痙痿證方對(duì)大鼠脊髓持續(xù)性壓迫損傷局部n gfbdn f 的調(diào)節(jié)作用

1、論著痙 、 痿證方對(duì)大鼠脊髓持續(xù)性壓迫 損傷局部 N GF 、 BDN F 的調(diào)節(jié)作用胡志俊王擁軍李晨光施杞(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院上海 200032摘要 目的 :研究大鼠脊髓持續(xù)性壓迫后 N GF 、 BDN F 含量及 N GF 、 BDN F 原位基因表達(dá)變化 , 探討痙 、 痿證方對(duì)大鼠脊髓持續(xù)性慢性損傷 N GF 、 BDN F 的影響 。 方法 :采用大鼠頸椎前路螺釘壓迫頸脊髓 , 螺釘持續(xù) 留置壓迫 30天以產(chǎn)生慢性損傷 , 蛋白含量用免疫組化 EnV isi on 法 , 基因表達(dá)用原位雜交法 。 結(jié)果 :(1 免疫組 化 :統(tǒng)計(jì)結(jié)果 N GF 、 BDN F 結(jié)果相近 :

2、輕壓模型組與假手術(shù)組比較 , 具有顯著性差異 , P <0. 05; 析因設(shè)計(jì) :試 驗(yàn)壓迫與藥物 2因素間無交互作用 ; 藥物因素有統(tǒng)計(jì)意義 ; 不同藥物因素之間 (含模型組 有非常顯著性差 異 , P <0. 01。 (2 原位雜交 :假手術(shù)組少見陽性染色的細(xì)胞 , 而模型組和用藥組可見明顯陽性染色的細(xì)胞 , N GF 和 BDN F 的陽性細(xì)胞特征大致相近 。 結(jié)論 :藥物干預(yù)能促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌 , 脊髓神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì) 細(xì)胞參與了 N GF 和 BDN F 的分泌 。關(guān)鍵詞 脊髓損傷 N GF BDN F 痙證方痿證方大鼠中圖分類號(hào) :Q 786文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 :A 文章編

3、號(hào) :1005-0205(2005 03-0010-03Regula tion of J i ngZheng and W e iZheng Rec ipe on NGF andB D NF a t L oca l Con ti nua tive Co m pression I n jury i n Ra t Sp i na l CordH u Zh ijun , W ang Yongjun , L i Chenguang , et alT he Institu te Of S p ine Of S hang ha i T CM un iversity , S hang ha i 200032A

4、BSTRACT Objective :To study the alterative con ten t of N GF , BDN F and the alterative exp ressi on of their in situ genes in rat sp inal co rd after con tinuative comp ressi on in ju ry . To found ou t the effect of J ingZheng and W eiZheng reci pe on N GF , BDN F at local ch ron ic sp inal co rd

5、in ju ry in rat . M ethods :Screw w as u sed to dill in 2 to sp inal co rd th rough an teri o r verteb ral body , after operati on the screw w as rem ained fo r a mon th , and then u sed the m ethod of i m m unoh istochem istry EnV isi on to check the p ro tein con ten t and the m ethod of in situ h

6、yb ridizati on to check the exp ressi on of genes . Result :(1 i m m unoh istochem istry :T he statistics show s the resu lts of N GF are si m ilar to the BDN Fs :Compared Sham -operated group w ith m ild comp ressed group , it w as sign ifican t differen t P <0. 05; Facto rial analysis : T here

7、is no in teracti on betw een the tw o facto rs ex 2 peri m en tal comp ressi on and m edicine . T he m edicine facto r have statistics sign ificance ; T here are sign ifican t differences betw een differen t m edicine facto rs (include model group P <0. 01. (2 in situ hyb ridizati on :L it 2 tle

8、po sitive stain ing cells w as seen in Sham -operated group , bu t it can be obvi ou sly seen in model and m edi 2 cati on group s . T he featu res of po sitive cells of N GF and BDN F are rough ly si m ilar . Conclusion :T he m edical in terven ti on has the effect of increase neu ro troph ic facto

9、 r secreti on . T he neu rocyte of sp inal co rd and glial cell take part in the secreti on of N GF and BDN F .KEY WOR D S Sp inal co rd ch ron ic in ju ry N GF BDN F J ingZheng reci pe W eiZheng reci pe R at 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子統(tǒng)稱神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族 (neu 2收稿日期 :2004-09-02基金項(xiàng)目 :上海市科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目 , 編號(hào) :024119026作者簡(jiǎn)介 :胡志俊 (1962- , 男

