金屬硫蛋白的研究進(jìn)展

1、金屬硫蛋白的研究進(jìn)展蔡震峰 任鳳蓮(中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 , 湖南長(zhǎng)沙 410083 摘 要 :金屬硫蛋白 (MT是一類(lèi)低分子量、高巰基含量 , 能大量結(jié)合重金屬離子的蛋白質(zhì) , 因其功能獨(dú)特 , 近年來(lái)對(duì) MT 各方面的研究日益受到重視。本文對(duì) MT 的性質(zhì)、分類(lèi)、 常用提取方法、分離純化方法、檢測(cè)方法以及功能作了逐一 綜述。重點(diǎn)闡述了 MT 的檢測(cè)方法 , 提出了有待研究解決的問(wèn) 題 , 展望了其應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞 :金屬硫蛋白 ; 提取 ; 分離純化 ; 檢測(cè)中圖分類(lèi)號(hào) :Q 51 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 :A 文章編號(hào) : 1671 - 3206 (2007 02 - 0187 - 041957年,

2、美國(guó)科學(xué)家 Margoshoes 和 Vallee1在研究 金屬生物學(xué)作用時(shí),從動(dòng)物器官中分離出一種新的蛋白質(zhì)。 由于它是一種低分子量、高巰基含量,能大量結(jié)合重金屬離 子,因此將該物質(zhì)稱(chēng)為金屬硫蛋白(metallothionein ,簡(jiǎn) 稱(chēng) MT 。根據(jù)現(xiàn)有研究, MT 主要分為 MT-、 MT-、 MT- 和 MT-。 MT 分子呈橢圓形, 分兩個(gè)結(jié)構(gòu)域, 分子量為 6000 7000道爾頓,直徑 3050A ,含有 61個(gè)氨基酸,其中 21個(gè) 氨基酸為半胱氨酸,這樣每一個(gè) MT 分子就可以結(jié)合 712個(gè)金屬離子。人體、動(dòng)物、植物以及微生物體內(nèi)均含有 MT , 而且其理化特性基本一致, 具有

3、特殊的光吸收。 MT 構(gòu)象較堅(jiān)固,具有較強(qiáng)的耐熱性。對(duì)于金屬硫蛋白的研究,國(guó)內(nèi)外主要集中在提取、檢測(cè) 以及應(yīng)用上。由于在實(shí)際生產(chǎn)中,主要采用層析法,分離純 化后的金屬硫蛋白中還含有其它的雜蛋白,因此本文作者正 在進(jìn)行金屬硫蛋白的分子印跡聚合物的研究,使其更好地應(yīng) 用于金屬硫蛋白的純化。1 金屬硫蛋白的理化性質(zhì)一般來(lái)說(shuō), 哺乳動(dòng)物的 MT 分子量為 60007000道爾頓, 但去金屬后即硫蛋白分子量為 6000道爾頓左右,而真核微 生物的 MT 分子量范圍較大,為 200010000道爾頓,如從 粗糙脈孢菌中分離出來(lái)的 MT 分子量為 2500道爾頓左右,酵 母菌中分離得到的 MT 分子量為 8

4、00010000道爾頓。高等 植物的 MT 的分子量為 1000013800道爾頓。 MT 的等電點(diǎn) pI 一般在 4左右, 如哺乳動(dòng)物 MT 的等電點(diǎn)在 3.94.6之間, 已發(fā)現(xiàn)的水生生物 MT 的等電點(diǎn)在 3.56.0之間。使各種金 屬硫蛋白中 50%的金屬離子發(fā)生解離的 pH 分別為 Zn-MT 3.54.5,Cd-MT 2.53.5,Cu-MT pH 1.0,但對(duì)植物中的 MT 來(lái)說(shuō),相應(yīng)的 pH 要偏高些。 MT 的存在形式及穩(wěn)定性與它 所結(jié)合金屬的種類(lèi),是否結(jié)合了金屬及環(huán)境的 pH 密切相關(guān)。 同樣, MT 的光吸收特征除了與它的氨基酸組成有關(guān)外, 也與 它所結(jié)合的金屬種類(lèi)密切相

