，大大推動(dòng)了有機(jī)化學(xué)家們對(duì)多肽合成方法以及保護(hù)基的研究，因此這一階段 的研究成果也非常豐富，人們合成了大量的生物活性多肽，包括催產(chǎn)素（ oxytocin ）

2、，胰島 素等，同時(shí)在多肽合成方法以及氨基酸保護(hù)基上面也取得了不少成績(jī)，這為后來(lái)的固相合 成方法的出現(xiàn)也提供了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。也就是這個(gè)階段，F(xiàn)red Sanger 發(fā)明了氨基酸序列測(cè)定方法，并為此獲得了 1958年的Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。還是他后來(lái)發(fā)明了 DNA序列檢測(cè)方法， 并于1980年再次獲得了 Nobel化學(xué)獎(jiǎng)，成為到目前為止唯一獲得兩次Nobel化學(xué)獎(jiǎng)的科學(xué)家。1963年，Merrifield提出了固相多肽合成方法（SPPS，這個(gè)在多肽化學(xué)上具有里程碑意義的合成方法，一出來(lái)，就由于其合成方便，迅速，現(xiàn)在已經(jīng)成為多肽合成的首選方 法，隨后的發(fā)展也證明了該方法不僅僅是一種合成方法，而且也帶來(lái)

3、了有機(jī)合成上的一次 革命，并成為了一支獨(dú)立的學(xué)科，固相有機(jī)合成（SPOS。當(dāng)然，Merrifield 也因此榮獲了 1984年的 Nobel 化學(xué)獎(jiǎng)。也正是 Merrifield ，他經(jīng)過(guò)了反復(fù)的篩選，最終屏棄了芐氧羰 基（Z）在固相上的使用，首先將叔丁氧羰基（BOC用于保護(hù)a -氨基并在固相多肽合成 上使用，其可以在酸性條件下定量的脫除，反應(yīng)也非常迅速，在 30min 就可以反應(yīng)完全。 由于叔丁氧羰基（BOC方法中，氨基酸側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)大多基于芐基（Bzl ），因此也稱(chēng)為 BOC-Bzl 策略。同時(shí)， Merrifield 在20世紀(jì)60年代末發(fā)明了第一臺(tái)全自動(dòng)多肽合成儀，并 首次合成生物蛋

4、白酶，核糖核酸酶（ 124個(gè)氨基酸）。隨后的多肽化學(xué)研究主要集中在固相 合成樹(shù)脂，多肽縮合試劑，氨基酸保護(hù)基的研究。1972， Lou Carpino 首先將9-芴甲氧羰基（FMOC用于保護(hù)a -氨基，其在堿性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應(yīng)完全，而 且由于其反應(yīng)條件溫和，迅速得到廣泛使用，到了 20世紀(jì)80年代取代了叔丁氧羰基（ BOC，But），成為了固相多肽合成中的首選合成方法。該方法中氨基酸的側(cè)鏈大多基于叔丁基（ 因此，也稱(chēng)為FMOC-Bu策略。同時(shí)，在多肽合成樹(shù)脂，縮合試劑以及氨基酸保護(hù)，包括合 成環(huán)肽的氨基酸正交保護(hù)上也取得了豐碩的成果。進(jìn)入 21世紀(jì)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的研究

5、深入，對(duì)于多肽化學(xué)的要求不僅僅是合成方法，而更 多的集中在多肽標(biāo)記與修飾方法，以及蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽的合成以及長(zhǎng)肽或蛋白合 成。多肽化學(xué)合成的基本介紹多肽化學(xué)合成方法，包括液相和固相兩種方法。液相合成方法現(xiàn)在主要采用BOCffi Z兩種保護(hù)方法，現(xiàn)在主要應(yīng)用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催產(chǎn)素等，其相對(duì)與固相合成， 具有保護(hù)基選擇多，成本低廉，合成規(guī)模容易放大的許多優(yōu)點(diǎn)。與固相合成比較，液相合 成主要缺點(diǎn)是，合成范圍小，一般都集中在 10個(gè)氨基酸以?xún)?nèi)的多肽合成，還有合成中需要 對(duì)中間體進(jìn)行提純，時(shí)間長(zhǎng)，工作量大。固相合成方法現(xiàn)在主要采用FMO和BOCW種方法， 它具有合成方便，迅速，容易實(shí)

