長期大強度運動大鼠腦組織阿黑皮素原mRNA表達的變化

1、長期大強度運動大鼠腦組織阿黑皮素原mRNA表達的變化*摘要目的和方法：采用生物素標(biāo)記阿黑皮素原(POMC) cRNA探針(Bio-cRNA)原位雜交法結(jié)合象分析，從基因轉(zhuǎn)錄水平觀察長時期(共7周)大強度(速度由15 m/min遞增至35 m/min，運動時間為2025 min/d)跑臺運動的大鼠不同腦區(qū)POMC mRNA表達。結(jié)果：該強度下大鼠末次運動結(jié)束后POMC基因表達在額葉皮層、海馬CA1下降(前者至運動結(jié)束后3 h仍未恢復(fù)，后者至運動結(jié)束后30 min即恢復(fù))，在下丘腦則增強。結(jié)論：POMC mRNA表達在該強度下運動的大鼠不同腦區(qū)呈現(xiàn)不同的動態(tài)變化趨勢。主題詞前阿片黑素細(xì)胞皮質(zhì)激素；

2、RNA，信使；雜交 Effects of long term and high intensity exercise on pro-opiomelanocortingene expression in rat brainCHEN Jia-Xu,YANG Wei-Yi,LIANG Rong,HUANG Qi-Fu,LIU Xiao-Lan,DONG HaoBejing University of Chinese Medicine,Beijing (100029)Abstract AIM and METHODS:In situ hybridization using biotin-labeled

3、pro-opiomelanocortin (POMC) cRNA probe,and integrating image pattern analysis were used to observe the effect of long term (total 7 weeks) and high intensity treadmill exercise (speed from 15 m/min gradually increased to 35 m/min with 0 degree,20 to 25 min/d duration) on the changes of POMC mRNA exp

4、ression in different areas of rat brain.RESULTS：Post-exercise instantly,the expression of POMC mRNA was decreased in frontal cortex,in which it was not recovery yet at post-exercise 3 hours;also decreased in hippocampal CA1,in which it was recovery at post-exercise 30 minutes.But the expression of P

5、OMC mRNA was increased in hypothalama.CONCLUSION：The dynamic changes of POMC gene expression in different areas of rat brain responding to such long term and high intensity exercise were not the same.MeSHPro-opiomelanocortin;RNA,messenger;Hybridization 運動為一種應(yīng)激源，而應(yīng)激與阿黑皮素原(pro-opiomelanocortin,POMC)系統(tǒng)

6、有關(guān)1。我們已報道長期(共7周)大強度跑臺運動(速度由15 m/min遞增至35 m/min，運動時間為2025 min/d)下對大鼠血乳酸、血-內(nèi)啡肽及強啡肽A1-13、亮氨酸腦啡肽的影響2。本研究運用生物素標(biāo)記POMC cRNA探針進行原位雜交并結(jié)合象分析，觀察該強度運動下大鼠腦組織POMC信使RNA(messenger RNA,mRNA)表達的變化。材料與方法動物：二級Spargue-Dawley雄性大鼠，體重180220 g。由北京醫(yī)科大學(xué)、解放軍301醫(yī)院等實驗動物中心提供。適應(yīng)訓(xùn)練：實驗動物(200只)置于室溫(202)、濕度40%動物室中，每5只1籠，自由進食飲水；適應(yīng)實驗環(huán)境1

7、2 d后開始訓(xùn)練，采用遞增強度的方式在國產(chǎn)電動鼠類跑臺(購自杭州)上運動，坡度為0。從訓(xùn)練第一周起，每周遞增速度，每周速度分別為15 m/min、22 m/min、27 m/min、31 m/min、35 m/min。每天訓(xùn)練20 min，每周5 d，共訓(xùn)練5周。第5周后按以下方案進行訓(xùn)練。一般訓(xùn)練：于第6、7周每只動物每日按35 m/min的速度，在坡度為0的跑臺上跑20 min。強化訓(xùn)練：于第6、7周每只動物每日按35 m/min的速度，在坡度為0的跑臺上跑25 min。造模周期共計7周，于第8周始取材，末次運動速度仍為35 m/min，時間為30 min。安靜對照組(A組，n=13)：自

8、實驗開始第17周直到第8周取材日不進行任何運動訓(xùn)練。訓(xùn)練對照組(B組，n=12):接受5周的適應(yīng)訓(xùn)練后，進一步進行2周的一般訓(xùn)練，于第8周取材日安靜狀態(tài)下取材。強化訓(xùn)練組(C組，n=56)：接受5周的適應(yīng)訓(xùn)練后，再接受2周的強化訓(xùn)練。于第8周取材日將動物隨機分為運動前安靜態(tài)(C)、運動后即刻(E)、運動結(jié)束后30 min(F)與3 h(G)。大鼠經(jīng)10%水合氯醛(400 mg/kg體重)麻醉后，剖開胸腔，經(jīng)左心室向升主動脈插管，先以預(yù)冷的0.9%生理鹽水速灌沖洗，一般約需100200 mL，直至流出液體變清為止；繼之灌入預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液(0.1 mol/L PB配制，pH7.4) 300

