機體保護肽的固相合成、分離純化及制備研究

1、分類號：密級：單位代碼：學號：西北大學碩士學位論文題目：墊簽堡塹叢魚旦掃金盛：金塞絲垡盈盟壘堡窒作者：墮皇指導教師：學科（專業(yè)）：答辯日期：主豎生專業(yè)技術職務：垡堂金盤垡生）型絲筮學位授予日期：機體保護肽的固相合成、分離純化及制備研究摘要本文采用圃相合成技術首次合成了機體保護肽。從樹脂的活化、氨基酸的偶連率、脫保護試劑及切割試劑等方面研究了機體保護肽的合成工藝，使用半制備規(guī)格反相高效液相色譜進行了純化，并用飛行質(zhì)譜儀對合成產(chǎn)物進行了分析，建立了完整的實驗室和半制備規(guī)模的機體保護肽合成一純化工藝路線。在優(yōu)化的半制備規(guī)模的機體保護肽合成一純化工藝路線中，與理論產(chǎn)量相比，純度為的機體保護肽純品的最終

2、收率為。論文包括以下四個部分：文獻綜述：簡述了多肽固相合成技術，并對主要的多肽分離純化與鑒定技術進行了介紹，最后概述了生物活性肽類藥物的應用情況與研究展望。采用固相合成法，使用樹脂與一樹脂兩種樹脂合成機體保護肽，比較了兩種樹脂的合成效果。通過對樹脂的活化、氨基酸的偶連率、脫保護試劑及切割試劑等合成條件的研究優(yōu)化了合成工藝，并對機體保護肽的合成規(guī)模進行了放大。合成的多肽經(jīng)過鑒定表明正確無誤。使用反相高效液相色譜對兩種樹脂合成的機體保護肽粗品進行了分析，比較了分析結(jié)果。之后對合成粗品進行了分離純化，優(yōu)化了分離純化條件，最后進行了半制備規(guī)模的純化，并使用反相液相色譜及對純化產(chǎn)品進行了純度檢測?？偨Y(jié)了

3、實驗的結(jié)果與意義，對今后的實驗工作進行了展望。關鍵詞：固相合成，機體保護肽，反相高效液相色譜，制備，（），：，仃曲，吐：，西北大學學位論文知識產(chǎn)權(quán)聲明書本人完全了解學校有關保護知識產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即：研究生在校攻讀學位期間論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬于西北大學。學校有權(quán)保留并向國家有關部門或機構(gòu)送交論文的復印件和電子版。本人允許論文被查閱和借闊。學?？梢詫⒈緦W位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、搞印或掃描等復制手段保存和匯編本學位論文。同時，本人保證，畢業(yè)后結(jié)合學位論文研究課題再撰寫的文章一律注明作者單位為西北大學。保密論文待解密后適用本聲明。學位論文作者簽名：學位論文作者簽名

4、：盟豇匭壟指導教師簽名：己礦“年占月，善日移蟬咖版竿細西北大學學位論文獨創(chuàng)性聲明本人聲明：所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究上作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，本論文不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得西北大學或其它教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。哪、學位論文作者簽名：“年占月，（）日幽，互第一章文獻綜述固相多肽合成簡介年，】提出固相合成多肽的思想，經(jīng)過多年的完善和發(fā)展，現(xiàn)在固相多肽合成技術已經(jīng)成為多肽合成中的一種常規(guī)技術，本人也因為在固相多肽合成中所作

5、出的突出貢獻而在年榮獲了諾貝爾化學獎（）。世紀年代，在固相多肽合成的基礎上發(fā)展起來的組合化學（）更成為目前藥物篩選中最熱門的方法。固相多肽合成技術固相多肽合成有三種方式：固定羧基端，即由端向端合成；固定氨基端，即由端向端合成（】；固定側(cè)鏈基團的雙向合成。但自開始，得到廣泛應用的仍然是第一種合成方式，既由端向端合成。其合成基本過程：先將所要合成肽鏈的端氨基酸的羧基以共價鍵的形式同固相合成樹脂相連，然后以結(jié)合在樹脂上的氨基酸的氨基作為反應活性位點，與下一個氨基酸的羧基反應生成肽鍵，接長肽鏈。重復（縮臺、洗滌、去保護、中和和洗滌、下一輪縮合）操作，達到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上切割下來，

6、經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。固相多肽合成包括：氨基酸保護策略、固相合成樹脂以及肽鍵縮合試劑三個關鍵部分。）氨基酸保護基】固相多肽合成中一般需要將氨基以及側(cè)鏈活性基團保護起來。目前使用比較多的一氨基保護基為：叔丁氧羰基（）和芴甲氧羰基（）兩種?；鶊F需要反復采用的三氟乙酸（）來脫除，肽樹脂切割一般采用氫氟酸（），對環(huán)境以及實驗設備都有較高的要求，而基團可以使用哌啶輕易地脫除，切割采用，與法相比，具有反應條件溫和、合成效率高以及切割條件溫和等優(yōu)點，逐漸取代了基團而成為目前固相多肽合成的首選。一氨基保護基。表保護氨基酸側(cè)鏈保護基團在常用的種氨基酸中需要保護的氨基酸有種，這些需要保護的基團包括：羥基