6、現(xiàn)自動(dòng)化，而且可以比較容易的合成到30個(gè)氨基酸左右多肽。氨基酸保護(hù)基20種常見(jiàn)氨基酸，根據(jù)側(cè)鏈可以分為幾類(lèi)：脂肪族氨基酸（ Ala， Gly， Val， Leu， Ile ，）， 芳香族氨基酸（Phe, Tyr，Trp，His），酰胺或羧基側(cè)鏈氨基酸（Asp, Glu，Asn, Gin）， 堿性側(cè)鏈氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亞氨型 基酸（Pro）。多肽化學(xué)合成中氨基酸的保護(hù)非常關(guān)鍵，直接決定了合成能夠成功的關(guān)鍵。 因?yàn)槌Ｒ?jiàn)的 20中氨基酸中有很多都是帶有活性側(cè)鏈的，需要進(jìn)行保護(hù)，一般要求，這些保 護(hù)基在合成過(guò)程中穩(wěn)定，無(wú)副反應(yīng)，合成結(jié)

7、束后可以完全定量的脫除。合成中需要進(jìn)行保護(hù)的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu， His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr， Trp，Tyr。需要進(jìn)行保護(hù)的基團(tuán)：羥基，羧基，巰基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保護(hù)，因?yàn)檫胚嵝再|(zhì)比較穩(wěn)定。當(dāng)然在特殊的情況下，有些氨基酸也可以不保護(hù)，象，Asn, Gin ，Thr，Tyr。表1常見(jiàn)3種氨基脫除條件TFAHBr/TFAH2/Pd-CPiperidi ne/DMFBocyynnZnyynFmocnyny圖1常見(jiàn)3種氨基保護(hù)基結(jié)構(gòu)氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)非常多，同一個(gè)側(cè)鏈有多種不同的保護(hù)基，可以在不同的條件下選擇 性的脫除

8、，這點(diǎn)在環(huán)肽以及多肽修飾上具有很重要的意義。而且側(cè)鏈保護(hù)基和選擇的合成 方法有密切的關(guān)系，液相和固相不一樣，固相中 BOC和FMO策略也不一樣，從某種意義上 看，多肽化學(xué)就是氨基酸保護(hù)基的靈活運(yùn)用與搭配。關(guān)于側(cè)鏈保護(hù)基的使用，請(qǐng)參考王德 心的固相有機(jī)合成 原理及應(yīng)用指南第四章，我們這里主要介紹 Cys，Lys，Asp的 幾種保護(hù)基及其脫除方法。Cys最常見(jiàn)的保護(hù)基有三種，Trt，Acm Mob這三個(gè)保護(hù)基可以完成多對(duì)二硫鍵多肽的合成。 Lys最常見(jiàn)的保護(hù)基有：Boc, Fmoc Trt , Dde Allyl , 這對(duì)于固相合成環(huán)肽提供了很多正交的保護(hù)策略。 Asp最常見(jiàn)的保護(hù)基有：Otbu,

9、 OBzl,OMe oaii，OFm同樣也提供了多種正交的保護(hù)策略。表2巰基常見(jiàn)保護(hù)基簡(jiǎn)稱(chēng)結(jié)構(gòu)脫除條件TrtTFA HCI/HOAc 12/MeOHAcm12/MeOH, Hg2+MobHF, TFMSA Hg2+表3氨基常見(jiàn)保護(hù)基簡(jiǎn)稱(chēng)結(jié)構(gòu)脫除條件TrtTFA HOAc HCOOHBocHCI/HOAq TFA/DCMFmocPip/DMF , NaOH/MeOHDdeH2NNH2/DMFAllylPd（ Ph3P 4,嗎啉 /THF表3羧基常見(jiàn)保護(hù)基簡(jiǎn)稱(chēng)結(jié)構(gòu)脫除條件OtbuTFA HOA，HCOOHOBzlH2/Pd, HF, TFMSAOMeNaOH/MeOHOAIIPd（ Ph3F）4,

