SOD對腦缺血-再灌注損傷大鼠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的影響＊

1、    SOD對腦缺血-再灌注損傷大鼠谷 氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的影響        摘要目的：探討超氧化物歧化酶(SOD)對腦缺血再灌注 損 傷(I-R)大鼠皮層、海馬、紋狀體谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的影響。方法：采用大 鼠3個(gè)血管夾閉、松夾復(fù)制腦I-R損傷模型。利用腦組織突觸膜顆粒對3H-L-谷氨酸攝 入量 的測定及分光光度法觀察SOD對皮層海馬紋狀體谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能、丙二醛(MDA)含量及SO D 活性的影響。結(jié)果：I-R組谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能及SOD活性明顯低于對照組( P0

2、.05，0.01)，MDA含量明顯高于對照組(P0.05，0.01)。SOD+I-R 組大鼠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能及SOD活性明顯高于I-R組(P0.05， 0.01)；MDA含量明 顯低于I-R組(P0.05， 0.01)。結(jié)論：SOD可改善I-R后腦組織谷 氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能，其機(jī)制可能與清除自由基有關(guān)。主題詞再灌注損傷；過氧化物脂質(zhì)類；超氧化物歧化酶；大鼠 Influence of SOD on the function of glutamate transporterin ra ts with injury of cerebral ischemia-reperfusionREN Xiao-Y

3、an, GE Bao-Lin, QU Zhong-Sen, ZHANG Yu-Min Department of Pathophysiology, Medical College of Qingdao University, Qin gdao(266021)Abstract AIM：To investigate the effect of superoxide dismutas e (SOD) on the function of glutamate transporter in rats with injury of cerebral i schemia-reperfusion.METHOD

4、S：A model of ischemia-reperfusion injur y(I-R) was performed by clipping three arteries and then by releasing them to rep erfuse blood into ischemic brain in rats. Glutamate transporter functions were s tudied by means of assay of 3H-L-glutamate uptake in synaptosomes, and malo ndialdehyde (MDA) con

5、tents and SOD activities in cerebral contex, hippocampus ,s triatum by spectrophotometry.RESULTS：Glutamate transporter functi on and SOD activity in I-R group significantly decreased (P0.05，P 0.01) ;content of MDA significantly increased(P0.05， P0.01) compared with contr ol group. Glutamate transpor

6、ter function and SOD activity in SOD group significa ntly increased (P0.05， P0.01);MDA content significantly decrease d(P0.05，P0.01) compared with I-R group.CONCLUSION：SOD can improv e glutamate transporter function of I-R rats. The mechanism might be related to eliminate free radicals.MeSHReperfusi

7、on injury; Lipid peroxides; Superoxide dismutas e; Rats谷氨酸存在于興奮性突觸前神經(jīng)末梢，遍布整個(gè)腦組織。其在突觸間 隙中過多的積聚可產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。正常情況下，神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn) 運(yùn)體在其毒性發(fā)生之前能很快清除突觸釋放的谷氨酸1。在體外培養(yǎng)的星狀膠質(zhì) 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，氧自由基可抑制谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的攝取功能2。在缺血及再灌注時(shí) 形成大量的氧自由基參與神經(jīng)毒性損傷的形成。本工作用大鼠腦缺血-再灌注損傷模型，觀 察超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)對谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的影響，并同時(shí)檢測了 腦組織丙二醛

8、(malondialdehyde,MDA)含量及SOD活性的變化，以期探討其機(jī)制。材料和方法一、實(shí)驗(yàn)材料：3 H-L-谷氨酸(美國杜邦公司，152.07×1010 Bq/mmol)；SOD(河 北保定市生化營養(yǎng)源開發(fā)中心，4 000 U/mg)；MDA、SOD測定試劑盒(南京建成生物工程 研究所)。高速冰凍離心機(jī)(日本Tomy 公 司出品，RS-20型)；液體閃爍計(jì)數(shù)儀(瑞典LKB公司出品，1209型)；分光光度計(jì)(上海分析 儀器廠出品，751型)。二、實(shí)驗(yàn)方法：1.動物模型復(fù)制：健康Wistar大鼠24只(250350 g)，雌雄兼用，隨機(jī)分為3組，每組8只。Ischemia-re