7、、巰基、氨基、羧基、酰胺基、胍基以及咪唑基。側(cè)鏈上這些基團的保護原則是：采用同一類型的保護基，這樣在相同的條件下可以同時脫除所有的保護基。策略中各種氨基酸的側(cè)鏈活性基團及其保護基見表。）固相多肽合成中固相合成樹脂固相多肽合成樹脂一般由兩個部分組成：高分子載體、間隔手臂（）。用于固相多肽合成的高分子載體通常有兩類聚苯乙烯一二乙烯苯交聯(lián)樹脂（）與聚乙烯一乙二醇類樹脂（）及衍生物。這些高分子載體需要滿足幾個條件：具有一定的機械強度、在多肽合成溶劑中具有好的溶脹性能以及切割過程中保持穩(wěn)定。間隔手臂一般需要滿足下面幾個條件：容易和高分子載體連接、具有至少一個反應活性位點、在合成過程中穩(wěn)定以及能夠在特定條

8、件下定量切割下來而不影響所合成多肽的穩(wěn)定性。目前使用最多的高分子載體的交聯(lián)度為，因為在這樣的交聯(lián)度下，樹脂機械強度高且溶脹性能好。樹脂具有價格便宜，擔載量高，它的主要缺點就是在水、乙醇等氫鍵試劑（）中溶脹性低。樹脂具有反應速度快，在大多數(shù)溶劑中都具有很好的溶脹性能等優(yōu)點，主要缺點是價格昂貴、擔載量低、機械穩(wěn)定性能差，在激烈攪拌的合成過程中容易導致物質(zhì)從樹脂上流失。樹脂根據(jù)其導入的間隔手臂可分為：氯甲基樹脂、羥基樹脂、氨基樹脂等。樹脂的選擇和合成多肽的序列以及所采用的合成策略緊密相關，關于各種樹脂的特點及應用，許多多肽廠商都有很詳細的介紹。）固相多肽合成肽鍵縮合試劑一個好的肽鍵縮合試劑應滿足下面

9、幾個要求：溶解性好、連接效率高、性質(zhì)穩(wěn)定、消旋率低、低毒及來源廣泛等?，F(xiàn)在使用的高效縮合試劑大都為苯并雜環(huán)化合物的酰塞化衍生物。圖卜給出的就是兩類苯并三唑及其衍生物】：（羥基一苯并一三氮唑）和（卜羥基一吡啶并一三氮唑）。這兩種化合物通常作為碳二亞胺型肽鍵縮合試劑的添加試劑，用于避免消旋化及提高多肽縮合效率。二。雙：。圖卜羥基一苯并一三氮唑與卜羥基一毗啶并一三氮唑的結(jié)構(gòu)目前使用較多的高效肽鍵縮合試劑通常以和為基礎，在卜羥基上引入活性反應基團。根據(jù)連接鍵可分為：和鍵，多形成六氟磷酸鹽的形式。圖給出幾種具有代表性的高效肽鍵縮合試劑的化學結(jié)構(gòu)。，旺及涎宇一。珠鼢阡、圖幾種高效肽鍵縮臺試劑的結(jié)構(gòu)由于和毒

10、性太大，相對來說使用較少。新型高效肽鍵縮合試劑仍然是目前多肽合成研究領域中的一個熱點，同樣，每年各多肽公司都會推出更加高效的肽鍵縮合試劑。如年，公司推出了【】，結(jié)構(gòu)見圖。與現(xiàn)有的肽鍵縮合試劑相比，它具有合成簡單、穩(wěn)定、低毒、高效以及消旋率低等優(yōu)點。圖的結(jié)構(gòu)一固相多肽合成中連接效率檢測方法盡管目前固相多肽合成方法已經(jīng)相當成熟，但是在合成某些位阻大的氨基酸、疏水性大的肽段以及合成長肽時，仍然會面臨合成中肽鍵縮合效率低而出現(xiàn)缺肽或肽合成終止等問題，這同時也是目前固相多肽合成中的一個難點。因此，在合成過程中及時確定肽鍵縮合效率對指導多肽合成具有重要意義，現(xiàn)在，大多是通過檢測樹脂上氨基的量來判斷連接效率

11、，自世紀年代以來，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并使用了多種氨基檢測方法，根據(jù)檢瀏目的：石】以分為定性檢測和定量檢測兩種：）定性檢測方法定性檢測方法一般是通過顏色反應來完成的，通過加入的物質(zhì)與樹脂上的氨基反應生成有色物質(zhì)連接到樹脂上，這樣可以通過觀察樹脂表面顏色變化來判斷。這些方法包括法（茚三酮法）【】、三硝基苯磺酸（）法【】、溴芬蘭法等。用茚三酮顏色反應可以快速測定樹脂上的氨基，從而判定?；磻欠裢耆?。用茚三酮法檢測聚苯乙烯樹脂氨基的敏感性可達到氨基，樹脂。這個敏感性已可以檢測出縮合反應是否進行了以上，是目前使用最為廣泛的氨基酸定性檢測方法。）定量檢測方法定量檢測方法可以通過檢測樹脂上的氨基的量，檢測氨基的