10、嗎啉 /THFOFmPip/DMF，DBU/DMF多肽縮合試劑目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法來(lái)完成接肽反應(yīng)，最早使用的是將氨基酸活化為酰氯，疊氮，對(duì)稱(chēng)酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于這些條件下，存在氨基酸消旋，以 及反應(yīng)試劑危險(xiǎn)以及制備比較復(fù)雜，逐漸被后來(lái)的縮合試劑取代，按照其結(jié)構(gòu)可以分為兩 種：縮合試劑主要有：碳二亞胺型，鎓鹽型（Uronium）。碳二亞胺型主要包括：DCC DIC,等。采用DCC進(jìn)行反應(yīng)，由于反應(yīng)中生成的 DCU在DMF中溶解度 很小，產(chǎn)生白色沉淀，所以一般不用在固相合成中，但是由于其價(jià)格便宜，在液相合成中， 可以通過(guò)過(guò)濾除去，應(yīng)用仍然相當(dāng)廣泛。因?yàn)槠渌芙庑缘奶攸c(diǎn)，

11、在多肽與蛋白的連接中使用比較多，而且也相當(dāng)成功。但是該類(lèi)型的縮合試劑的一個(gè)最大的缺點(diǎn)，就是如果單獨(dú)使用，會(huì)有比較多的副反應(yīng)，但是研究表明如果在活化過(guò)程中添加HOB，HOAt等試劑，可以將其副反應(yīng)控制在很低的范圍。其反應(yīng)機(jī)理如下：O-Acyitfioureaor in ca&a of OAt:MA cyl u普電 undesir&d side product, not adiw for coiwling(HGAf) N M圖2 DIC活化反應(yīng)機(jī)理鎓鹽型鎓鹽型縮合試劑反應(yīng)活性高，速度快，現(xiàn)在使用非常廣泛，主要包括：HBTUTBTUHATUPyBOP等。該試劑使用過(guò)程中需要添加有機(jī)堿

12、，女口，二異丙基乙胺（DIEA）, N-甲基嗎啉（NMM, 該試劑加入后，才能活化氨基酸。其反應(yīng)機(jī)理如下：* 乳恥的田DIPE圖3 TBTU活化反應(yīng)機(jī)理多肽合成方法比較液相多肽合成(solution phase synthesis)液相多肽合成現(xiàn)在仍然廣泛的使用，在合成短肽和多肽片段上具有合成規(guī)模大，合成成本低的顯著優(yōu)點(diǎn)，而且由于是在均相中進(jìn)行反應(yīng)，可以選擇的反應(yīng)條件更加豐富，象一些催化氫化，堿性水解等條件，都可以使用，這在固相中，使用卻由于反應(yīng)效率低，以及副反應(yīng)等原因，無(wú)法應(yīng)用。液相多肽合成中主要采用B0(和Z兩種反應(yīng)策略。圖4液相合成Glu-Trp固相多肽合成1 .MaOH/MeOH2&#

13、39;.HCIA1OAcOH0 00 丄U-cM-oh td2 ch2 0=01 .DIEA2.MX 門(mén)p/DMF0 0戰(zhàn) j| H NHC -O'N-CHC-OH 加ch2 6=oi0I.WC/MOBt220% PipTDMF0 U!0也 IM-Ch8-N-CH-OH 仍TF 貴 CH2丄-ch2G=0OHGlu-Trp圖5 FMOC固相合成Glu-Trp固相多肽合成現(xiàn)在使用的主要有兩種策略：BOC和FMOC兩種。BOC方法合成過(guò)程中，需要反復(fù)使用TFA脫 BOC而且在最后從樹(shù)脂上切割下來(lái)需要使用 HF,由于HF必須使用專(zhuān)門(mén)的 儀器進(jìn)行操作，而且切割過(guò)程中容易產(chǎn)生副反應(yīng)，因此現(xiàn)在使用