9、perfu sion(I-R)組：20%的烏拉坦0.5 mL/100 g ip麻醉，行頸部手術(shù)，分離兩側(cè)頸總動脈，于甲 狀軟骨上緣右側(cè)分離肌肉至枕骨腹面，先在枕骨嵴旁鉆1小 孔，擴(kuò)大為3 mm×2 mm大小的骨窗，暴露基底動脈，用特制無損傷的動脈夾夾閉上述3個(gè)動脈，腦電變?yōu)橐黄?線，觀察120 min，然后將3個(gè)動脈夾全部放開，繼續(xù)觀察30 min。SOD+I-R組于夾閉血管前10 min靜脈推 注 SOD(680 U/100 g大鼠)，手術(shù)過程同I-R組。對照組實(shí)驗(yàn)過程基本同I-R組，但血管不夾閉， 。實(shí)驗(yàn)完畢后斷頭取腦，按自然分界分離皮層、海馬、紋狀體，液氮冷凍，-70冰箱保存

10、。2.谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體膜顆粒制備：腦組織用10倍(W：V)的勻漿液(0.3 mol/L)甘露醇，1 mmol/L EDTA鈉，pH7.4)勻漿后，以 6 000r/min離心10 min，取上清液，4，15 000 r/min離心20 min，混旋，依次加低張緩 沖液(1 mol/L Tris，0.5 mol/L EDTA鈉，pH7.4)，懸浮緩沖液(100 mmol/L磷酸鈉，5 mm oL/L Tris-SO4, 100 mmol/L MgSO4，0.5 mol/L EDTA鈉，1%甘油，pH 7.4)，裝載 緩沖液(0.1 mol/L 磷酸鉀，1 mmoL/L MgSO4，pH6.8)，分別

11、在4， 15 000 r/min離 心20 min，均取沉淀，最 后加裝載緩沖液備用。3.谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能測定：取突觸膜顆粒20L加入膜外液(0.15/L NaCl 180L，0.25L 3 H-L-谷氨酸)中， 置30水浴中反應(yīng)10 min，用2 mL冰冷0.15/L NaCl終止反應(yīng)，迅速倒在孔徑為0.45 m的濾 膜上定時(shí)(40 s)定量(24 mL)地用冰冷NaCl沖洗抽濾，濾膜烘干置于液閃瓶中，隔夜在液體 閃爍讀數(shù)儀上測定。樣本均做雙管。膜顆粒的蛋白測定采用Lowry法。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能 表達(dá)為膜顆粒對谷氨酸的攝入量(nmol*min-1* mg-1 Pr)。4.MDA含量、SOD

12、活性測定：采用分光光度法測定MDA含量和SOD活性。MDA采用10%的勻漿 ，其含量單位為nmol/mg濕重；SOD采用1%的勻漿，活力單位為U/mL。5.統(tǒng)計(jì)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，組間比較采用方差分析。結(jié)果一、SOD對谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的影響：I-R組皮層、海馬、紋狀體谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能低于對照組(P0.01)；SOD+I-R組皮 層、海馬、紋狀體谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功及SOD活性顯著高于I-R組(P0.01，P0.0 5)，見表1。?表1SOD對腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的影響Tab 1 The influence of SOD on glutamate transp

13、orterfunction in ra ts with injury of cerebral ischemia-reperfusion (pmolmin-1mg- 1 Pr，±s,n=8)GroupContexHippocampusStriatumControl1.83±0.411.30±0.174.45±1.04I-R1.36±0.32*0.95±0.12*2.65±0 .61*SOD+I-R1.72±0.191.46±0.463.29±*P0.05，*P0.01， vs control;P0

14、.05， P0.01，vs I-R group二、SOD對腦組織MDA含量的影響：I-R組皮層、海馬、紋狀體MDA的含量顯著高于對照組(P0.05， 0.01)；SOD+I-R組 皮層、海馬、紋狀體MDA含量顯著低于I-R組(P0.05，P0.01)，見表2。表2SOD對腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織MDA含量的影響Tab 2 The influence of SOD on MDA content in ratswith injury of c erebral ischemia-reperfusion(nmol/mg，±s,n=8)GroupContexHippocampusStria

15、tumContro20.13±0.7515.93±1.6016.03±2.36I-R22.27±0.18*19.10±0.94*20.03± 1.86SOD+I-R20.59±1.7716.31±2.0016.96±1.96 *P0.05，*P0.01， vs control;P0 .05，P0.01，vs I-R group三、SOD對腦組織SOD的影響：I-R組皮層、海馬、紋狀體的SOD活性顯著低于對照組(P0.05，P0.01)；SO D+I-R組的SOD活性明顯高于I-R組(P0.01，P0.05

