HPLCMS法測定不同產(chǎn)地凍干鮮魚腥草中黃酮類成分的含量

1、HPLCMS法測定不同產(chǎn)地凍干鮮魚腥草中黃酮類成分的含量                                              作

2、者：孟江,廖華衛(wèi)，董小萍，趙中振         【摘要】  目的 考察不同產(chǎn)地凍干鮮魚腥草黃酮類活性成分的含量。方法 采用HPLCMS法，Alltima C18柱；流動相：體積分?jǐn)?shù)為0.2%的冰醋酸溶液為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫：020 min，5%20% B；2040 min，20%20.5% B；4050 min，20.5%35% B；流速：0.6 mL/min；柱后分流：0.4 mL/min進(jìn)質(zhì)譜儀；UV和MS同時檢測。結(jié)果 香港產(chǎn)的魚腥草5個黃酮類成分含量都低于四川峨嵋和廣東產(chǎn)地，四川

3、峨嵋產(chǎn)地的蕓香苷、金絲桃苷、槲皮苷含量均高于廣東產(chǎn)的，而廣東產(chǎn)地的槲皮素3OD半乳糖7OD葡萄糖苷和槲皮素3OL鼠李糖7OD葡萄糖苷含量高于四川峨嵋產(chǎn)地。結(jié)論 不同產(chǎn)地凍干鮮魚腥草的黃酮類活性成分含量不同。 【關(guān)鍵詞】  凍干鮮魚腥草；HPLCMS；黃酮；含量測定Quantitative analysis of flavonoids in freezedried Houttuynia cordata from different habitats by HPLCMSAbstract:Objective  To compare the contents of flavonoi

4、ds in freezedried Houttuynia cordata from different habitats. Methods Samples were analyzed by HPLCMS using an Alltima C18 column. The mobile phase consisted of  0.2% acetic acid in water (A) and acetonitrile (B) using a gradient elution program of 20% (B) in 020 min, 20%20.5% (B) in 2040 min,

5、20.5%35% (B) in 4050 min. The flow rate was 0.6 mL/min. Results The contents of five flavonoids in HongKong were higher than those in Sichuan and Guangdong Province. The contents of rutin, hyperoside and  quercitroside in Sichuan Province were higher than those in Guangdong Province, while the

6、contents of quercetin 3ODgalactopyranosyl7ODglucopyranoside and quercetin 3OLrhamnopyranosyl7ODglucopyranoside in Guangdong Province were higher than those in Sichuan Province. Conclusion There are great differences in the contents of flavonoids from different habitatsKey words: Houttuynia cordata;

7、HPLCMS; various cultivation locations； quantity analysis鮮魚腥草為三白草科Saururaceae蕺菜屬植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鮮全草1，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功效。主要用于治療肺膿瘍、痰熱咳嗽、熱痢熱淋、癰瘡腫毒2。現(xiàn)代藥理研究表明魚腥草中的黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化劑、抗誘變和清除自由基等功能3-4。作者曾對鮮魚腥草中黃酮類化合物的分離與鑒定進(jìn)行了研究5。本文建立HPLCMS法測定凍干鮮魚腥草中黃酮類活性成分的含量方法，并對不同產(chǎn)地黃酮類成分含量進(jìn)行比較，以期為魚腥草資源及鮮品的合理

8、開發(fā)利用提供理論依據(jù)。1  儀器與試藥1.1  儀器    Agilent 1100 LCMS聯(lián)用系統(tǒng)(美國惠普公司)，色譜數(shù)據(jù)處理由Agilent化學(xué)工作站完成。MilliQ N，MettlerToledo Group）。1.2  試劑    甲醇(分析純)，冰醋酸、乙腈(色譜純)均由德國 E.Merck 公司提供。    化學(xué)對照品：槲皮素3OD半乳糖7OD葡萄糖苷（1），槲皮素3OD鼠李糖7OD葡萄糖苷（2），蕓香苷（3），金絲桃苷（4），槲皮苷（5）均由本實(shí)驗(yàn)室分離純

9、化得到，純度均達(dá)到96%以上。1.3  藥材    新鮮魚腥草藥材分別采自四川峨眉，廣東肇慶和香港，采收季節(jié)為8月。經(jīng)香港浸會大學(xué)鄔家林教授鑒定為三白草科蕺菜Houttuynia cordata Thunb。    凍干鮮品的處理方法為：新鮮藥材先保存于-20 冰柜中，預(yù)凍12  h，然后冷凍干燥48 h。凍干品取出后密閉保存（經(jīng)測定藥材凍干品的含水量約為46%）。干品的處理方法按照中國藥典2005版規(guī)定的常溫干燥法干燥。樣品處理好后，粉碎，過40目篩，保存于4 冰箱備用。2  方法與結(jié)果2.1 

10、; 色譜條件    色譜柱：Alltima C18，5 m， 7.5 mm×4.6 mm (保護(hù)柱)+4.6 mm×150 mm（分析柱）。柱溫：室溫；流速：0.6 mL/min；柱后分流：0.4 ml/min進(jìn)質(zhì)譜儀；流動相：體積分?jǐn)?shù)為0.2%的冰醋酸溶液為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫：020 min，5%20%B；2040 min，20%20.5%B；4050 min，20.5%35%B；檢測條件：UV280 nm，MS同時記錄總離子流（TIC）色譜圖。進(jìn)樣量：10 L。    質(zhì)譜條件：離子化方式為電噴