14、受到實(shí)驗(yàn)條件限制，使用 也逐漸減少。FMO方法反應(yīng)條件溫和，在一般的實(shí)驗(yàn)條件下就可以進(jìn)行合成，因此，也得 到了非常廣泛的應(yīng)用。固相合成中常用樹(shù)脂固相合成中樹(shù)脂，一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，大小在75-150卩m交聯(lián)度在1-2%之間，現(xiàn)在使用的大多是1%因?yàn)檫@種交聯(lián)度下，樹(shù)脂在DMFDCM中具有很好的溶脹性能，立體上是一個(gè)空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，反應(yīng)物分子可以在樹(shù)脂內(nèi)部自由移動(dòng)。樹(shù)脂中最關(guān)鍵的部分 是連接手臂，它一端連接在樹(shù)脂上，一端作為反應(yīng)位點(diǎn)。目前廣泛使用的樹(shù)脂有：PAMMBHAWang 2-Cl-Trt ，Rink-Amide-MBHA等。其中 PAM MBHA是用在 BOC策略中，因?yàn)槠鋵?duì)酸

15、非常穩(wěn)定，需要在HF, TFMS等強(qiáng)酸條件下才能夠切割下來(lái)。0HMBHAW 曲g2TrtFAMRitik-Amide圖6固相合成常用樹(shù)脂茚三酮檢測(cè)檢測(cè)方法稱(chēng)為Kaiserpro，ser，His）。固相多肽合成中，主要是通過(guò)檢測(cè)樹(shù)脂上游離氨基來(lái)判斷連接效率,方法，其檢測(cè)結(jié)果，如果有游離氨基的時(shí)候，顯示蘭色，或紅褐色（Kaiser試劑包括:A, 6%茚三酮的乙醇溶液B, 80%苯酚的乙醇溶液C, 2% KCN的吡啶溶液配制中的吡啶需要經(jīng)過(guò)茚三酮處理后，重蒸后再使用。檢測(cè)過(guò)程，取少量樹(shù)脂，加入A,B, C各2-3滴，100C下加熱1-2min，如果溶液有蘭色，或樹(shù)脂出現(xiàn)蘭色，紅褐色，表明還 有游離氨

16、基，否則說(shuō)明連接完全。還有其它檢測(cè)游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬蘭法等。圖7茚三酮檢測(cè)原理固相合成切割方法固相合成完成之后，必須選擇合適的切割試劑將多肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)，然后經(jīng)過(guò)冰乙醚沉淀，離心收集沉淀，經(jīng)過(guò)HPLC分離純化，冷凍干燥得到最后產(chǎn)品。由于選擇的樹(shù)脂不同， 氨基酸序列不同，在切割時(shí)候，選擇的切割方法也不完全相同，一般都是選擇酸性條件下 切割的條件，對(duì)于PAM MBH樹(shù)脂，一般采用HF切割，切割過(guò)程中需要添加對(duì)甲苯酚，對(duì) 巰基苯酚，苯甲醚等試劑。而對(duì)于 Wang Rink-Amide , Trt樹(shù)脂，一般采用TFA切割，切割過(guò)程中加入，乙二硫醇，苯甲硫醚，水，三異丙基