5、關(guān) 2。2 金屬硫蛋白的分類(lèi)及分布MT 的結(jié)構(gòu)在生物進(jìn)化中高度保守,有四種異構(gòu)體, MT-和 MT-在大多數(shù)哺乳動(dòng)物的內(nèi)臟器官中廣泛存在,尤以 肝、腎細(xì)胞為主,而且參加其功能調(diào)節(jié)。 MT-分布主要限 于中樞神經(jīng)系統(tǒng),主要分布于星性膠質(zhì)細(xì)胞(集中于細(xì)胞體 和突起中 ,其次為神經(jīng)元細(xì)胞,也有報(bào)道稱(chēng)少量分布于生 殖細(xì)胞、小腸、胃、腎和嗅覺(jué)皮質(zhì)細(xì)胞中。 MT-主要分布 于皮膚、舌、消化道等器官的角質(zhì)細(xì)胞和復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞 中。3 金屬硫蛋白的提取方法3.1主要試劑三羥甲基氨基甲烷(簡(jiǎn)稱(chēng) Tris ; 5, 5-二硫二(2-硝基苯甲 酸 (簡(jiǎn)稱(chēng) DTNB ; PBS 緩沖溶液。3.2 動(dòng)物的處理參考 O

6、nsaka 等的方法 3,給家兔皮下注射 ZnSO44次, 第 1天注射 60mg/只 (約 15mg Zn/kg , 第 2、 4天注射 90mg/只,第 7天注射 120mg/只,第 8天處死動(dòng)物取其內(nèi)臟。 3.3 MT粗制品的制備1稱(chēng)重:將前一夜放 -4冰箱中解凍的試樣拿出來(lái)用 托盤(pán)天平稱(chēng)重,試樣重量 M ,精確到 0.1g ;2 攪碎:將試樣用剪刀剪成碎片后, 用搗碎機(jī)搗約 30 50s ,搗成勻漿;3 提 取 :加 入 相 當(dāng) 于 試 樣 重 量 兩 倍 體 積 的0.02MTris-HCl ,用磁力攪拌器攪約半分鐘;4變性:加入等體積氯仿:乙醇(0.08:1變性除雜 蛋白,攪拌約

7、5分鐘;5離心:5000rmp 、 4離心 25min ,棄沉淀,取上清;6熱變性:75熱變性 35min 除雜蛋白;7過(guò)濾:用冰塊速冷后用 8層紗布過(guò)濾,取清液,靜 置約 2h ;8離心:8000rmp 、 4離心 25min ,棄沉淀,取上清, 得到勻漿液。9層析、凍干:對(duì)勻漿液進(jìn)行層析,然后收集富含 MT 的層析液進(jìn)行凍干即得 MT 粗品。4 金屬硫蛋白的純化方法所謂純化, 也就是 MT 粗品 (60%90% 、 MT 精品 ( 90% 以及純品( 95%的形成過(guò)程。由報(bào)道的資料看,純化方 法大概是一致的,首先是根據(jù) MT-1和 MT-2所帶電荷不同的 性質(zhì) 4,進(jìn)行離子交換將 MT-1

8、和 MT-2分開(kāi),然后將收集 MT-1和 MT-2的層析液分別進(jìn)行脫鹽, 最后收集凍干、 保存。 取勻漿液直接上 Sephadex G-50柱 (4.5×100cm 進(jìn)行分離, 以 0.01mol/L Tris-HCl, pH8.6緩沖液洗脫。收集含 MT 組 分層析液,再上預(yù)先用 0.01mol/L Tris-HCl, pH8.6緩沖液 平衡好的 DEAE-Sepharose Fast Flow(3×70cm 柱進(jìn)行離 子交換層析,以 Tris 緩沖液進(jìn)行直線(xiàn)梯度洗脫(A 液:0.01mol/L Tris-HCl , pH8.6; B液:0.25mol/L Tris-HC