16、)，見表3。表3SOD對腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織SOD活性的影響Tab 3 The influence of SOD on SOD activity inrats with injury of cerebral ischemia-reperfusion(U/mg，±s,n=8)GroupContexHippocampusStriatumContro117.50±4.51124.64±15.42108.80±5.68I-R110.55±5.08*104.20±6.87*99.31 ±6.70*SOD+I-R122.65&#

17、177;6.36123.70±17.62109.99± 5.66*P0.05，*P0.01， vs control;P0.05， P0.01，vs I-R group四、相關(guān)性分析：I-R組皮層、海馬、紋狀體谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能降低與MDA含量升高呈負(fù)相關(guān)(r=0.900 ， 0.923， 0.748，P0.01， P0.05)，與SOD活性降低呈正相關(guān)(r=0 .847， 0.894， 0.973， P0.01)。討論谷氨酸是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，但其異常積聚可嚴(yán)重?fù)p傷神經(jīng)細(xì)胞。生理情況下，谷氨酸從 神 經(jīng)元突觸前膜釋入突觸間隙，繼之作用于突觸后膜的受體產(chǎn)生神經(jīng)興奮作用，經(jīng)神

18、經(jīng)細(xì)胞突 觸前膜和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體重新攝取、貯存，從而維持其腦內(nèi)水平的相對穩(wěn) 定 。而腦缺血-再灌注時(shí)由于谷氨酸的再攝取功能降低可出現(xiàn)谷氨酸在神經(jīng)元突觸間隙中異常 積聚，由此引起Na和水進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞或出現(xiàn)鈣超載而誘發(fā)腦神經(jīng)細(xì)胞各種損傷性變化。 據(jù)報(bào)道，幼鼠紋狀體在1 h的體內(nèi)缺血缺氧后其谷氨酸的再攝取大約減少一半3，4 。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺血再灌流后皮層、海馬、紋狀體谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能均降低，并伴 隨著MDA含量升高和SOD活性降低。由此提示，缺血及其再灌后突觸間隙中谷氨酸的增多可能 與谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能降低有關(guān)。在體外培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，自由基 的形成可顯著降低谷

19、氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體清除細(xì)胞外谷氨酸的能力。當(dāng)在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入氧自由基 時(shí)，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的再攝取功能進(jìn)行性地受到抑制，加入自由基清除劑時(shí)，這種抑制作用解 除2。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：皮層、海馬、紋狀體谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能均降低與MDA含量 的升高呈負(fù)相關(guān)，與SOD活性的降低呈正相關(guān)。說明其與自由基生成有關(guān)。SOD是一種帶陰電荷的蛋白質(zhì)，它通過歧化方式清除超氧陰離子自由基在缺血及其 再灌注時(shí)導(dǎo)致血腦屏障開放，可使SOD進(jìn)入到內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿和腦組織細(xì)胞外間隙，發(fā)揮其 清除的作用5。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在缺血及其再灌的組 織中氧自由基極為 豐富，不僅導(dǎo)致了非特異性的損傷，而且可使谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能降低，興奮性氨基酸釋放 增加，

20、導(dǎo)致神經(jīng)毒性作用的發(fā)生6。有報(bào)道脂質(zhì)過氧化的抑制劑Vit E可預(yù) 防沙土 鼠缺血后CAI區(qū)椎體神經(jīng)元的死亡7。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源性地給予SOD，可使皮層 、海馬、紋狀體谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能顯著提高，同時(shí)伴隨著MDA含量的降低及腦組織SOD活性 提高。這可能與SOD具有較強(qiáng)的清除自由基、促使谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能恢復(fù)作用，進(jìn)而起到 保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用有關(guān)。*國家自然科學(xué)基金資助(No.39400051)作者單位：任曉燕葛 寶林曲忠森張玉敏青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室(青島266021)參考文獻(xiàn)1Schousboe A. Transport and metabolism of glutamate and GABA inneurons and glial cells. Int Rev Neurobiol, 1981,22:1.2Volterra A, Trotti D, Tromba C, et al. Glutamate uptake inhibition by o xygen free radicals in rat cortical ast