17、硅烷，苯酚等。這些添加試劑主要作 為碳正離子俘獲試劑使用，目的是俘獲切割反應(yīng)過(guò)程中生成的碳正離子，減少這些碳正離 子對(duì)部分氨基酸側(cè)鏈的進(jìn)攻導(dǎo)致的副反應(yīng)，比較容易產(chǎn)生副反應(yīng)的氨基酸有：Trp，Tyr。切割試劑用量一般10-15ml/g樹(shù)脂。常用的切割配比：HF/p-cresol/p-thiocresol （90/5/5）， TFA/TIS/EDT/H2O （94/1/），反應(yīng)一般是在室溫條件下 2h-4h。多肽合成中主要問(wèn)題消旋及其反應(yīng)機(jī)理多肽合成過(guò)程中，部分氨基酸在活化的過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致不同程度的消旋，特別容易消旋的氨 基酸有：Cys, His，Phe,當(dāng)然這些消旋化還和溶劑，溫度以及合成中的有機(jī)

18、堿等因素有關(guān)。 對(duì)于這些氨基酸，可以通過(guò)采用高效縮合試劑，減少反應(yīng)時(shí)間，可以減少消旋的比例，一 般條件選擇適當(dāng)，消旋化都可以控制在 5沖內(nèi)。消旋反應(yīng)機(jī)理如下：圖8消旋反應(yīng)機(jī)理酮哌嗪（DKP反應(yīng)DKP副反應(yīng)出現(xiàn)在FMOC-Wan樹(shù)脂合成過(guò)程中，主要出現(xiàn)在第一個(gè)氨基酸為 Pro的時(shí)候， 當(dāng)?shù)诙€(gè)氨基酸脫FMOC勺時(shí)候，a -氨基被游離出來(lái)之后，立即對(duì)Wang樹(shù)脂的芐酯鍵進(jìn)行 分子內(nèi)胺解，生成六元環(huán)二酮哌嗪衍生物，同時(shí)從 Wang樹(shù)脂上釋放出來(lái)，導(dǎo)致反應(yīng)終止。該反應(yīng)非常迅速，文獻(xiàn)報(bào)道采用50%Pip/DMF脫1min，4min的條件，但是我們實(shí)驗(yàn)證明在多數(shù)情況下，即使是1min左右反應(yīng)就超過(guò)了 20

19、%因此一般在末端第一個(gè)氨基酸為 Pro的時(shí)候，建議采用2-Cl-Trt樹(shù)脂合成，由于該樹(shù)脂巨大的空間阻力，可以完全消除該副反應(yīng)。 這個(gè)副反應(yīng)在BOC策略合成過(guò)程中，卻可以完全避免，因?yàn)?BOC在使用TFA脫除后，使氨 基以TFA鹽的形式存在，從而失去了親核性，不能進(jìn)攻芐酯鍵。O1圖9 DKP反應(yīng)機(jī)理困難序列多肽合成固相多肽合成中也經(jīng)常遇到多肽合成失敗或合成效率很低的問(wèn)題，這里面的主要原因是由于多肽序列引起的，因?yàn)橛行┒嚯男蛄性跇?shù)脂上形成B -折疊，改變了樹(shù)脂的溶脹性能，還有可能將反應(yīng)的活性位點(diǎn)埋藏在樹(shù)脂里面，這樣使得反應(yīng)很難進(jìn)行，目前報(bào)道使用的主 要方法有：使用混合溶劑，DMSO/DMF6N胍

20、啶/DMF溶液提高反應(yīng)溫度，或采用微波方法使用高離液鹽，LiCI，NaCIO4等。使用溶脹性能更好的PEG-PS樹(shù)脂，同時(shí)減少樹(shù)脂擔(dān)載量（）合成多肽分析鑒定方法多肽的分析鑒定方法有多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定，多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)包括：質(zhì)譜分析，氨 基酸組成分析，氨基酸序列分析。二級(jí)結(jié)構(gòu)包括：圓二色譜（CD，NMR X-衍射等方法。純度分析多肽的純度分析，一般都采用HPLC進(jìn)行分析，選擇RP-C18粒徑5卩m孔徑300A,x 150mm 流動(dòng)相：A, % TFA/H2O B, %TFA/ACN洗脫梯度，5%B-65%B時(shí)間30min。也有些多肽， 特別是短肽，由于親水性強(qiáng)，在 C181保留很弱，需要改變

