黃芪注射液對培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞再灌注損傷的保護(hù)作用

1、    【摘要】  目的 研究黃芪注射液抗培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞再灌注損傷的作用。方法 采用培養(yǎng)的SD乳鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，實(shí)驗(yàn)分為六組：A正常對照組，B缺氧組，C黃芪20組，D黃芪100組，E黃芪200組，F(xiàn)黃芪400組。黃芪各組缺氧過程中給予不同濃度黃芪，缺氧4 h，復(fù)氧2 h。比較缺氧復(fù)氧前后心肌細(xì)胞存活率，培養(yǎng)液中心肌酶含量。結(jié)果 各組缺氧前后谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)均有差異。復(fù)氧后2 h，B、C、D組培養(yǎng)液中心肌酶含量均有不同程度升高(P0.05)。E、F組GOT值較基礎(chǔ)值降低(P0.05)。與正常組比較，各組細(xì)胞經(jīng)過缺氧復(fù)氧后，

2、存活數(shù)均有不同程度下降(P0.01)。與缺氧復(fù)氧組比較，加入黃芪保護(hù)的黃芪20，黃芪100，黃芪200組均優(yōu)于單純?nèi)毖鯊?fù)氧組。黃芪200組存活率最高(P0.01)。結(jié)論 黃芪能夠減輕培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞再灌注損傷。 【關(guān)鍵詞】  再灌注損傷心肌保護(hù)細(xì)胞培養(yǎng)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞低氧The Protective Effect of Astragalus Injection on    Abstract: OBJECTIVE   To evaluate the protective effect of astragalus injection on

3、reperfusion injury cardial myocytes. METHODS  Studies were conducted on cultured cells. Rat ventricular myocytes were subjected to hypoxia 4h and reoxygenation 2h. Astragalus injection was applied to cells during ischemia/reoxygenation and the extent of cell death and myocardial enzyme was

4、 determined after 120 minutes of reperfusion. RESULTS  In cells, incubation with astragalus during reoxygenation attenuated the extent of cell damage and also reduced the number of apoptotic cells. CONCLUSION  This study shows that astragalus attenuates cardiac myocytes injury du

5、ring reperfusion.    Key words：  Astragalus; Cardioprotection;Cell culture; Cell hypoxia    提高心肌保護(hù)效果是心血管外科不斷發(fā)展的要求。通過藥物方法進(jìn)行心肌保護(hù)標(biāo)志著其中的一大進(jìn)步。本研究采用培養(yǎng)心肌細(xì)胞探討黃芪注射液的抗再灌注損傷作用，嘗試為中藥在心肌保護(hù)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。    1  材料與方法    1.1  原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)  13

6、日齡Sprague Dawley大鼠（由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供），紗巾法培養(yǎng)1。0.25%胰酶消化培養(yǎng)瓶內(nèi)單層細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，按實(shí)驗(yàn)要求的細(xì)胞量獲取原代心肌細(xì)胞。接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板內(nèi)。37，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱（REVCO公司，美國）內(nèi)培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁生長。經(jīng)鑒定90以上為心肌細(xì)胞，90以上為活細(xì)胞即可用于實(shí)驗(yàn)。    1.2  缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞模型制備  制備單細(xì)胞懸液，按實(shí)驗(yàn)要求細(xì)胞數(shù)目接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶內(nèi)。37，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁生長。實(shí)驗(yàn)前更換含1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液培

7、養(yǎng)24 h。更換相應(yīng)缺氧緩沖液。缺氧緩沖液（NaCl 137 mM,KCl 12 mM,MgCl2 0.49,CaCl2 0.9 mM,HEPES 4 mM,deoxyglucose 10 mM, sodium lactate 20 mM)2為高鉀低pH(pH 6.2）溶液，更好地模擬了心臟中的細(xì)胞暴露于無氧條件的情況。其后將細(xì)胞置于用配氣（95%N2+5%CO2，北京普萊特斯公司）飽和的容器中，向其中持續(xù)充入配氣，燃蠟熄滅后再飽和10 min，充分驅(qū)趕容器中的氧氣后迅即密封容器，放入孵箱37，培養(yǎng)4h。4h后恢復(fù)有氧環(huán)境，傾去缺氧緩沖液，換正常10血清DMEM培養(yǎng)基后將細(xì)胞置于5%CO2孵箱