12、方法有：法（茚三酮法）、苦昧酸澍、離子選擇電極法（高氯酸）鄂、萘醛法、水楊醛法】等。各種檢測方法各有優(yōu)缺點，其中苦昧酸法不但能和伯胺反應也可以和仲胺反應，反應特異性很差；法對如等氨基酸的檢測靈敏度低，現(xiàn)象不明顯，另外，在法中需要使用，毒性高，反應溫度高（。），實際中操作困難：水楊醛檢測方法使用也比較廣泛。但是，用以上檢測方法，對于長的肽鏈，由于每步接肽的效率不可能都達到，因此定量檢測就顯得相當困難，目前仍沒有一種合適的方法去解決。影響固祖多肽合成效率的一折疊現(xiàn)象及解決方法固相多肽合成雖然過程簡單，但在合成中也經(jīng)常遇到連接效率低的問題。和研究表明臺成中連接效率低與合成中多肽分子產(chǎn)生折疊直接相關。

13、為解決這一問題，可采用如下方法：）在、等反應溶劑體系中加入等極生溶劑可以減少合成中肽鏈的折疊；）在反應溶劑中加入溴化鋰、氯化銅【屯等解構(gòu)劑（）；）通過使用“（一一一）衍生物可逆保護氨基酸酰胺原予來避免聚集，在肽鏈合成中每隔個氨基酸采用酰胺原子保護可以避免折疊結(jié)構(gòu)形成；）在肽鏈中引入類脯氨酸（），因為類脯氨酸殘基可以干擾分子間的折疊結(jié)構(gòu)形成【】：）通過加入冰乙酸調(diào)節(jié)反應體系中的值到，干擾肽鏈間氫鍵的生成，提高縮合效率口；）使用低擔載量的樹脂可以減少合成肽鏈聚集作用，從而減少折疊生成。另外，使用聚酰胺樹脂，因為其結(jié)構(gòu)與肽鏈相近，能減少發(fā)生折疊的可能性，特別適用于長肽的合成。固相多肽合成中新技術的應

14、用盡管固相多肽合成具有優(yōu)越性，但是由于其合成的非均相性，所以仍然存在許多問題，如非線性動力學、反應慢、溶脹性問題以及合成中固相載體的降解等。其中有些問題還相當突出，如合成較長的肽鏈時反應時間特別長，因此，任何能夠進一步提高反應速率，減少反應時間的技術就成為目前固相多肽合成的又個新的關注點，特別是微波技術是目前的研究熱點。微波是頻率約在一，即波長在至范圍內(nèi)的電磁波。它位于電磁波譜的紅外輻射（光波）和無線電波之間。年及其同事研究了微波酯化反應，使微波技術作為一種新技術在有機合成中應用，是微波有機合成化學開始的標志口】。在以后的十幾年內(nèi)微波有機合成化學發(fā)展成為一門新興交叉學科化學（）即微波促進有機化

15、學，也叫微波誘導催化有機反應化學。與傳統(tǒng)加熱相比，微波加熱可使反應速率大大加快，甚至可以提高上千倍，同時由于產(chǎn)生的微波等離子體中?？纱嬖跓崃W方法得不到的高能態(tài)原子、分子和離子，因而可使一些熱力學上不可能發(fā)生的反應得以發(fā)生。世紀年代出現(xiàn)密閉式的專門微波有機合成裝置以來，微波合成裝置的功能得到了很大的改進，促進了微波在有機合成中的應用。微波反應除了具有一般的加熱作用，還可以通過分子活性基團吸收微波能量，提高反應活性。此外，微波還有一種稱為“分子攪拌”的作用。有文獻報道】采用普通微波爐提高固相多肽合成中的肽鍵縮合效率。中國臺灣大學的于輝明【川等人也采用普通微波爐改造的微波反應裝置，以為反應溶劑，采

16、用，樹脂作為固相合成載體，一氨基酸的活潑酯為原料合成了，并將合成結(jié)果與多肽合成儀的合成結(jié)果進行比較，結(jié)果表明采用微波固相合成得率為，而多肽合成儀的合成得率為，而且微波合成中未發(fā)現(xiàn)有消旋產(chǎn)物，反應中體系的溫度可以通過調(diào)整微波功率來控制。多肽的分離純化與鑒定多肽的分離純化方法液相色譜法是生物技術中分離純化的一種重要方法，在多肽分離純化中顯示出優(yōu)異的性能。近年來，液相色譜法已成為分離純化蛋白質(zhì)多肽最有效的方法之一【】。在多肽的純化領域中，常用的色譜分離技術主要有排阻色譜、離子交換色譜和反相色譜【”。）排阻色譜（，）是一種純粹按照溶質(zhì)分子在流動相溶劑中的體積大小分離的色譜法。填料有一定范圍的孔尺寸，大