21、條件，這里主要有兩種方法： 一個(gè)改變分析梯度，可以將起始梯度改為 2%，等度或小梯度洗脫；另外一個(gè)方法是在流動(dòng) 相中加入強(qiáng)離子對(duì)試劑，如七氟丁酸，十八烷基磺酸鈉等。一級(jí)結(jié)構(gòu)分析質(zhì)譜分析質(zhì)譜分析的目的主要是確證分子量， 當(dāng)然采用MS/M列以部分的了解多肽序列的信息，但 是這個(gè)需要比較全的數(shù)據(jù)庫(kù)作為基礎(chǔ)，分析才能比較準(zhǔn)確。由于多肽性質(zhì)不穩(wěn)定，需要采 用軟電離技術(shù)，目前多肽分析主要使用了電噴霧（ESI-MS），基質(zhì)輔助激光解吸（MALDI-MS。 其中ESI-MS通常會(huì)給出多電荷峰，電荷數(shù)目和多肽序列上氨基，胍基，咪唑基的數(shù)目有關(guān)， 因此，經(jīng)常給出了雙電荷，三電荷等離子峰。MALDI-M舸以分析蛋白

22、大分子，而且通常情況下很少帶多電荷，因此數(shù)據(jù)直接對(duì)應(yīng)了分子離子峰，容易分析。此外，通常在分析長(zhǎng)肽 或蛋白過(guò)程中，需要添加NH4 Na, K等離子，提高靈敏度，所以一般在 MS中出現(xiàn)一組峰， 分別對(duì)應(yīng)：（ M+H） +，（ M+NH）4 +，（ M+N）a +，（ M+K） +。氨基酸組成分析氨基酸組成分析一般需要產(chǎn)品的純度較高，它可以給出多肽中氨基酸的種類(lèi)，數(shù)目。分析 過(guò)程首先通過(guò)酸水解破壞肽鍵，典型酸水解的條件是：真空條件下，110C，用6M鹽酸水解16至72小時(shí)。酸水解雖然很有用，但酸水解條件下不能獲得完整的氨基酸分析，因?yàn)樘?冬酰胺和谷氨酰胺的側(cè)鏈含有酰胺鍵，用于切斷蛋白質(zhì)肽鍵的酸也可以

23、將天冬酰胺轉(zhuǎn)換為 天冬氨酸，谷氨酰胺轉(zhuǎn)換為谷氨酸。由于水解溫度比較高，色氨酸的吲哚環(huán)容易被空氣氧 化，即使在密封的管中，色氨酸的吲哚環(huán)也幾乎都被破壞了。因此蛋白質(zhì)的色氨酸含量往 往是通過(guò)它的紫外吸收光譜估計(jì)的，也可以通過(guò)堿水解分析色氨酸的含量。半胱氨酸在酸 水解中也不能精確測(cè)定，要精確測(cè)量需要在蛋白質(zhì)水解之前進(jìn)行氧化或羧甲基化，形成的 衍生物在酸水解之后才能定量。氨基酸序列分析氨基酸序列分析的基本原理是 Edman?降解，主要涉及耦聯(lián)、水解、萃取和轉(zhuǎn)換等4個(gè)過(guò)程。 首先使用苯異硫氰酸酯（PITC）在的堿性條件下對(duì)蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行處理，PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反應(yīng)，形成苯氨基硫甲酰（P