9、l , pH8.6 。分別收集含 MT-1和 MT-2組分,冷凍干燥濃縮成體 積 1520mL ,再分別上預(yù)先用 0.01mol/L碳酸銨平衡好的 Sephadex G-25柱(1.6×120cm 進(jìn)行脫鹽。所得 MT-1和 MT-2冷凍干燥后保存于 -20冰箱中 5。雖然文獻(xiàn)中講到許多分離純化方法,但是多為實(shí)驗(yàn)室研 究,真正運(yùn)用到實(shí)際生產(chǎn)的并不多,這主要與實(shí)際生產(chǎn)中的 各種環(huán)境因素的影響有關(guān)。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)后家兔肝臟 中 MT 的含量愈高,實(shí)際生產(chǎn)中 MT 的提取率就愈大,相反, MT 的提取率就愈低。5 金屬硫蛋白的檢測(cè)方法隨著對(duì) MT 研究的進(jìn)一步深入,建立的 MT 檢測(cè)方

10、法較多,但 所有這些方法都是建立在 MT 的理化特性和生物特性以及免 疫學(xué)特性基礎(chǔ)上,主要分以下幾大類(lèi)。5.1 金屬親和分析法這類(lèi)方法主要是基于 MT 對(duì)金屬的高親合力且不同金屬的親 和力具有差異性及其熱穩(wěn)定性而建立的。主要通過(guò)測(cè)定 MT 結(jié)合金屬競(jìng)爭(zhēng)性替換金屬含量來(lái)檢測(cè) MT 中金屬含量的增 高,從而計(jì)算出 MT 的含量。張保林等 6運(yùn)用銀飽和分析法 結(jié)合原子吸收光譜(AAS 檢測(cè)了兔肝 Zn-MT ,具體方法為:向含 MT 的溶液中加入過(guò)量的 Ag+, 待反應(yīng)完全后, 再逐次加 入血紅蛋白,以結(jié)合剩余的 Ag+,加熱使血紅蛋白沉淀,與MT 結(jié)合的 Ag+則完全存在于上清液中, 通過(guò) AAS

11、 測(cè)定其中 Ag+含量,便可計(jì)算出 MT 的濃度,該方法與其它方法比較,不 需要去除樣品中共存的其它蛋白質(zhì)和含 -SH 基劑,可直接計(jì) 算出 MT 含量,且不需要特殊的儀器設(shè)備,操作簡(jiǎn)便,具有 很高的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。金屬親合分析的缺陷在于,采用的 金屬除與 MT 結(jié)合外,還與其它一些小分子量化合物結(jié)合, 由于利用金屬含量間接推算 MT 含量,因此特異性較差 7。 5.2 電化學(xué)法此方法主要是利用巰基(-SH 在汞滴表面產(chǎn)生氧化還原出 現(xiàn)的電位變化建立的,以測(cè)定巰基來(lái)計(jì)算 MT 的含量,是一 種可以直接用于測(cè)定 MT 總量的方法,具有一定的特異性。 其檢測(cè)限可達(dá) ng/ml水平。運(yùn)用檢測(cè) MT

12、的電化學(xué)方法有:示差脈沖極譜法(DPP 8、 微分脈沖極譜法 9、示差脈沖陽(yáng)極溶出伏安法(DPASV 和 循環(huán)伏安法(CV 等。 Bordin 等通過(guò)改變檢測(cè)體系的 pH 值, 利用 DPP 可以很方便地檢測(cè)出樣品中多種形式的 MT , 同時(shí)能 快捷地分析出還原型的 MT 。5.3 色譜分析法對(duì) MT 中不同亞型的檢測(cè),色譜分析法較為適合,應(yīng)用的色 譜分析法主要有 HPLC 、 RP-HPLC 、 HPLC-ICP-MS 、 HPLC-AAS 等,利用這類(lèi)分析方法可以對(duì) Zn-MT 的性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析 10, 但此類(lèi)方法需要有標(biāo)準(zhǔn)的 MT 樣品進(jìn)行對(duì)照。 Hunziker等 11使用 RP-H