17、分子進不去而先流出色譜柱，小分子后流出。在用水系統(tǒng)作為流動相的情況下，又稱為凝膠過濾色譜（）。在使用有機物為流動相時為凝膠滲透色譜（）。）離子交換色譜（，）是基于多肽和離子交換劑之間的靜電作用，導致介質(zhì)表面的可交換離子與帶相同電荷的多肽分子發(fā)生交換。其保留次序取決于配體和蛋白質(zhì)多肷問的靜電作用力，含鹽的緩沖流動相系統(tǒng)有利于增加其活性回收率。其固定相基體主要是親水共聚物。）反相色譜（，）是基于溶質(zhì)、極性流動相和非極性固定相表面問的非選擇性作用力特征所建立的一種色譜模式。在生物大分子的條件下，流動相多采用酸性的、低離子強度的有機溶劑一水溶液。常用固定相為硅膠烷基鍵合相，除此而外，還有多孔固定相口，

18、苯乙烯型共聚微球？填料，氧化鋁、氧化鋯等作為基質(zhì)的涂層填料。以上三種方法的獨自使用或者其中兩種、三種的聯(lián)合使用，已經(jīng)成為分離多肽的必備手段。李默漪等經(jīng)一步純化，得到了純度為的入胰島素原肽，收率為；俞超等在純化胸腺素時，使用了一步離子交換色譜，所收集樣脫鹽純化后即得純度為的產(chǎn)品；等采用凝膠過濾色譜一和離予交換色譜一，對合成的肽聚糖單體衍生物進行了分離純化；李頊子等應用反相高效制備液相色譜法，對種合成的蜂毒肽類似物進行了分離制備。張鵬飛【】等使用離子交換和反相色譜聯(lián)用的方法分離純化了大疣蛛毒素。多肽的鑒定在進行多肽合成研究的同時，發(fā)展出來了各種多肽分析鑒定辦法用來檢驗合成多肽的正確與否，幾種主要方

19、法如下：）質(zhì)譜分析（）多年來質(zhì)譜分析被認為是測定小分子分子量最準確、最靈敏的方法。近年來離子化的技術及儀器方面取得了突破性的進展，使質(zhì)譜所能測定的分子量大大超出了道爾頓。為此，“軟”離子化技術、基質(zhì)輔助的激光解吸離子化（）和電噴霧離子化（）顯得尤其有前途。這些技術的準確性、靈敏度及分辨力使得測定多肽、蛋白質(zhì)和其它生物多聚體成為可能。通過液相色譜一離子阱質(zhì)譜聯(lián)用（如）、串聯(lián)質(zhì)譜技術（）和源后衰減基質(zhì)輔助的激光解哪離子化（，），人們便可以從質(zhì)譜分析中獲得肽及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。）電泳電泳技術首先由拍建立，由和進一步完善”。它是蛋白質(zhì)和多肽分析中常用的手段，可用來估算樣品的分子量和純度。目前常用的電泳

20、對分子量小于的多肽分子來說都沒有足夠的分離效果。在電泳過程中，由于小分子多肽與所形成的“團塊”（）難以分開，導致此復合物難以進入分離膠，染色后形成條紋（）。通過在凝膠中加入尿素、增加濃，縮膠的濃度來改善分離效果，但這又給后續(xù)的染色帶來困難。蛐等提出用代替甘氨酸作為電泳緩沖液中的尾隨離子，同時降低凝膠中雙丙烯酰胺的比例，對小分子多肽的電泳取得了很好的效果。）其他分析方法除上述方法之外，氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、取、光譜、圓二色譜、生物活性鑒定、放射性同位素標記和免疫學等方法都已應用于多肽類物質(zhì)分析、鑒定。生物活性肽類藥物生物活性肽概述生物活性肽（，）是指能夠調(diào)節(jié)生物機體的生命活動或具有某些

21、生理活性作用的一類肽的總稱。這些生物活性肽多以非活性狀態(tài)存在于蛋白質(zhì)長鏈中，當被酶解成適當?shù)拈L度時，它們的活性就會表現(xiàn)出來。從生物學角度講，肽鏈長度少于個氨基酸的稱為寡肽，超過個氨基酸的稱為多肽，氨基酸和多肽統(tǒng)稱為生物活性肽，氨基酸為個以上的稱為蛋白質(zhì)。近年來，生物活性肽漸漸被人們所認識，隨著分子生物學、生物化學技術的飛速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)存在于生物體內(nèi)的多肽已有數(shù)萬種，它們時刻發(fā)揮著不同的生理功效。肽是涉及生物體內(nèi)多種細胞功能的生物活性物質(zhì)。生物體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)、定性了幾百種多肽，它們是機體完成各種復雜的生理活動所必不可少的參與者。在自然界所有細胞都能合成多肽物質(zhì)，其細胞功能活動也受多肽的調(diào)節(jié)控帶。