24、TC衍生物，即PTC肽。然后PTC肽用三 氟乙酸處理，N-端氨基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺 衍生物。接下來(lái)將該衍生物用有機(jī)溶劑（例如氯丁烷）從反應(yīng)液中萃取出來(lái)，而去掉了一 個(gè)N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。萃取出來(lái)的噻唑啉酮苯胺衍生物不穩(wěn)定， 經(jīng)酸作用， 再進(jìn)一步環(huán)化，形成一個(gè)穩(wěn)定的苯乙內(nèi)酰硫脲（PTH衍生物，即PTH氨基酸。留在溶液中的減少了一個(gè)氨基酸殘基的肽再重復(fù)進(jìn)行上述反應(yīng)過(guò)程，整個(gè)測(cè)序過(guò)程現(xiàn)在都是通過(guò)測(cè) 序儀自動(dòng)進(jìn)行。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析圓二色譜（ CD）圓二色譜是一種特殊的吸收譜， 它通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)等生物大分子的圓二色光譜， 從而得到 生物大分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，

25、簡(jiǎn)單、快捷，廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)折疊，蛋白質(zhì)構(gòu)象研究，酶動(dòng)力 學(xué)等領(lǐng)域。圓二色譜紫外區(qū)段（190-24Onm）,主要生色團(tuán)是肽鏈，這一波長(zhǎng)范圍的 CD譜包 含了生物大分子主鏈構(gòu)象的信息。a -螺旋構(gòu)象的CD譜在222nm 208nm處呈負(fù)峰，在190nm附近有一正峰。B -折疊構(gòu)象的CD譜，在217-218nm處有一負(fù)峰，在195-198nm處有一強(qiáng)的 正峰。無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)象的 CD譜在198nm附近有一負(fù)峰，在220nm附近有一小而寬的正峰核磁共振 （NMR）隨著二維、三維以及四維 NMR勺應(yīng)用，分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)處理技術(shù)的發(fā)展，使NMR逐漸成為大分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)分析的主要方法之一。NMR可用于確定氨

26、基酸序列、分布以及構(gòu)象。目前，NMRt分析分子中含少于30個(gè)氨基酸的小肽時(shí)是非常有用的，分析結(jié)果快速準(zhǔn)確。衍射X-衍射可獲得有關(guān)化合物晶型的直接信息，而且可以判斷相對(duì)與絕對(duì)構(gòu)型。多肽標(biāo)記及修飾目前多肽標(biāo)記及修飾的內(nèi)容非常多，廣泛應(yīng)用在多肽藥物，多肽生物學(xué)，多肽抗體以及多 肽試劑的研究中。目前應(yīng)用廣泛的有：非放射性核素標(biāo)記（C13, H2），熒光標(biāo)記（FAMFITC）, 生物素標(biāo)記，磷酸化修飾等。非放射性核素標(biāo)記目前在非放射性核素標(biāo)記中，使用廣泛的仍然是 C13, H2,因?yàn)槠涫褂冒踩?，放射性小?現(xiàn)在有比較完全的非放射性標(biāo)記的氨基酸，可以按照正常的多肽合成方法將標(biāo)記好的氨基 酸直接連接到多肽上

27、。熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記由于沒(méi)有放射性，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單。因此，目前在生物學(xué)研究中熒光標(biāo)記應(yīng)用非常 廣泛，熒光標(biāo)記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，對(duì)于有游離羧基的采用的方法與接肽反應(yīng) 相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。但是對(duì)于FITC標(biāo)記，需要在連接FITC前，增加一個(gè)氨基己酸，避免在切割的過(guò)程中被 TFA切割掉生物素標(biāo)記生物素-親合素系統(tǒng)(biotin-avidin system, BAS),是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及 多級(jí)放大效應(yīng)，并與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合，使各種示蹤免疫分 析的特異

28、性和靈敏度進(jìn)一步提高。主要有用于標(biāo)記多肽氨基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS和生物素對(duì)硝基酚酯(pBNP),其中以BNHS最常用，當(dāng)然，也可以直接使用生物素也 可以標(biāo)記，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)上有個(gè)游離的羧基，采用HBTU/HOBt/DIEA方法縮合，由于生物素的溶解度低，使用DMSO/DMF混合溶劑增加溶解度。磷酸肽合成磷酸肽在生命過(guò)程中發(fā)揮重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Ser，Thr，Tyr。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是單芐基磷酸化氨基酸， Tyr 也可以直接 使用磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的連接一般采用 HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用該 方法合成磷酸化