8、中，于復(fù)氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)2h，造成心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷。    1.3  黃芪濃度對缺氧/復(fù)氧細(xì)胞凋亡影響  六個培養(yǎng)瓶細(xì)胞，每培養(yǎng)瓶細(xì)胞總數(shù)1×106，培養(yǎng)瓶隨機(jī)分為6組，編號為A組，B組，C組，D組，E組，F(xiàn)組。A組正常對照組，不加入黃芪，也不進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理。B組，C組，D組，E組，F(xiàn)組均為缺氧復(fù)氧組，其中黃芪終濃度依次為0 l/ml，20 l/ml，100 l/ml，200 l/ml，400 l/ml黃芪培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)開始時B組，C組，D組，E組，F(xiàn)組更換相應(yīng)缺氧培養(yǎng)液，黃芪注射液終濃度分別為0 l/ml，20 l/m

9、l，100 l/ml，200 l/ml，400 l/ml，37孵育缺氧培養(yǎng)4h。復(fù)氧時各組更換含相應(yīng)濃度黃芪的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h；正常對照組A組實(shí)驗(yàn)過程中入培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h。    實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，六組細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化制備單細(xì)胞懸液，磷酸鹽緩沖液離心洗滌2次(1000rpm，3 min)。細(xì)胞沉淀加入5 l Annexin-V-FITC染液室溫避光染色10 min。加入5 l PI染液室溫避光染色10 min。加入400 l 緩沖液重懸細(xì)胞沉淀后入流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur，美國）進(jìn)行檢測（凋亡檢測試劑盒Annexin-V-FITC

10、 Apoptosis Detection Kit 1：BD Pharmingen BD Biosciences）。    1.4  黃芪對缺氧/復(fù)氧細(xì)胞培養(yǎng)液心肌酶的影響  制備單細(xì)胞懸液接種于24孔板內(nèi)，每孔接種3 ml細(xì)胞懸液（3×104個細(xì)胞/孔）。37，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁生長。更換培養(yǎng)液，每板四組，各復(fù)5孔。黃芪注射液終濃度分別為0 l/ml，20 l/ml，100 l/ml，200 l/ml，400 l/ml培養(yǎng)液。37孵育。于24 h后取培養(yǎng)液0.5 ml在全自動生化分析儀上測定心肌

11、酶。    1.5  統(tǒng)計(jì)方法  采用SAS軟件v8.2版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。平均值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s )表示，心肌酶缺氧前和缺氧后組間兩兩比較采用單因素方差分析，各組缺氧前后比較采用配對t檢驗(yàn)。組間存活細(xì)胞數(shù)比較采用X2檢驗(yàn)。P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2  結(jié)  果    2.1  培養(yǎng)液心肌酶的變化  單因素方差分析顯示，缺氧前組間兩兩比較結(jié)果顯示，谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)基礎(chǔ)值無統(tǒng)

12、計(jì)學(xué)差異(P0.14270.05)。缺氧后組間兩兩比較結(jié)果顯示，E組,F組與其它各組均有差異，E組和F組之間也有差異。配對t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，各組缺氧前后GOT均有差異。復(fù)氧后2h，B組、C組、D組均有不同程度升高，P0.05。E組、F組GOT值較基礎(chǔ)值降低，P0.05，見表1。 表1  黃芪對復(fù)氧心肌細(xì)胞GOT的影響    2.2  黃芪對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡的影響  研究黃芪濃度對復(fù)氧心肌細(xì)胞存活數(shù)的影響顯示，與A組比較，各組細(xì)胞經(jīng)過缺氧復(fù)氧后，存活數(shù)均有不同程度下降，P0.01。與B組比較，加入黃芪保護(hù)的C組，D

13、組，E組均優(yōu)于B組。E組存活率最高。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P0.01。 見表2。 表2  不同濃度黃芪對復(fù)氧心肌細(xì)胞存活數(shù)的影響 注：與A組比較，P0.01；與B組比較P0.01    3  討  論    心肌缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury)是指缺血期處于可逆損傷的心肌細(xì)胞經(jīng)恢復(fù)血液供應(yīng)后轉(zhuǎn)化為不可逆損傷。再灌注過程挽救存活心肌細(xì)胞的同時，也會帶來細(xì)胞的損傷。再灌注損傷時，主要通過黃嘌呤氧化酶途徑產(chǎn)生大量氧自由基聚集，致膜脂質(zhì)過氧化3，促使氧自由基增多，加重

