心肌ｅＮＯＳ表達(dá)和ＮＯ的改變對(duì)糖尿病大鼠缺血再灌注損傷的影響

1、心肌表達(dá)和的改變對(duì)糖尿病大鼠缺血再灌注損傷的影響【摘要】 測(cè)定不同周期鏈脲佐菌素（）誘導(dǎo)糖尿病大鼠心肌表達(dá)、變化及其對(duì)缺血再灌注（）損傷的影響。 【方法】 阻斷和開(kāi)放左冠狀動(dòng)脈前降支建立大鼠急性心肌 模型，用 染色，測(cè)定大鼠心肌 后梗死面積；免疫印跡分析測(cè)定心肌表達(dá)；形態(tài)測(cè)定（）法測(cè)定硝基酪氨酸（，）的水平；用硝酸還原酶法測(cè)定含量。【結(jié)果】 在 處理后周，糖尿病組（）心肌梗死面積比相應(yīng)周期對(duì)照組（）明顯縮小，處理后周（），梗死面積比相應(yīng)對(duì)照組（）增加；內(nèi)皮一氧化氮合酶（）在心肌的表達(dá)在 比 組增加，然而在 比 明顯減少；超氧亞硝酸根離子（，-）生成的標(biāo)志性產(chǎn)物硝基酪氨酸（ ，） 在 組中較 組

2、低約，但在 組中較 組顯著增加；血一氧化氮（ ，）水平 組中較 組增高， 但是 組較 組顯著減少?！窘Y(jié)論】 誘導(dǎo)糖尿病早期、晚期對(duì)心肌 損傷呈現(xiàn)相反的作用。這可能是由于早、晚期糖尿病相反的心肌 表達(dá)及 改變而引起的。 【關(guān)鍵詞】 糖尿病 心肌 缺血 再灌注 內(nèi)皮一氧化氮合酶 一氧化氮 硝基酪氨酸 ： 【】 - （） - （） 【】 （） - （）； ； ； 【】 ， （） - （）； （）， ； ， ； - 【】 - - ， ： ； ； ； ； ； 鏈脲佐菌素（，） 誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物模型在心肌缺血再灌注（，）損傷的實(shí)驗(yàn)研究呈現(xiàn)出矛盾的結(jié)果，包括減輕或增加心肌 損傷。引人注意的是 實(shí)驗(yàn)時(shí)的心肌保

3、護(hù)作用，類似于缺血預(yù)適應(yīng)（，）反應(yīng)，其保護(hù)機(jī)理仍未完全明了。研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮（，）是血管內(nèi)皮細(xì)胞生存和心肌保護(hù)因子，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，攝入 供體可減輕 損傷。由內(nèi)皮一氧化氮合酶（ ，）催化-精氨酸（-，-）合成。缺血再灌注時(shí)，超氧陰離子（，）快速形成，并與反應(yīng)形成超氧亞硝酸根離子（，），能硝基化酪胺酸蛋白質(zhì)殘基產(chǎn)生硝基酪胺酸（，），具細(xì)胞毒性，可致細(xì)胞死亡。目前，誘導(dǎo)糖尿病時(shí)、 和新陳代謝的改變及其對(duì)心肌 損傷影響尚未完全明了。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同時(shí)期 誘導(dǎo)糖尿病心肌 表達(dá)、水平、血漿 水平及其對(duì) 損傷的影響，以期對(duì)部分機(jī)制作進(jìn)一步探索。 材料和方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性 - 大鼠（美國(guó)

4、公司）平均體質(zhì)量約 隨機(jī)分為組：周和周的 處理組（和）；周和周的（和）組，及時(shí)間相對(duì)應(yīng)的對(duì)照組（， 和 ）；周組只大鼠，周組只大鼠。糖尿病是通過(guò)尾靜脈注射含 （美國(guó)公司，）的檸檬酸緩沖液（ ， ）誘導(dǎo)而成。對(duì)照組單獨(dú)注射等量檸檬酸緩沖液。 注射后 及 實(shí)驗(yàn)前收集尿樣、血樣測(cè)試尿糖和血糖。血糖超過(guò)，尿糖陽(yáng)性者，歸為糖尿病組。為避免酮癥酸中毒，糖尿病組處理后一周大鼠開(kāi)始皮下注射胰島素。該劑量胰島素僅為預(yù)防酮癥酸中毒， 注射胰島素后糖尿病組血糖仍保持在 以上。 急性心肌局部缺血和再灌注的模型 （ ） 和 （ ）混合腹腔注射麻醉。右頸靜脈插管補(bǔ)充體液，左頸動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)血壓和心率。氣管插管與犬齒動(dòng)物呼吸