29、也有缺點(diǎn)，特別是在合成多磷酸化多肽或長(zhǎng)肽的時(shí)候，連接效率低，最后 產(chǎn)品純度很低，對(duì)于這種磷酸化多肽，我們考慮采用后磷酸化方法，其合成過(guò)程就是在多 肽合成結(jié)束后，選擇性脫去要標(biāo)記的氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基，對(duì)于Tyr，Thr可以直接使用側(cè)鏈不保護(hù)的氨基酸進(jìn)行反應(yīng)，而 Ser可以采用Fmoc-Ser (trt)，在1%TFA/DCM件下可以 定量的脫除。后磷酸化，采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體，連 接到羥基上，隨后在過(guò)氧酸下氧化生成磷?；瓿煞磻?yīng)。蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽 多肽在與蛋白受體結(jié)合發(fā)揮功能的時(shí)候，總是先折疊出某些特殊的結(jié)構(gòu)，多肽類(lèi)似物合成 主要是為了模擬這些結(jié)構(gòu)，保持或

30、提高生物活性，同時(shí)也為了改變多肽的穩(wěn)定性，提高其 抗酶解能力。a-螺旋多肽a -螺旋是蛋白結(jié)構(gòu)中最為普通的一種，但是一般多肽在溶液中大多是無(wú)規(guī)卷曲的，目前使用最多的方法是多肽保持 a -螺旋結(jié)構(gòu)就是在多肽表面通過(guò)共價(jià)鍵將處在 a -螺旋結(jié)構(gòu)的 兩個(gè)氨基酸連接起來(lái)，選擇的位點(diǎn)（i，i+4或i，i+7），選擇的化學(xué)鍵包括：二硫鍵，硫 醚鍵，酰胺鍵，烯烴鍵（RCM等方法。二硫鍵二硫鍵廣泛存在與蛋白結(jié)構(gòu)中， 對(duì)穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)具有非常重要的意義， 二硫鍵一般是通過(guò) 序列中的2個(gè) Cys的巰基，經(jīng)氧化形成。形成二硫鍵的方法很多：空氣氧化法， DMSC氧化 法，過(guò)氧化氫氧化法等。二硫鍵的合成過(guò)程，可以通過(guò) E

31、llman檢測(cè)以及HPLC檢測(cè)方法對(duì) 其反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。硫醚鍵硫醚鍵的形成可以通過(guò)序列中的 Lys，將溴乙酸連接到Lys的側(cè)鏈氨基上，利用其和巰基 的特異性反應(yīng)，反應(yīng)在緩沖溶液中進(jìn)行，迅速高效。酰胺鍵多肽的內(nèi)酰胺環(huán)肽的合成一般是利用 Lys，Asp（Glu）的選擇性保護(hù)，在固相上直接環(huán)化。BOCft略中可以采用 BOC-Ly（FmoC,BOC-AspOFm,FMO策略中可以采用 FMOC-Ly6Aloc），F(xiàn)MOC-As（p Allyl ）。對(duì)于首尾環(huán)肽，還可以先合成保護(hù)的多肽，然后在液相中環(huán)化生成目 標(biāo)多肽烯烴鍵（RCMRCM反應(yīng)是一個(gè)過(guò)渡金屬催化反應(yīng)，其反應(yīng)中使用催化劑：（Cy3P）2CI2Ru=CHPh可以催化烯烴環(huán)化，過(guò)程中脫去一分子乙烯。-X-Kesin ll 1.20? pip/DIFI S.Fnj oc-Xl/HBTUZHOBt/DIEA7Cnsin(Cy 3FJ 2C12Ru=匸：HPh.E>CJ4Prcfl u-;X1-X2-1. cle avae reag ent £C2