13、PLC 從兔組織樣品中可以分離出 7種亞型, 通過(guò) AAS 來(lái)檢測(cè)樣品中的金屬含量,可以對(duì) MT 進(jìn)行定量測(cè) 定。 Jin 等 12利用 HPLC 分離 MT ,然后根據(jù)樣品對(duì) 250nm 紫外吸收特征來(lái)直接對(duì) MT 定量,該方法的靈敏度小于 1g/mL。 由于常見(jiàn)的兩種 MT 所帶的電荷不同 , 與其它方法相比, 利用毛細(xì)管電泳法可以更好地分離純化 MT-和 MT- 13。 5.4 蛋白質(zhì)分析法 /免疫法此類(lèi)方法主要是通過(guò)蛋白質(zhì)含量測(cè)定來(lái)計(jì)算 MT 濃度,免疫 法是最主要的方法。它尤其適合于微量檢測(cè),具有靈敏、特 異的特點(diǎn), 靈敏度在 pg/ml級(jí), 對(duì)存在體液中含量甚微的 MT 具有較好的

14、檢測(cè)效果。在近些年,先后建立了 Western Blotting 法、放射性免疫檢測(cè)法(RIA 和酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA 。RIA 法首先由 Mallie 等在 1979年檢測(cè)大鼠血清中 MT 的 含量時(shí)建立的,隨后 Mulder 等建立了測(cè)定人體液中 MT 含量 的 RIA , Zahir Shaidh A等報(bào)道了用 RIA 檢測(cè)鎘污染地區(qū)人 群的尿液 MT 含量 14。 此方法的檢測(cè)范圍在 0.1100ng/ml之間, 但是此方法要用放射性同位素, 需要 3天左右的時(shí)間, 給檢測(cè)帶來(lái)不便。1986年 Thomas 等建立了 ELISA 法,與 RIA 法無(wú)顯著差 異,靈敏度可達(dá) 10

15、0pg/ml,與 RIA 相比具有測(cè)定相對(duì)迅速, 且不需昂貴的儀器設(shè)備和接觸放射性同位素。 Akintola 等在1995年利用 MT-1制備抗體建立了 ELISA 測(cè)定人血漿和尿液 中的 MT 含量,檢測(cè)限可達(dá) 5ng/ml。鄭軍恒等 15在檢測(cè)人 血液中的 MT 過(guò)程中建立了 2種 ELISA 方法,直接型 ELISA 的檢測(cè)范圍為 110ng , 可用于檢測(cè)較純樣品, 競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA 較好的檢測(cè)范圍是 50500ng , 用于檢測(cè)較粗的樣品中 MT 的 含量。5.5 光譜法采用液相色譜(LC 和紫外(UV 相結(jié)合檢測(cè)確定家兔 肝臟中分離脫金屬硫蛋白的最佳條件, 同時(shí), 利用 LC-E

16、S-MS 可以確定家兔肝臟中不同結(jié)構(gòu)的脫金屬硫蛋白,主要對(duì) MT-和 MT-的結(jié)構(gòu)及其同分異構(gòu)體進(jìn)行了研究 16。由于目前金屬硫蛋白的測(cè)定主要采用紫外 -可見(jiàn)分光光度法 以及原子吸收光譜法測(cè)定其中的金屬離子。前一種方法靈敏 度較低,由于檢測(cè)取樣少,檢測(cè)過(guò)程中造成的誤差較大,后 一種方法卻因?yàn)榉蛛x純化過(guò)程中可能有部分金屬脫離蛋白 造成損失引起誤差,且測(cè)定費(fèi)用昂貴 17。針對(duì)這種情況, 建立了鎘金屬硫蛋白的非原子化測(cè)定方法,檢出限與石墨爐 法(GFAAS 相近 18。5.6 MT克隆及 MT-mRNA 檢測(cè)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展, 使 MT 克隆技術(shù)、 RNA 印跡 技術(shù)和 PCR 技術(shù)應(yīng)用