22、例如，物質(zhì)代謝、激素分泌、神經(jīng)、細胞生長及繁殖等所有生命活動的領域，其主要作用機制是調(diào)節(jié)體內(nèi)各個系統(tǒng)器官及細胞的各類生命活動，調(diào)節(jié)激活體內(nèi)的有關酶類，保障代謝途徑的暢通，或通過控帝的轉(zhuǎn)錄或通過控制蛋白質(zhì)的翻譯而影響特殊功能的蛋白質(zhì)合成，最終產(chǎn)生特定的生理效應或發(fā)揮其藥理作用。生物活性肽類藥物的功能特性生物活性肽作為藥物具有其獨特的優(yōu)點：首先，分子量小，無免疫原性，比較安全：其次，結(jié)構(gòu)相對簡單，功能較明確，特異、副作用??；第三，分子小，易于合成，結(jié)構(gòu)易于改造，生產(chǎn)成本低；第四，多肽藥物易于從多途徑吸收，因此給藥途徑可多樣化（如：口服、噴霧、透皮吸收等）；第五，合成的多肽純度較高，不存在熱源問題【

23、】。正因為如此，國內(nèi)外對多肽藥物的研究特別重視。目前已有數(shù)十種多肽藥物上市（如：降鈣素、奧曲肽、催產(chǎn)素等），有余種多肽藥物已在進行臨床研究。這些多肽藥物被用于抗腫瘤、抗病毒、疫苗及增強造血功能等眾多領域。生物活性肽類藥物的分類生物活性肽類藥物習慣上常指多肽類激素，依據(jù)生物活性肽類藥物的作用和分泌部位分為：）加壓素及其衍生物有腦神經(jīng)垂體素、加壓素、鞣酸加壓素、去氨精加壓素、苯賴加壓素、鳥加壓素（）等。）催產(chǎn)素及其衍生物有催產(chǎn)素、去氨基催產(chǎn)素、催產(chǎn)素酒石酸等。）促皮質(zhì)素及其衍生物有促皮質(zhì)素、鋅促皮質(zhì)素（）、磷鋅促皮質(zhì)素、明膠促皮質(zhì)素、羧纖促皮質(zhì)素、絲賴促皮質(zhì)肽、甘精促皮質(zhì)肽、鋅促皮質(zhì)肽、促皮質(zhì)肽、

24、肽、肽等。）下丘腦垂體肽激素有促性腺素釋放激素、促甲狀腺素釋放激素、生長激素釋放激素（）、生長激素抑制素（）、促黑色素細胞抑制激素（）、促黑色素細胞釋放激素（）、催乳素釋放激素（）、催乳素抑制激素（）、促皮質(zhì)素釋放激素（）等。）消化道激素有促胃泌素肽、肽、肽、肽、（，胰泌素、膽囊收縮素肽、肽、肽，抑胃肽、胃動肽、血管活性肽、胰多肽、物質(zhì)、神經(jīng)降壓肽、蛙皮肽肽、肽等。）其他激素和活性肽有胸腺素、胰高血糖素、降鈣素、血管緊張肽（肽）、（肽）、（肽）、腦啡肽、內(nèi)啡肽、睡眠肽、記憶肽、松果肽、胰蛋白酶抑制劑等。生物活性肽類藥物的研究開發(fā)）多肽疫苗多肽疫苗與核酸疫苗一樣是目前疫苗研究領域內(nèi)較受重視的研究

25、方向之一，尤其是對病毒多肽疫苗進行了大量研究。年美國】公布了兩種病毒多肽疫苗對人體進行的期臨床試驗結(jié)果；其它病毒的多肽疫苗及抗腫瘤、避孕例等多肽疫苗的研究也取得了較大進展。）抗腫瘤多肽不同的腫瘤產(chǎn)生時所需要的酶等調(diào)控因子不同，選擇特異性小肽作為腫瘤發(fā)生時所需的調(diào)控因子，封閉其活性位點，可防止腫瘤發(fā)生，篩選與這些靶點特異結(jié)合的多肽，已成為尋找抗癌藥物的新熱點】。）抗病毒多肽病毒通過與宿主細胞上的特異受體結(jié)合吸附細胞，依賴其自身的特異蛋白酶進行蛋白加工及核酸復制。因此可從肽庫內(nèi)篩選出與宿主細胞受體結(jié)合的多肽或能與病毒蛋白酶等活性位點結(jié)合的多肽，用于抗病毒的治療。）多肽導向藥物很多毒素、細胞因子等有

26、較強的腫瘤細胞毒性，在人類長期或大量使用時可損傷正常細胞。從肽庫內(nèi)篩選出能與腫瘤抗原特異結(jié)合的小肽，可用于導向藥物，因其分子量小，比鼠源性的單克隆抗體更適合用于導向藥物。）細胞因子模擬肽利用已知細胞因子的受體從肽庫內(nèi)篩選細胞因子模擬肽，近年成為國內(nèi)外研究的熱點【。）抗菌性活性肽當昆蟲受到外界環(huán)境刺激時產(chǎn)生大量的具有抗菌活性的陽離子多肽，例如，從蛇毒內(nèi)分離出一個含個氨基酸的小肽，其對及菌均有極強的殺菌能力【。（）用于心血管疾病的多肽現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)植物中有很多有效成分是小分子多肽。例如，從大豆內(nèi)加工分離出的活性多肽，能防治血栓、高血壓和高血脂，還能延緩變老、提高肌體抗腫瘤能力。（）其它藥用小肽如等發(fā)現(xiàn)的