9、 mL，約30 min；取腦置于4%多聚甲醛溶液中4后固定610 h。然后將腦組織移至20%蔗糖溶液(0.1 mol/L PB配制，pH7.4)中于4保存，待組織下沉后，液氮驟冷，于-20 在LEICA-CM 1900型恒冷箱切片機中制備10 m切片，裱貼在預(yù)先經(jīng)2%APES(3-aminopropyltriethoxysilane,購自北京中山生物技術(shù)有限公司)膠處理的載玻片上，空氣中干燥后置-70冰箱中備用。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、擴增與提取：含POMC cDNA片段的質(zhì)粒(克隆載體為PGEM-4Z，含442 bp的POMC cDNA片段)由澳大利亞Dr.DOMINIC AUTELTANO贈送。按堿裂

10、解法對該質(zhì)粒進行大量制備。生物素標(biāo)記試POMC cRNA探針的制備：隨機引物標(biāo)記試劑盒(Promega產(chǎn)品)，PCR生物素標(biāo)記試劑盒、Taq酶等購自華美生物工程公司。在Eppendorf管中按順序加入50 ng DNA模板(POMC),3 L隨機引物(Random Primer),3 L 2 mmol/L NTP (2mmol/L ATP、CTP、GTP， 1mmol/L TTP、1mmol/L Biotin-UTP)，8 L 10PCR緩沖液，30.5 L無菌水，0.5 L Taq酶。然后加封石蠟油，置于PCR儀，變性、退火、延伸的參考溫度分別為94、35 、72 ，時間均為40 s，共35

11、個循環(huán)。POMC原位雜交程序：冰凍切片經(jīng)室溫平衡，水化后繼之按以下步驟進行。0.3%甲醇-H2O2封閉，避光，37，30 min； 0.1 mol/L HCl， 室溫，10 min;100 g/mL蛋白酶K， 37消化20 min； 4%多聚甲醛固定，室溫，5 min；以上各步之間用PBS(pH 7.4)充分漂洗；70%冷乙醇、100%冷乙醇各5 min；滴加雜交液，22 L/片，雜交液組成為：10 L 50%甲酰胺，4 L 20SSC， 2 L 20Denhards液，1 L ssDNA，1 L 1 M DTT,2 L 50% Dextra sulfate,2 L POMC Biotin-c

12、RNA探針，經(jīng)過6090變性35 min；置于濕盒中(含50%甲酰胺)，42孵育，24 h；2SSC,15 min 2次；1SSC,15 min 2次；ABC復(fù)合物(試劑盒為Vector公司產(chǎn)品，稀釋度為1100)，37，1 h； PBS 3 min 3次；0.05% DAB 加0.01% H2O2，鏡下控制顯色時間，酒精梯度脫水、二甲苯透明、樹膠封片。陰性對照組：用不含POMC生物素化的cRNA探針雜交液進行雜交，其它步驟同上；陰性對照實驗中未發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞出現(xiàn)，即無特異性反應(yīng)。采用Cambridge QTM 970型象分析系統(tǒng)，對雜交陽性細(xì)胞進行定量檢測。放大倍數(shù)為40220(物鏡放大倍物透

13、射放大倍數(shù)電路放大倍數(shù))，每組隨機測試6張切片，每一部位隨機測試1個視野；分別測量POMC陽性細(xì)胞個數(shù)(number)、數(shù)密度(numberical area,100/mm2)、陽性物面積(area,m2)、平均光密度(mean optical density,MOD)、積分光密度(integrated optical density,IOD)和陽性物面密度(area density)。用光密度表示各蛋白的相對含量，因IOD結(jié)合了陽性物面積和MOD兩方面因素，故主要選取IOD表示mRNA水平的相對含量。實驗結(jié)果均以平均值標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，兩兩比較采用Studentt檢驗；組間差異采用方差分析(

14、analysis of variance,ANOVA)，繼之以Duncans檢驗；以P0.05作為差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果光鏡下可見，POMC雜交陽性信號位于胞漿內(nèi)，胞核不著色，呈棕黃色顆粒，陽性細(xì)胞廣泛分布于皮質(zhì)、海馬、丘腦、下丘腦等腦區(qū)及其核團。對額葉皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)和下丘腦陽性細(xì)胞進行象分析，結(jié)果分別見表1。表1各組大鼠不同腦區(qū)POMC mRNA表達象分析結(jié)果Tab 1 Quantitative results of POMC mRNA gene expression of rat brain in each group (IOD,s)GroupFrontal cortexHippoca