17、于 MT 的定量檢測(cè)成為現(xiàn)實(shí)。 MT 克隆檢 測(cè)是通過(guò) MT 多克隆和單克隆抗體,運(yùn)用免疫擴(kuò)散、免疫電泳等方法來(lái)檢測(cè)組織中的 MT-mRNA 含量進(jìn)行定量分析,這在 MT 分子的生物學(xué)研究中有很重要的意義。MT 多采用聯(lián)機(jī)檢測(cè), 雖然以免疫法最為可靠, 但是檢測(cè)過(guò)程 復(fù)雜,時(shí)間消耗大,聯(lián)機(jī)檢測(cè)大大節(jié)省了時(shí)間,同時(shí)可以減 少檢測(cè)過(guò)程中產(chǎn)生的誤差。 MT 在逐步產(chǎn)業(yè)化, 然而目前還缺 乏一種簡(jiǎn)便、 靈敏、 快捷適宜產(chǎn)業(yè)化的分離純化和檢測(cè)技術(shù), 這也成為 MT 研究的熱點(diǎn)。6 MT的功能對(duì)于 MT 的功能, Vallee19從基因調(diào)節(jié)、大腦的神經(jīng) 元生長(zhǎng)抑制以及與谷胱甘肽的相互作用三方面做了詳細(xì)介

18、紹。隨著對(duì) MT 的不斷深入研究,報(bào)道出的功能也開(kāi)始多面 化,國(guó)內(nèi)關(guān)于 MT 功能方面的綜述報(bào)道很多 2, 20,其主要 作用有:清除體內(nèi)自由基、防止機(jī)體衰老;解除重金屬的毒 性;參與體內(nèi)微量元素的代謝;增強(qiáng)機(jī)體對(duì)各種不良狀態(tài)的 適應(yīng)能力;鋅元素的貯存庫(kù);防止細(xì)胞癌變等。7 結(jié)語(yǔ)金屬硫蛋白的研究已經(jīng)近半個(gè)世紀(jì),對(duì) MT 的結(jié)構(gòu)和生理學(xué) 功能研究取得了許多成就,而且對(duì)于 MT 與一些疾病的關(guān)系 研究也取得了許多重要成果。但是仍有一些問(wèn)題需要進(jìn)一步 的探討和研究。譬如 MT 在分離純化時(shí),需要進(jìn)一步改進(jìn)工 藝,提高提取率,更適合工業(yè)化生產(chǎn);尚沒(méi)有一個(gè) MT 的標(biāo) 準(zhǔn)檢測(cè)方法; MT 在體內(nèi)的代謝途

19、徑仍未探明 ; MT在體內(nèi)濃度的影響因素以及在疾病方面發(fā)生的機(jī)理還需要進(jìn)一步研 究; MT 的基因結(jié)構(gòu)及調(diào)控還有待深入研究?？傊? MT 具有很大的開(kāi)發(fā)潛力和無(wú)法估量的應(yīng)用價(jià)值, 隨著 人們對(duì) MT 研究的不斷深入,對(duì) MT 作用機(jī)理的不斷探明, MT 的應(yīng)用也將越來(lái)越廣泛。參考文獻(xiàn)1Margoshoes M and Vallee BL. A cadmium protein from equine kidney cortexJ.Am Chem Soc 1957,79:4813-4814. 2劉安玲,朱必鳳 . 金屬硫蛋白的研究進(jìn)展 J.韶關(guān)學(xué)院學(xué) 報(bào)(自然科學(xué)版 , 2001, 22(3 :8

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