27、合成肽（）能促進傷口血管的再生，加速皮膚深度傷口的愈合；等】發(fā)現(xiàn)的小肽（）能防止堿損傷角膜內(nèi)炎癥細胞的侵潤，抑制炎癥反應。（）診斷用多肽多肽在診斷試劑中最主要的用途是用作抗原檢測病毒、細菌、支原體、螺旋體等微生物和囊蟲、錐蟲等寄生蟲的抗體，由于其檢測抗體的假陰性率和本底反應都很低，易于臨床應用】。生物活性肽類藥物的臨床應用及發(fā)展趨勢生物活性肽這類物質(zhì)在體內(nèi)起著各種各樣的生理作用，作為藥物有著十分廣泛的應用。表介紹了幾種多肽藥物的臨床應用情況及其功效。表多肽藥物的臨床應用情況及其功效示例我國在活性肽研究方面起步較晚，但發(fā)展也較為迅速。據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局資料顯示，近年來我國每年也以近個生物活

28、性肽產(chǎn)品申報保健品、藥品，呈現(xiàn)出強勁勢頭。隨著現(xiàn)代蛋白質(zhì)工程、生物酶工程技術迅速發(fā)展，大量具有特殊功能的生物活性肽被發(fā)現(xiàn)、開發(fā)出來，應用于食品配方、功能性食品、食品添加劑、藥品、化妝品、無公害飼料添加劑等領域。生物活性肽領域已成為國際上新興的生物高科技產(chǎn)業(yè)領域，是具有極大市場潛力的朝陽產(chǎn)業(yè)，受到各國科學家和政府的高度重視。本課題研究目的意義和內(nèi)容課題研究目的和意義機體保護肽是一種新型生物活性肽。該多肽經(jīng)實驗證明，能夠清除體內(nèi)自由基，提高機體抗氧化性，對于增強機體免疫能力和延緩疲勞有很好的效果，具有寬廣的應用前景和市場潛力。但機體保護肽中存在的數(shù)個直接相連的脯氨酸環(huán)狀結(jié)構(gòu)所形成的空間位阻效應及疏

29、水作用使得合成面臨相當大的困難，對合成產(chǎn)率、產(chǎn)品純度以及純化工作都會帶來很大影響。因此本課題的研究目的在于建立一套簡單成熟的機體保護肽的合成路線，并嘗試進行工業(yè)化的擴大生產(chǎn)。研究意義在于可以降低機體保護肽的生產(chǎn)成本，降低使用門檻擴大使用范圍，具有非?？捎^的經(jīng)濟價值和社會價值。課題研究內(nèi)容首先，采用固相合成法合成機體保護肽，對關鍵的合成工藝進行優(yōu)化。使用樹臘和一樹脂作為固相合成樹脂，采用肽鍵縮合法連接氨基酸，用作為主要切割試劑將機體保護肽從樹脂上切割下來。然后，采用液相色譜系統(tǒng)對機體保護肽進行分析純化，使用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行質(zhì)譜儀（）對產(chǎn)品分子量進行測定。最后，采用半制備規(guī)格反相液相色譜

30、系統(tǒng)進行制備研究。第二章機體保護肽的固相合成前言機體保護多肽（肽）是本研究課題組應用噬菌體表面呈現(xiàn)隨機肽庫技術篩選出的新型細胞因子模擬多肽。該多肽經(jīng)本研究課題組實驗證明，能夠促進機體蛋白質(zhì)合成和肌肉增長，清除體內(nèi)自由基，提高機體抗氧化性，增強機體免疫能力和延緩疲勞，有效的防止應急反應中所產(chǎn)生的有害物質(zhì)對機體器官的損害，具有廣闊的應用前景和市場潛力。本文首次合成了機體保護多肽，并用半制備規(guī)格反相高效液相色譜進行了純化，用飛行質(zhì)譜儀對合成產(chǎn)物進行了分析。固相合成法年由首創(chuàng)斷】，之后經(jīng)過進一步的完善，目前已成為應用最廣泛、效果最理想的多肽合成技術蚓。根據(jù)所使用的選擇性保護策略不同，固相合成法可分為法

31、，法以及法等等，其中法由于反應條件溫和，副反應少及產(chǎn)率高等優(yōu)點而廣泛的應用于現(xiàn)代多肽固相合成中，已經(jīng)成功的合成了醋酸奧曲肽舊，人胸腺肽等活性肽。固相法合成多肽比較快速、簡單、有效，但是機體保護多肽中存在的一。序列對合成造成了相當大的難度，數(shù)個直接相連的脯氨酸壞狀結(jié)構(gòu)所形成的空間位阻效應及疏水作用使得合成的產(chǎn)率及產(chǎn)品的純度受到了很大的影響，并且會使樹脂與肽之間共價鍵容易斷裂從而生成各種分枝肽、空心肽等副產(chǎn)物，對合成產(chǎn)率、產(chǎn)品純度以及純化工作都會帶來很大影響。因此，為了實現(xiàn)大量生產(chǎn)機體保護多肽的目的，本文對該多肽的固相合成工藝進行了研究。實驗部分儀器和設備玻璃材質(zhì)多肽合成反應器自制真空冷凍干燥機超