11、霧離子化(ESI)；負(fù)離子形式；掃描范圍：130800 amu；干燥氣流速（氮?dú)猓?7 L/min，干燥氣溫度：400 ；霧化氣壓:5 000 V; 聚焦環(huán)電壓: 380 V。    5個對照品的M+1+ (m/z)分別為槲皮素3OD半乳糖7OD葡萄糖苷（1）627，槲皮素3OD鼠李糖7OD葡萄糖苷（2）611，蕓香苷（3）611，金絲桃苷（4）465，槲皮苷（5）449，質(zhì)譜圖見圖1。A.槲皮素3OD半乳糖7OD葡萄糖苷； B.槲皮素3OD鼠李糖7OD葡萄糖苷； C.蕓香苷； D.金絲桃苷； E.槲皮苷圖1  5個對照品的質(zhì)譜圖（略）Fig.1

12、0; MS chromatograms of five standard substance2.2  標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備    分別精密稱取各對照品適量，制成每1 mL含0.2 mg的甲醇溶液。取5個不同濃度的對照品溶液分別進(jìn)樣10 L，按上述色譜條件測定蜂面積，結(jié)果以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)()，以峰面積值為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行線性回歸，得到的回歸方程見表1。2.3  樣品溶液的制備    精密稱取0.5 g的樣品粉末，置50 mL的容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為70的甲醇至刻度，搖勻，超聲30 min，室溫放置30 min，過濾。

13、取濾液2  mL，0.2 m微孔濾膜濾過，進(jìn)樣10 L。                             2.4  穩(wěn)定性試驗(yàn)    取同一供試品溶液（廣東產(chǎn)地），在前述色譜條件下分別在0、2、4、8、24 h進(jìn)樣10 L，按上述色譜條件測定含量，各對照品含量的

14、RSD值均大于3.12%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。表1  各對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線（略）Tab.1  Validation parameters for standard curve2.5  重復(fù)性試驗(yàn)    取同一供試品（廣東產(chǎn)地）重復(fù)提取6份，按上述色譜條件測定含量，結(jié)果各對照品含量的RSD值均小于2.38%，表明重復(fù)性良好。2.6  回收率試驗(yàn)    取已知含量的魚腥草藥材（廣東產(chǎn)地）0. 5 g共5份，精密稱定，分別精密加入對照品適量，按“2.3”項下方法制備，測定各標(biāo)準(zhǔn)品的含量

15、，計算回收率，結(jié)果見表2。2.7  樣品測定       精密稱取各樣品0.5 g，按“2.3”項方法制備供試品溶液。樣品含量在線性范圍時直接進(jìn)樣10 L，通過回歸方程計算含量，所得結(jié)果見表3，色譜圖見圖2。表2  回收率測定（略）Tab.2  Recovery of assay (n=5)表3  樣品含量測定（略）Tab.3  Contents of flavonoids in H. cordata from different habitats（n=3）A混合標(biāo)準(zhǔn)品； B.四川；

16、C.廣東； D.香港1.槲皮素3OD半乳糖7OD葡萄糖苷; 2.槲皮素3OD鼠李糖7OD葡萄糖苷; 3.蕓香苷，4.金絲桃苷，5.槲皮苷    圖2  凍干鮮魚腥草不同產(chǎn)地及對照品的HPLC圖（略）    Fig.2  HPLC chromatograms of different habitats of freezedried Houttuynia cordata and mixed standard controls3  討論3.1  黃酮類化合物為魚腥草的有效成分，藥理研究表明化合物1和2

17、具有抗氧化作用和DPPH 自由基清除作用6-7?；衔?，4也具有較好的抗氧化活性8，以此5個活性成分為指標(biāo)，能較好的反映魚腥草的質(zhì)量優(yōu)劣。3.2  洗脫條件經(jīng)過反復(fù)的探索，樣品的HPLC色譜圖中各峰分離度較好，化合物3峰有小肩峰，還需進(jìn)一步改進(jìn)。3.3  本文建立HPLCMS同時測定凍干鮮魚腥草黃酮類活性成分含量的測定方法，結(jié)果表明不同產(chǎn)地凍干鮮魚腥草黃酮類成分的含量不同，香港產(chǎn)的魚腥草5個黃酮類成分含量都低于四川峨嵋和廣東產(chǎn)地，四川峨嵋產(chǎn)地的化合物3，4，5都高于廣東產(chǎn)的，而化合物1，2的含量廣東產(chǎn)地高于四川峨嵋產(chǎn)地，這對于臨床用藥及鮮魚腥草開發(fā)利用具有一定的指導(dǎo)意義。

18、【參考文獻(xiàn)】  1 國家藥典委員會中華人民共和國藥典：一部S北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：1552 李爽，于慶海，金佩珂魚腥草的有效成分、藥理作用及臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展J.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，1997，14(2)：1443 CHOI C W, KIM S C, HWANG S S, et al. Antioxidant activity and free radical scavenging capacity between Korean medicinal plants and flavonoids by assayguided comparisonJ. Plant Science,2002,163:1161-1168.4 CHEN Y Y, LIU J, CHEN C M, et al. A study of the antioxidative and antimutagenic effects of Houttuynia cordata Thunb. using an oxidized frying oilfed modelJ. J Nutr Sci Vitaminol,2003,49:327-33.5 孟江，董小萍，趙中振，等鮮魚腥草的黃酮類化合物研究J.中國中藥雜志，2006，31（15）：6-86 CA