15、mpal CA1HypothalamaA:Normal control1649.8379.55604.41986.81521.4585.5B:Exercise control1125.2211.04700.9810.51974.7296.2C:Pre-exercise3805.2828.96763.82973.71629.3470.4E:post-exercise instantly1608.2233.62685.0614.82376.3973.2F:Post-exercise 30 min1680.6583.75582.2905.42516.6787.4G:Post-exercise 3h1

16、689.0402.26616.61569.42255.4728.3P0.05,P0.01,vs A group;P0.01,vs B group;P0.05,P0.01,vs C group;P0.01,vs E group 1.POMC陽性信號在額葉皮層的IOD變化情況：在安靜狀態(tài)下A、B組IOD均分別顯著低于C組(P0.01)，B組IOD較A組顯著下降(P0.05)。強化訓(xùn)練運動后即刻E、30 min F及3 h G之間IOD無明顯差異(P0.05)，但均較運動前安靜態(tài)C呈極顯著下降(P0.01)。2.POMC陽性信號在海馬CA1區(qū)IOD變化的情況：在安靜狀態(tài)下各組IOD差異不顯著。強化訓(xùn)

17、練運動后即刻E其IOD顯著低于C組(P0.01)，在恢復(fù)過程中30 min F、3 h G其IOD分別較即刻E極顯著增高(P0.01)而至正常水平。3.POMC陽性信號在下丘腦IOD變化的情況：在安靜狀態(tài)下B組IOD顯著高于A組(P0.05)，強化訓(xùn)練運動后即刻E、30 min F、3 h G其IOD均分別顯著高于C組(P0.05或P0.01)，但E、F、G間IOD無顯著差異(P0.05)。討論POMC是促腎上腺皮質(zhì)激素、-內(nèi)啡肽、-促黑激素等的前體，主要在垂體合成，除垂體之外，有關(guān)POMC基因表達部位還有下丘腦、杏仁核、大腦皮層3等。POMC纖維少量分布于下丘腦弓狀核，但腹側(cè)正中至前連合區(qū)域

18、有大量的POMC神經(jīng)分布4，應(yīng)激與POMC系統(tǒng)有關(guān)1；有資料顯示急性應(yīng)激除影響-內(nèi)啡肽釋放外，也增加POMC合成和加工的速度5，6；反復(fù)足電震一周后POMC mRNA水平僅在垂體前葉增加，而在垂體中葉無變化7。本實驗用原位雜交方法，顯示POMC陽性細(xì)胞廣泛分布于大鼠腦皮層、海馬、丘腦、下丘腦等腦區(qū)及其核團。對于慢性運動應(yīng)激，POMC積分光密度于額葉皮層在安靜狀態(tài)C顯著升高，在海馬CA1區(qū)與下丘腦則變化不明顯；表明長期運動應(yīng)激僅使額葉皮層POMC表達增強。而在此基礎(chǔ)上強化訓(xùn)練運動結(jié)束后即刻POMC含量在額葉皮層、海馬CA1區(qū)較運動前均顯著下降，可能是大強度運動使該區(qū)POMC基因表達下調(diào)，在額葉皮

19、層POMC于運動結(jié)束后30 min、3 h仍未恢復(fù)，在海馬CA1區(qū)于運動結(jié)束后30 min即得以恢復(fù)；而在下丘腦POMC含量于強化訓(xùn)練運動結(jié)束后較運動前持續(xù)升高，可能是大強度運動使下丘腦區(qū)POMC基因表達增強。此結(jié)果表明：長期(共7周)大強度的跑臺運動(速度由15 m/min遞增至35 m/min，運動時間為20至25 min/d)的大鼠，末次運動結(jié)束后POMC基因表達在額葉皮層、海馬CA1下降(前者至運動結(jié)束后3 h仍未恢復(fù)，后者至運動結(jié)束后30 min即恢復(fù))，在下丘腦則其表達增強；表明該強度下應(yīng)激的大鼠POMC基因表達在不同腦區(qū)呈現(xiàn)“雙向”變化。*國家自然科學(xué)基金重點項目(No.3943

20、0140)作者單位：北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 (北京 100029)參考文獻1Przewlocki R.Opioid systems and stress.In:Albert Herz.ed.Opioids .Springer-Verlag,1993.294297.2陳家旭，楊維益，梁嶸，等.長時期大強度運動對大鼠血乳酸、-內(nèi)啡肽、強啡肽A1-13、亮氨酸腦啡肽影響的實驗研究.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，1997，14：371.3Civelli O,Birnberg N,Herbert E,et al.Detection and quantitation of proopiomelanocortin mRNA in pituitary and brain