32、純水凈水器美國日本公司日本公司上海第三分析儀器廠天津泰斯特儀器有限公司電子天平分光光度計電熱鼓風干燥箱一型小型臺式離心機試劑三氟乙酸（）乙二硫醇（）苯甲硫醚（）苯酚（）樹脂一氯三苯甲基氯樹脂哌啶茚三酮（）北京儀器六廠吉爾生化（上海）有限公司吉爾生化（上海）有限公司公司美國公司吉爾生化（上海）有限公司重慶北碚精細化工廠吉爾生化（上海）有限公司吉爾生化（上海）有限公司美國公司吉爾生化（上海）有限公司吉爾生化（上海）有限公司吉爾生化（上海）有限公司中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司吉爾生化（上海）有限公司吉爾生化（上海）有限公司吉爾生化（上海）有限公司吉爾生化（上海）有限公司吉爾生化（上海）有限公司吉爾生

33、化（上海）有限公司吉爾生化（上海）有限公司吉爾生化（上海）有限公司（們其它試齊蚪，二甲基甲酰胺（）、甲醇（）、二氯甲烷（）、異丙醇、無水乙醚、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純重蒸后使用。多肽合成實驗裝置圖一多肽合成反應器：標準磨口塞：連有三通活塞的合成反應器：接廢液的錐形瓶裝置說明和處連接導管與大氣相連。處為砂芯，是樹脂與氨基酸反應的場所。處為三通活塞，導管與氮氣瓶相連。反應或洗滌時，將樹脂反應液或洗滌液置反應瓶砂芯上，打開氮氣瓶減壓閥，通氣。開通瓶與韻活栓閥，關閉瓶與瓶的連接。此時通入的氮氣自下而上進入瓶內(nèi)，致使瓶內(nèi)溶液產(chǎn)生氣泡而起到混勻攪拌的作用。反應完畢或洗滌完畢后，開放瓶的兩通活栓，將瓶的三通

34、活栓旋轉(zhuǎn)至瓶與瓶連接，反應液在重力作用下進入瓶。機體保護肽的樹脂固相合成以（取代量，）為合成起點，向氨端逐步遞加側(cè)鏈帶保護的氨基酸、延長肽鏈，直到合成完畢。鋤樹脂合成機體保護肽的簡要流程如圖所示。圖？）法合成機體保護肽流程蚓樹脂的活化將加到反應器中，用，二甲基甲酰胺（）浸泡，使樹脂充分活化，然后將液體抽干。??；。一太卜圖¨樹脂的結(jié)構(gòu)式連結(jié)第一個氨基酸到樹脂（法）活化好的樹脂可以直接用來連接第一個氨基酸，這里采用法。取的（）用最少量的溶解，入的一二甲氨基哌啶（），然后加入的，一二異丙基二亞胺（），如果溶解不好，可以加入少量的二氯甲烷（）進行溶解。把氨基酸和樹脂一起放到反應器，通入氮氣。

35、反應完畢，吹去反應液，依次分別使用毫升、異丙醇、洗滌樹脂兩次，吹干，測定偶聯(lián)效率。偶連率的測定方法實驗采用重量法和比色法兩種方法測定偶連率。）重量法采用重量法測定偶聯(lián)率的原理是定量的樹脂的反應基團的質(zhì)量摩爾數(shù)是固定的，因此，理論上連接的氨基酸摩爾數(shù)也是固定的。根據(jù)實際連接的氨基酸質(zhì)量數(shù)和理論連接的質(zhì)量數(shù)的比，可以算出偶聯(lián)率。實際交換當量（）（一）（）：樹脂的重量：連接氨基酸后的樹脂的重量：保護的氨基酸的分子量：的分子量理論交換當量（）（）（×）（一）：樹脂的交換當量：樹脂的重量：保護的氨基酸的分子量：的分子量和基團的分子量的和偶聯(lián)率實際交換當量理論交換當量）比色法采用比色法的根據(jù)是脫

36、保護的氨基酸暴露出來的氨基基團可以和專門的檢測試劑發(fā)生顏色反應，這個反應是定量的，顏色的深淺和氨基基團的數(shù)量多少成正比。顏色的深淺可以用分光光度計測量，據(jù)此可以計算出來偶聯(lián)率的數(shù)值。準確稱取毫克的連接了第一個氨基酸的樹脂，放入管中，加入滴冰乙酸和毫升甲醇，洗滌后用毫升甲醇洗滌次。然后凍干，準確稱重。加入偶聯(lián)率檢驗專用試劑微升，同時制空白。沸水浴反應，其間振蕩次。取出來后立即加入毫升乙醇至總體積為毫升。充分搖勻，然后用乙醇掃基線，在處測定樣品和空白的吸光度。按照下列公式計算：（一眥。垤）（）×體積（）】（×樣品重量）偶聯(lián)率（）（×理論交換當量），樹脂上殘余反應基團的