5、機(jī)相連。體溫用電熱墊維持在 。待心率和血壓穩(wěn)定后，施左胸切開(kāi)術(shù)。暴露左冠狀動(dòng)脈左前降支（ ，），用絲線（-）縫合形成活的閉環(huán)。用止血鉗子夾緊閉環(huán)造成左心室局部缺血，心肌缺血的標(biāo)志是心包膜表面蒼白且血壓下降。松開(kāi)止血鉗再灌注。再灌注時(shí)血壓略微上升。實(shí)驗(yàn)均為缺血 再灌注 心肌梗死面積大小的確定 左心室（ ，）大小，梗死面積大?。?，），缺血區(qū)域（ ，）均如先前文獻(xiàn)描述方法測(cè)定。簡(jiǎn)言之，在 再灌注后， 再次被封閉。用埃文斯藍(lán)顏料（）注入 腔， 為非藍(lán)染色，藍(lán)染者為正常灌注區(qū)。摘除心臟，沖洗多余的藍(lán)顏料，將左心室橫切為 厚切片。切片在 ，-三苯基氯化四氮唑（， ， - ，） 緩沖液染色，梗死區(qū)為非 染

6、色，磚紅色染色區(qū)為可逆活性組織。每層切片的上下兩面均拍攝照片，使用 圖像軟件分析照片不同區(qū)域面積大小。每層切片兩邊的區(qū)域平均計(jì)算。表示為總 的百分比， 表示為 的百分比。 純化及免疫印跡分析 心臟左心室組織缺血區(qū)與其它部分分離，使用含 ， ， （美國(guó) 公司）的 緩沖液冰上勻漿后以 ， 離心 。上清液貯于 冰箱待測(cè)?？偟鞍踪|(zhì)濃度測(cè)定使用 - 蛋白測(cè)定包，根據(jù)說(shuō)明書(shū)測(cè)定。的純化依照等的方法進(jìn)行，使用，- （美國(guó) 公司）先純化，后加樣于聚丙烯酰胺膠體中，用電泳動(dòng)方法將蛋白樣品分離，并被轉(zhuǎn)移在硝化纖維薄膜上。薄膜用低脂牛奶封閉過(guò)夜。然后使用抗 抗體（美國(guó) 公司）標(biāo)記。特定抗體被對(duì) 線敏感的化學(xué)發(fā)光物（

7、 ，美國(guó) 公司）標(biāo)記，并曝光于 線片上。 分析硝基酪氨酸 用免疫組化方法（）分析硝基酪氨酸。的生成通過(guò)對(duì)其標(biāo)志性產(chǎn)物的測(cè)定來(lái)代表。實(shí)驗(yàn)?zāi)┬呐K左心室組織缺血區(qū)與其它部分分離并植入液，用液氮冷凍至 ，橫切為 厚切片。使用抗大鼠抗體 （ ）標(biāo)記心肌內(nèi)。使用 圖像軟件分析系統(tǒng)分析水平。 含量檢測(cè) 用硝酸還原酶法測(cè)定含量。我們用反應(yīng)，通過(guò)對(duì)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物硝酸鹽（）和亞硝酸鹽（）水平總和的測(cè)定來(lái)反映血漿水平。實(shí)驗(yàn)?zāi)念i靜脈收集血液，冰上冷卻 ，然后以 ， 離心 ，上清液貯于 冰箱待測(cè)。用硝酸還原酶將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，按操作規(guī)程測(cè)定其。制備亞硝酸鈉和硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，作出亞硝酸鈉和硝酸鈉濃度 值標(biāo)準(zhǔn)曲線。

8、并計(jì)算出和 總量。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，用 統(tǒng)計(jì)軟件 影響因素分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn) 。 結(jié) 果 血糖水平 在周和周糖尿病組中，血糖水平分別是 （ ） 和 （ ），相對(duì)應(yīng)對(duì)照組 和 血糖水平分別是（ ） 和 （ ）。糖尿病組血糖顯著升高（糖尿病組血糖 相應(yīng)時(shí)間對(duì)照組； ， ）。 平均動(dòng)脈壓改變 表總結(jié)了糖尿病組和對(duì)照組平均動(dòng)脈血壓（）在缺血前、缺血期和再灌注期間的數(shù)值。在 鼠中，在缺血前、缺血期、再灌注期 均較對(duì)照組降低。在 中，在缺血前、缺血期和再灌注期 數(shù)值與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。在 和 組的再灌注期， 均較缺血前期降低。 梗死面積大小和缺血區(qū)面積大小 缺血和再灌注后，在 組，梗死

9、面積比對(duì)照組 減少（分別為 ， ），在 組中，梗死面積比對(duì)照組 組增加 （分別為 ， ），糖尿病組與相應(yīng)時(shí)間對(duì)照組有顯著性差異， 。缺血危險(xiǎn)區(qū)域面積（）大小在 ， ， 無(wú)組間差異。 心肌表達(dá) 免疫印跡分析顯示在 組中與 大鼠相比提高大約 （圖）。此外，表達(dá)在 組中與 大鼠相比減少大約。 含量檢測(cè) 用硝酸還原酶法測(cè)定 含量。在 組中 水平在基線和缺血再灌注后與對(duì)照組比較分別升高和。然而，在 組血中 水平在基線和缺血再灌注后與對(duì)照組比較分別降低和（圖）。 硝基酪氨酸測(cè)定 免疫組織化學(xué)染色顯示缺血前在 組較 組低（圖），在缺血再灌注后， 水平無(wú)顯著差異。在 組，缺血前及缺血再灌注后 水平分別較 大鼠