10、 (漢族 , 貴州人 ,副主任醫(yī)師 。 ro trop h in , N T s , 是指機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生的一類神經(jīng) 因子 , 它能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活 、 生長(zhǎng)和分化 , 阻 止成年神經(jīng)元損傷后的死亡 , 促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù) 、 軸突再生 , 調(diào)節(jié)突觸可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等神 經(jīng)系統(tǒng)功能 。 目前研究得較清楚的是神經(jīng)生長(zhǎng)因01子 N GF 和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 BDN F 1, 2。近幾 年研究報(bào)道調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)幫助神經(jīng)損傷的 修復(fù)有重要意義 。 本研究旨在探索中藥對(duì)脊髓慢 性損傷后神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的調(diào)節(jié)作用 。材料和方法1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選用清潔級(jí) SD 大鼠 90只 , 體重 375±2

11、5g , 雄性 。 隨機(jī)分為 10組 , 每組 9只 , 假手術(shù)組 、 輕壓模型組 、 中壓模型組 、 重壓模型 組 、 輕壓痙證方組 、 中壓痙證方組 、 重壓痙證方組 、 輕壓痿證方組 、 中壓痿證方組 、 重壓痿證方組 。 動(dòng) 物由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供 , 許可證 號(hào) :SCX (滬 2003-002。2模型制作及取材用平頭金屬螺絲釘壓迫造模 , 30天后取材 3。3藥物及用法痙證方由生黃芪 、 丹參 、 柴胡等 組成 , 痿證方由炙黃芪 、 黨參 、 鹿角等組成 。水煎 , 每貼藥濃縮為 30m l , 給藥量按成人用量的 1 60×大鼠體重×10, 每天

12、一次性灌胃給藥 , 約 2m l , 連續(xù)給藥 30d 。4檢測(cè)方法及主要試劑 (1 免疫組化 EnV i 2si on 法 :N GF 、 BDN F 兔抗鼠多克隆抗體 (SAN 2TA CRU Z 公司 U SA 。 EnV isi on 復(fù)合物 , 即用型 (D aKo 公司 丹麥 。 DAB (3. 3一二氨基聯(lián)本胺 固體 (D aKo 公 司 丹 麥 。 (2 原 位 雜 交 法 :N GF ISH D etecti on K it (武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn) 。 內(nèi)含胃蛋白酶 、 預(yù)雜交液 、 N GF 寡 核苷酸探針雜交液 、 封閉液 、 BC IP NB T 、 核固紅

13、等 。 N GF 寡 核 苷 酸 探 針 序 列 :5 GTCCA T 2GT T GT TCTA CA CTCT GA TCA CA GC - 3。 BDN F 寡核苷酸探針 , 由復(fù)旦大學(xué)分子遺傳研究所合成 。 探針的 PCR 引物序列為 :5 -CCA T 2TAA TCTCA GA GA CCCAA GA GCCG -3、 5-CAA CCGGT GA T GGCGGCT GGGGG -3。 5結(jié)果判斷用光鏡在×40、 ×100、 ×200、 ×400等不同倍數(shù)下整體瀏覽切片后 , 用 C M I A S -99B 型醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)采集圖象 ,

14、 ×200采集圖片 。 免疫組化細(xì)胞核因襯染呈紫藍(lán)色 , 棕黃色為 陽性染色 。 原位雜交信號(hào)呈紫藍(lán)色 , 背景呈紅色 。 6統(tǒng)計(jì)方法用 C M I A S -99B 型醫(yī)學(xué)圖象分析 系統(tǒng)將圖象轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù) , 選平均灰度值進(jìn)行比較 , 灰質(zhì)與白質(zhì)的數(shù)據(jù)相加作為一個(gè)樣本的數(shù)據(jù) 。 SPSS 11. 0統(tǒng)計(jì)軟件包分析數(shù)據(jù) , 數(shù)據(jù)以 x ±s 表 示 。 模型組與假手術(shù)之間 , 采用單因素方差分析 , 壓迫組之間和藥物因素之間采用析因設(shè)計(jì) 。 原位 雜交結(jié)果判斷采取在光學(xué)顯微鏡下閱片 , 結(jié)合主 觀認(rèn)識(shí)判斷陽性染色的目標(biāo)及強(qiáng)弱 。結(jié)果1免疫組化觀察神經(jīng)元陽性染色見于細(xì)胞漿或邊聚

15、于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè) , 膠質(zhì)細(xì)胞則分布在細(xì)胞核中 , 神經(jīng)纖維陽染均勻分布在整個(gè)纖維中 , 成片 狀 。 統(tǒng)計(jì)結(jié)果 N GF 、 BDN F 結(jié)果相近 :輕壓模型組 與假手術(shù)組比較 , 具有顯著性差異 , P <0. 05; 析 因設(shè)計(jì) :試驗(yàn)壓迫與藥物 2因素間無交互作用 ; 藥物因素有統(tǒng)計(jì)意義 ; 不同藥物因素之間 (含模 型組 有非常顯著性差異 , P <0. 01。 (見表 1、 表 2 表 1各組脊髓前角 N GF 表達(dá) (平均灰度值 420560. 00um 2 x±s 輕壓中壓重壓例數(shù) 含量 例數(shù) 含量 例數(shù) 含量 假手術(shù)組7222. 4±18. 5 2