37、封閉取，分別將苯甲酰氯和哌啶溶于中，之后加入連接了第一個氨基酸的樹脂中，反應。封閉反應結(jié)束后，依次分別使用毫升、異丙醇、洗滌樹脂兩次?；鶊F的脫除將溶液（哌啶的溶液，）加入至保護的氨基酸樹脂中，氮氣攪拌條件下反應分鐘后，抽干，再加入的溶液于氮氣攪拌條件下反應分鐘，抽干后，依次分別使用毫升異丙醇、洗滌樹脂三次。取少許樹脂進行茚三酮檢測，檢溺的脫除隋況。茚三酮定性顯色每次用小試管取大約樹脂，用乙醇洗滌后，往試管中依次加入滴緩沖液（苯酚溶于乙醇啶），滴乙醇溶液（×），滴茚三酮溶液（茚三酮溶于乙醇，），用超聲波進行脫氨處理。然后在沸水浴中加熱，觀察樹脂及試管中溶液的顏色，進而判斷反應的進行程度

38、。，連接其余氨基酸（法）將的（）、一氧一一，胺羰基苯駢三氮唑四氟化硼鹽（）、一羥基苯并三氮唑（）溶液（溶液）和的二異丙基乙胺（）依次分別溶于的溶液中，室溫下反應，以茚三酮反應監(jiān)測反應進程，若定性檢測合格后，則將反應溶劑抽干，依次分別使用毫升異丙醇、洗滌樹脂三次，按照所述的方法進行脫保護反應，洗滌后按照機體保護肽的氨基酸序列依次重復上述的縮合反應，每個氨基酸連接反應時間為。在每一個氨基酸連接反應結(jié)束后，取少量樹脂洗滌吹干，計算偶聯(lián)效率。殘余氨基的乙?；忾]當縮合效率不理想時，為了減少缺失肽的形成，采用主動封閉樹脂殘余氨基的方法，用醋酐溶液（：）（：）使未反應的氨基乙?；?。肽的切割反應完成之后將氨

39、基酸樹脂使用毫升異丙醇、和甲醇依次洗滌樹脂三次，將溶劑抽干，在氮氣中將氨基酸樹脂吹干。之后將吹于的樹脂從反應器中取出放入干燥潔凈的磨口燒瓶中，將約冷藏的切割試劑倒入瓶中，密封于室溫下（。）避光磁力攪拌。反應完畢后將反應液口入冷藏的無水乙醚中，可看到有大量白色沉淀產(chǎn)生。等到不再產(chǎn)生白色沉淀時，將樹脂與沉淀分離，再用三倍量樹脂體積的三氟乙酸分兩次進行洗滌樹脂，洗滌液一并歸入到沉淀液中。將乙醚溶液低溫放景、時后，用低溫離心機離出沉淀，再用冷乙醚將沉淀離心洗滌三次。之后用超純水萃取三次，最后將萃取后的水溶液冷凍干燥后，即得粗產(chǎn)品。真空干燥稱重，計算合成產(chǎn)率。合成粗肽的軀鑒定合成粗肽的分析檢測使用公司型

40、以為基質(zhì)，樣品與基質(zhì)飽和溶液以：（）混合點樣，室溫干燥。在線性模式下，加速電壓進行分析。機體保護肽的一氯三苯甲基樹脂固相合成選用一代量垤，）作樹脂的參照合成機體保護肽，比較兩種樹脂的不同合成效果。樹脂的活化稱取加到反應器中，用浸泡，使樹脂充分活化。圖樹脂的結(jié)構(gòu)一連結(jié)第一個氨基酸到樹脂（法）取的（）溶解于中，然后加的，把氨基酸和樹脂起放入反應器，通入氮氣反應。之后加入甲醇，繼續(xù)反應。反應完畢，吹去反應液，依次分別使用毫升、異丙醇、洗滌樹脂兩次，吹干，測定偶聯(lián)效率。其余合成環(huán)節(jié)基團的脫除參照中所述的方法。連接其余氨基酸參照中所述的方法，其中的溶劑改為。殘余氨基封閉參照中所述的方法。肽的切割參照中所述的方法。合成粗肽的分析方法參見，所述的方法放大規(guī)模的機體保護肽合成使用截面積更大的反應器，嘗試放大倍規(guī)模的樹脂合成路線，合成試劑用量線性放大，洗滌溶劑每次用量稍微放大，洗滌次數(shù)增加，總用量仍呈線性放大。結(jié)果與討論多肽合成中樹脂的選擇聚苯乙烯具有很好的化學穩(wěn)定性，能夠耐受多種反應條件，包括用弱氧化物、強酸、強堿等方法的處理。交聯(lián)度為的樹脂，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有較大的空間結(jié)構(gòu)，能夠保證反應試劑的自由進出，減少了局部位置可