10、升高和。 討 論 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示糖尿病周時(shí)，大鼠心臟在 后梗死面積比對(duì)照組減少，糖尿病周時(shí)，梗死面積比對(duì)照組增加。這表明糖尿病早期對(duì)心臟 損傷確有保護(hù)作用。 然而，至糖尿病周時(shí)這種保護(hù)作用不但消失，而且加重 的損傷。 多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，缺血再灌注損傷是氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化、鈣超載、無(wú)復(fù)流等因素的病理生理過(guò)程。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮損傷和功能異常是引起缺血再灌注損傷的又一重要原因，內(nèi)皮源性舒張因子即釋放減少是導(dǎo)致缺血再灌注損傷的重要因素。是小分子氣體， 可在許多細(xì)胞與組織合成。合成的前體為精氨酸， 在催化下合成。心肌細(xì)胞本身含有，可自身合成。具有擴(kuò)張冠脈、改善心臟血液供應(yīng)、縮小心肌梗塞范圍等作

11、用。 研究顯示在糖尿病心臟中的表達(dá)呈現(xiàn)矛盾的改變，包括增加，減少，無(wú)改變。本研究結(jié)果在心臟的表達(dá)與對(duì)照組相比在糖尿病周時(shí)短暫升高，但是在周時(shí)卻顯著減少。這提示在糖尿病時(shí)的變化是一個(gè)隨病程改變的過(guò)程，即早期代償性合成增加而晚期則合成減少。相應(yīng)的， 本研究中 組中血漿 水平在缺血前和再灌注期與對(duì)照組比較分別升高和。然而，在 組血漿 水平在缺血前和再灌注期與對(duì)照組比較分別降低和這提示在糖尿病時(shí)的變化也是一個(gè)隨病程改變的過(guò)程，即早期代償性合成增加而晚期則減少。由于 是血管舒張因子，早期水平的升高可解釋為什么糖尿病大鼠周時(shí)血壓比對(duì)照組低。糖尿病早期高濃度 除舒張血管和增加血流外，也是內(nèi)皮細(xì)胞生存和心臟的

12、保護(hù)因子，可抑制細(xì)胞凋亡。本研究顯示，無(wú)論糖尿病組或?qū)φ战M，缺血后含量明顯增加，可能系血流阻滯后蓄積所致。 有學(xué)者發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的能力下降。也有學(xué)者認(rèn)為糖尿病動(dòng)物或糖尿病患者的血管內(nèi)皮合成并不減少，在某一階段甚至反而增加，而糖尿病時(shí)生成的某些物質(zhì)對(duì)的滅活，則是依賴的血管舒張障礙的主要原因。缺血再灌注時(shí)，在冠狀動(dòng)脈血流復(fù)通的開(kāi)始幾分鐘，（快速形成，并與反應(yīng)形成，是導(dǎo)致再灌注損傷的主要物質(zhì)。，高活性氧化劑，能硝基化酪胺酸蛋白質(zhì)殘基產(chǎn)生硝基酪胺酸。硝基酪胺酸具細(xì)胞毒性，可致細(xì)胞死亡。本研究中的形成藉由硝基酪胺酸水平的測(cè)定來(lái)評(píng)估。 糖尿病時(shí)體內(nèi)氧自由基生成增多，氧自由基極易與反應(yīng)，如

13、超氧陰離子（）即可與生成過(guò)硝酶根離子（），從而使失活。研究表明糖尿病動(dòng)物的血管內(nèi)皮確實(shí)生成更多的，從而使失活增加。有報(bào)告認(rèn)為自由基清除酶（， ）如在糖尿病早期增加從而減少超氧化物的含量， 從而使失活減少，形成數(shù)量下降，有利于心肌細(xì)胞的存活。但在糖尿病慢性期時(shí)超氧化物（如）的含量升高，與 反應(yīng)形成，從而使失活增加，導(dǎo)致血管舒張障礙， 抗缺血再灌注能力下降，水平顯著升高，促使心肌細(xì)胞死亡。這與本研究結(jié)果相符合，即含量在糖尿病早期比對(duì)照組低， 而在晚期比對(duì)照組高。 綜上所述， 誘導(dǎo)糖尿病早期、晚期對(duì)心肌 損傷呈現(xiàn)相反的作用。這可能是由于早、晚期糖尿病相反的心肌 表達(dá)，相應(yīng)引起早晚期矛盾的及改變而引起的。 在心肌的表達(dá)在糖尿病早期增加， 然而在慢性期減少；心肌保護(hù)因子 血漿水平在糖尿病早期升高，但是在慢性期顯著降低；具細(xì)胞毒性物質(zhì)生成的標(biāo)志性產(chǎn)物硝基酪氨酸在糖尿病早期生成減少，但在慢性期顯著增加。這說(shuō)明在糖尿病的不同階段、對(duì)心肌 損傷占主導(dǎo)地位的機(jī)制可能都有不同。 【參考文獻(xiàn)】 馬國(guó)川，夏 焱，羅向陽(yáng)，等糖尿病大鼠生存信號(hào)改變對(duì)對(duì)缺血再灌注損傷及心肌細(xì)