16、22. 4±18. 5 222. 4±18. 5模 型 組 6191. 7±22. 337207. 7±25. 99206. 2±28. 1痙證方組 8185. 8±23. 19194. 2±17. 89192. 2±21. 3痿證方組7183. 0±4. 98176. 7±28.99180. 8±20.63模型組與假手術(shù)組相比 P <0. 05, 實(shí)驗(yàn)中部份樣品脫落 。表 2各組脊髓前角 BDN F 表達(dá) (平均灰度值 420560. 00um 2 x±s 輕壓中壓重

17、壓 例數(shù) 含量 例數(shù) 含量 例數(shù) 含量 假手術(shù)組 5209. 9±9. 2 209. 9±9. 2 209. 9±9. 2模 型 組 9196. 7±13. 838199. 5±6. 99205. 5±8. 9痙證方組 7196. 7±14. 39192. 2±12. 08199. 6±13. 4痿證方組7187. 8±8. 09190. 5±14. 58184. 4±17. 23模型組與假手術(shù)組相比 P <0. 05。實(shí)驗(yàn)中部份樣品脫落 。112原位雜交法原位雜交與免

18、疫組化相比 , 更靈 敏 , 它不僅具有分子雜交技術(shù)靈敏度更高的優(yōu)點(diǎn) , 而且還兼?zhèn)浣M織化學(xué)染色的可見性和定位性 , 從 而能夠特異性地顯示細(xì)胞 DNA 或 RNA , 從分子 水平去研究相關(guān)蛋白的產(chǎn)生部位及量 , 和免疫組 化相互映證 , 更有力的說明問題的本質(zhì) 。 實(shí)驗(yàn)結(jié) 果 , 在假手術(shù)組少見陽性染色的細(xì)胞 , 而模型組和 用藥組可見明顯陽性染色的細(xì)胞 , N GF 和 BDN F 的陽性細(xì)胞特征大致相近 。討論N T s 主要是由神經(jīng)元支配的外周靶細(xì)胞所 分泌 , 經(jīng)突觸后神經(jīng)元攝取 , 通過突觸前神經(jīng)元逆 行運(yùn)送至中樞神經(jīng)元胞體 , 與特異的神經(jīng)細(xì)胞受 體結(jié)合 , 激活細(xì)胞代謝 ,

19、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)而發(fā)揮作 用 4。 其次 , 中樞神經(jīng)細(xì)胞也能自分泌 N T s 5, 在 中樞神經(jīng)損傷時(shí)膠質(zhì)細(xì)胞也分泌 N T s 6。脊髓損 傷后對(duì) N T s 表達(dá)調(diào)節(jié)是雙向的 。 急性脊髓損傷 后 , 其含量在短期內(nèi)明顯增加 , 以減輕脊髓的損 害 7。 脊髓慢性損害后 , 分泌能力下降 , 含量明顯 降低 8, 9。 柏順明等 10報(bào)道在正常大鼠脊髓有 BDN Fm RNA 表達(dá) , 傷后 24h 、 5d 表達(dá)增高 , 14d 略有下降 , 回復(fù)近正常水平 , 而 2ld 又明顯回升 , 表明了脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞或膠質(zhì)細(xì)胞分泌 BD 2 N F 的能力經(jīng)歷了雙向變化 。對(duì) N T s

20、運(yùn)用的研究 有兩個(gè)途徑 , (1 調(diào)節(jié)內(nèi)源性 N T s 表達(dá)量 。 張海鴻 等 11采用基因?qū)胫委?, 將特定外源目的基因 BDN F 轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞內(nèi) , 結(jié)果顯示具有很好的效 果 。同時(shí)觀察了神經(jīng)根損傷后 A chE (乙酰膽堿降 解酶 和 A CP (乙酰膽堿 兩項(xiàng)指標(biāo) , 發(fā)現(xiàn)進(jìn)行 A xCA -BDN F (腺病毒 BDN F 載體 組轉(zhuǎn)基因治 療對(duì)脊髓神經(jīng)元有明顯的保護(hù)作用 。 (2 給予外源 性 N T s 。 有報(bào)道缺血前使用 BDN F 可防止缺血引 起的海馬神經(jīng)元死亡 12。 黃海霞等 13研究證實(shí) BDN F 、 N T -3對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)元有促進(jìn)生長(zhǎng)作 用 。 由于體