14、再灌注損傷4。再灌注損傷成為阻礙缺血心肌從再灌注療法中獲得最佳療效的主要難題。其機(jī)制復(fù)雜,涉及多種細(xì)胞外信號分子、細(xì)胞膜上信號接收器、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其效應(yīng)等多方面的變化,并在多層次和諸多環(huán)節(jié)存在交互作用5。    心肌缺血-再灌注、氧化應(yīng)激損傷可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。由于細(xì)胞凋亡是受一系列程序控制并通過信號通路介導(dǎo)的病理過程，阻斷心肌細(xì)胞凋亡的信號通路將有助于阻斷凋亡發(fā)生，防止心肌細(xì)胞數(shù)目的減少，維持或改善心功能6-7。目前的治療策略著眼于添加某些抗再灌注損傷的藥物，減輕再灌注引起的細(xì)胞死亡。針對再灌注時相抗細(xì)胞凋亡機(jī)制的治療方法，有可能是減輕再灌注引起細(xì)胞死亡的潛在方法

15、8。    黃芪能保護(hù)心肌細(xì)胞，研究表明黃芪治療后24h即可使組織線粒體SOD水平明顯高于對照組，而丙二醛水平則明顯低于對照組4。電鏡下觀察到使用黃芪保護(hù)的心肌細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、線粒體等超微結(jié)構(gòu)的改變明顯輕于對照組3。大量實(shí)驗(yàn)證明,黃芪能穩(wěn)定缺血心肌膜，通過對線粒體和溶酶體的保護(hù)，對心肌細(xì)胞缺血缺氧有直接保護(hù)作用9-10。電子自旋共振波譜儀觀察到黃芪總黃酮能減少大鼠心肌缺血-再灌注自由基的產(chǎn)生11。黃芪注射液抑制心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與幾方面有關(guān)12：黃芪擴(kuò)張冠狀動脈，改善心肌血供；黃芪提高SOD活性，清除氧自由基；黃芪擴(kuò)血管效應(yīng)；抑制免疫系統(tǒng)的誘導(dǎo)、激活和調(diào)控，

16、減少TNF-的生成，從而抑制激發(fā)胞內(nèi)凋亡通路；黃芪可抑制凋亡加速基因bax的表達(dá)，從而減少心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。增加cAMP的含量，從而發(fā)揮正性肌力作用。也有研究發(fā)現(xiàn)黃芪可能是通過NO-sGCcGMP介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)換通道，調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的功能，從而調(diào)整血壓、血流。NO 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種結(jié)構(gòu)簡單，半衰期短且化學(xué)性質(zhì)極其活潑的氣體信息分子，兼有信使、神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞毒性等多種作用，廣泛參與體內(nèi)多種生理活動，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組心肌內(nèi)NO含量及NOS活性均顯著高于對照組，此增高的NO可能參與對心肌的損傷。而經(jīng)黃芪治療后NO明顯下降，NOS接近正常，結(jié)果是否

17、與黃芪抑制心肌內(nèi)NOS2基因表達(dá)有關(guān)尚需進(jìn)一步探討11?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 何蕾,張莉,黃靖香.乳鼠心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究 J.解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2007,32(5):495-497.2 Di Napoli P, Taccardi AA, Grilli A, et al. Chronic treatment with rosuvastatin modulates nitric oxide synthase expression and reduces ischemia-reperfusion injury in rat hearts J. Cardiovasc R

18、es,2005,66 (3): 462-471.3 Flaherty JT，Zweier JL. Role of oxygen radicals in myocardial reperfusion injury：experimental and clinical evidence J. Klin Wochenschr,1991,69（21-23）:1061-1065.4 鄭曙云,徐建國,趙振中.參附注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響 J. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2004, 24(6):541-544，548. 5 韓笑,劉建勛.心肌缺血再灌注損傷的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 J.中國藥理學(xué)通報,2004,20(1):4-7.6 石永忠,肖衛(wèi)