21、外 N T s 蛋白合成的成功 , 給外源性治 療帶來了廣闊的前景 。 但 N T s 不易進(jìn)入血腦屏 障 、 血清半衰期短 , 目前還是一個(gè)需要解節(jié)的問 題 。 傳統(tǒng)的方法需將這些大分子物質(zhì)反復(fù)輸注 , 但 仍難以到達(dá)病變神經(jīng)元部位并維持有效濃度 。 于 是學(xué)者們開始探索直接局部給藥 。王廷華等 15采 用神經(jīng)鞘內(nèi)法注射給藥能發(fā)揮明顯效應(yīng) 。 局部給 藥法確能顯示外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用 , 對(duì)脊 髓損傷報(bào)道的有硬脊膜下腔 16和蛛網(wǎng)膜下腔 17兩種途徑注射 , 特別是蛛網(wǎng)膜下腔鞘內(nèi)注射法 , 是 目前報(bào)道最多的 。 神經(jīng)生長(zhǎng)因子在國(guó)內(nèi)外均尚無 基因工程產(chǎn)品上市 。 目前 , 基因工程產(chǎn)品只

22、有美國(guó) 對(duì)外周神經(jīng)病正在進(jìn)行臨床試驗(yàn) , 國(guó)內(nèi)已有生物 提取物在應(yīng)用 , 中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 、 復(fù)旦大學(xué) 、 第二軍 醫(yī)大學(xué) 、 第四軍醫(yī)大學(xué)等與眾家大型藥業(yè)公司聯(lián) 合開發(fā)出或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的外源性制劑已有 好幾種 18。但這些方法及產(chǎn)品應(yīng)用于臨床還有許 多問題需要研究 。 中藥對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的調(diào)節(jié)作 用已有研究 , 陸華保等 19報(bào)道對(duì)切斷大鼠雙側(cè)隔 海馬穹隆傘模型給予中藥制劑 SSY -B 2干擾 , 結(jié) 果神經(jīng)元喪失明顯低于對(duì)照組 , N GF 的表達(dá)高于 對(duì)照組 。 中藥補(bǔ)陽還五湯提起物能夠促進(jìn)脊髓神 經(jīng)細(xì)胞的體外存活和突起生長(zhǎng) , 這種作用與其對(duì) 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的調(diào)節(jié)有關(guān) 20, 我們研

23、究中醫(yī)痙證 方 、 痿證方具有增強(qiáng) N GF 、 BDN F 在損傷脊髓的 表達(dá) , 實(shí)驗(yàn)顯示 :(1 損傷后及用藥后神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因 子分泌增加陽性染色除見于神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞 外 , 還大量見于灰 、 白質(zhì)的神經(jīng)纖維部分 , 說明其 增加的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子主要分布于神經(jīng)纖維內(nèi) , 也 證明了其主要來源是外周靶細(xì)胞 , 通過神經(jīng)纖維 逆向運(yùn)送到中樞 , 幫助神經(jīng)組織的修復(fù) , 中藥的作 用位點(diǎn)可能也是調(diào)節(jié)外周細(xì)胞分泌能力 。 (2 脊髓 神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞原位雜交陽染 , 說明它們參 與了 N GF 、 BDN F 的分泌 。 可見痙證方 、 痿證方具 有調(diào)整內(nèi)源性 N T s 的功效 , 進(jìn)一步研究

24、中藥作用 點(diǎn)位 , 搞清其中藥顯效的信號(hào)因子 , 單靶點(diǎn)的進(jìn)行 中藥藥效研究應(yīng)該是今后研究的重點(diǎn) 。參考文獻(xiàn)1 T akahash i JB , Ho sh i m aru M , K ikuch i h , et al . D evelopm en 2 tal exp ressi on of trkB and low -affinity N GF recep to r in the rat retina . N euro sci L ett ; 1993, 151(2 :174177 2 Pattreson SL , A belt T , D euel TA S , et al . R ec

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27、; 選擇性封閉 :硬膜外封閉 , 神經(jīng)根內(nèi)側(cè)支封閉術(shù)等 , 背側(cè)神經(jīng)根切斷術(shù) ; 椎間盤內(nèi)電 熱療法等 。 對(duì)患者的教育是完整的治療過程中的一部分 。 教會(huì)患者自我防護(hù)的方法是治療下腰痛最有效的方法之 一 13。參考文獻(xiàn)1 Pauza KJ , How ell S , D reyfyss , Peloza JH , D aw son K , Bog 2 duk N . A random ized , p lacebo -contro lled trial of intradis 2 cal electro therm al therapy fo r the treatm ent of disc

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