常用生化檢測(cè)項(xiàng)目分析方法與參數(shù)設(shè)置

1、常用生化檢測(cè)項(xiàng)目分析方法及參數(shù)設(shè)置一、常用生化檢測(cè)項(xiàng)目分析方法舉例1. 終點(diǎn)法檢測(cè)常用的有總膽紅素（氧化法或重氮法）、結(jié)合膽紅素（氧化法或重氮法）、血清總蛋白（雙縮腺法）、血清白蛋白（澳甲酚氯法）、總膽汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、總膽固醇（膽固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸 甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋口膽固醇（直接測(cè)定法）、鈣（偶氮硼III法）、磷（紫外法）、 鎂（二甲苯胺藍(lán)法）等。以上項(xiàng)目中，除鈣、磷和鎂基本上還使用單試劑方式分析因而采用 一點(diǎn)終點(diǎn)法外，其它測(cè)定項(xiàng)目都可使用雙試劑故能選用兩點(diǎn)終點(diǎn)法，包括總蛋白、白蛋白測(cè) 定均已有雙試劑可用。2. 固定時(shí)間法苦味酸

2、法測(cè)定肌酊采用此法。3. 連續(xù)監(jiān)測(cè)法對(duì)于酶活性測(cè)定一般應(yīng)選用連續(xù)監(jiān)測(cè)法，如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、丫谷氨氨?；D(zhuǎn)移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代謝物酶法測(cè)定的項(xiàng)目如己糖激酶法測(cè)定葡萄糖、腺酶偶聯(lián)法測(cè)定尿素等，也可用連續(xù) 監(jiān)測(cè)法。4. 透射比濁法透射比濁法可用于測(cè)定產(chǎn)生濁度反應(yīng)的項(xiàng)目，多數(shù)屬免疫比濁法,載脂蛋白、免疫球蛋白、補(bǔ)體、抗氣r、類風(fēng)濕因子，以及血清中的其他蛋白質(zhì)如前白蛋白、 結(jié)合珠蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等均可用此法。二、分析參數(shù)設(shè)置分析儀的一些通用操作步驟如取樣、沖洗、吸光度檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理等，其程序均已經(jīng)固化在 存儲(chǔ)器里，用戶不能修改。各種測(cè)定項(xiàng)目的分析參

3、數(shù)（analysisparamete）大部分也已設(shè) 計(jì)好，存于磁盤中，供用戶使用；目前大多數(shù)生化分析儀為開放式，用戶可以更改這些參數(shù)。生化分析儀一般另外留一些檢測(cè)項(xiàng)目的空白通道，由用戶自己設(shè)定分析參數(shù)。因此必須理解 各參數(shù)的確切意義。一、分析參數(shù)介紹（-）必選分析參數(shù) 這類參數(shù)是分析儀檢測(cè)的前提條件，沒(méi)有這些參數(shù)無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。1. 試驗(yàn)名稱試驗(yàn)名稱（testcode）是指測(cè)定項(xiàng)冃的標(biāo)示符，常以項(xiàng)目的英文縮寫來(lái)表示。2. 方法類型(也稱反應(yīng)模式)方法類型(assay)有終點(diǎn)法、兩點(diǎn)法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法等，根據(jù)被檢物質(zhì)的檢測(cè)方法原理選擇其中一種反應(yīng)類型。3.反應(yīng)溫度一般有30°C、37

4、6;C可供選擇，通常固定為37°C。4.主波長(zhǎng)主波長(zhǎng)(primarywavelength)是指定一個(gè)與被測(cè)物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物的光吸收有關(guān)的波長(zhǎng)。5.次波長(zhǎng)次波長(zhǎng)(seconddxywdvelength)是在使用雙波長(zhǎng)時(shí)，要指定一個(gè)與主波長(zhǎng)、干擾物質(zhì)光吸收有關(guān)的波長(zhǎng)。6.反應(yīng)方向反應(yīng)方向("5卩0皿6(1讓6毗匚011)有正向反應(yīng)和負(fù)向反應(yīng)兩種，吸光度增加為正向反應(yīng)，吸光度下降為負(fù)向反應(yīng)。7.樣品量樣品量(samplingvolum) 一般是2 uT35山1以0. 1 u步lift,個(gè)別分析儀最少能達(dá)到1.6 Mo設(shè)置常量、減量和增量。8.第一試劑量第一試劑量(firstregen

5、gtvolum) 一般是20300山1以1 步進(jìn)。9.第二試劑量第二試劑量(secondregengtvolum) 一般也是20-300 u, 1以1卩1步進(jìn)。10總反應(yīng)容量總反應(yīng)容量(totalreactingvolum)在不同的分析儀有一個(gè)不同的規(guī)定范圍，一般是180350 U1,個(gè)別儀器能減少至120 ulo總反應(yīng)容量太少無(wú)法進(jìn)行吸光度測(cè)定。11.孵育時(shí)間孵育時(shí)間(incubatetime)在終點(diǎn)法是樣品與試劑混勻開始至反應(yīng)終點(diǎn)為止的時(shí)間，在兩點(diǎn)法是第一個(gè)吸光度選擇點(diǎn)開始至第二個(gè)吸光度選擇點(diǎn)為止的時(shí)間。12.延遲時(shí)間延遲時(shí)間(delaytime)在連續(xù)監(jiān)測(cè)法中樣品與反應(yīng)試劑(第二試劑)混

6、勻開始至連續(xù)監(jiān)測(cè)期第一個(gè)吸光度選擇點(diǎn)之間的時(shí)間。13.連續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間連續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間(continuousmonitoringtime)在延遲時(shí)間之后即開始,一般為60120s,不少于4個(gè)吸光度檢測(cè)點(diǎn)(3個(gè)吸光度變化值)。14.校準(zhǔn)液個(gè)數(shù)及濃度校準(zhǔn)曲線線性好并通過(guò)坐標(biāo)零點(diǎn)的，可采用一個(gè)校準(zhǔn)液(calibrator)；線性好但不通過(guò)坐標(biāo)零點(diǎn)，應(yīng)使用兩個(gè)校準(zhǔn)液；對(duì)于校準(zhǔn)曲線呈非線性者，必須使用兩個(gè)以 上校準(zhǔn)液。每一個(gè)校準(zhǔn)液都要有一個(gè)合適的濃度。15.校準(zhǔn)K值或理論K值通過(guò)校準(zhǔn)得到的K值為校準(zhǔn)K值(calibratecoefficient)或由計(jì)算得岀的K值為理論K值。16.線性范圍即方法的線性范圍(li

7、nearityenge),超過(guò)此范圍應(yīng)增加樣品量或減少樣品量重測(cè)。與試劑/樣品比值有關(guān)。17.小數(shù)點(diǎn)位數(shù)檢測(cè)結(jié)果的小數(shù)點(diǎn)位數(shù)(decimalpointdigit)。(二) 備選分析參數(shù)這類分析參數(shù)與檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性有關(guān)，一般來(lái)說(shuō)不設(shè)置這類分析參數(shù)，分析儀也能檢測(cè)出 結(jié)果，但若樣品中待測(cè)物濃度太高等，檢測(cè)結(jié)果可能不準(zhǔn)確。1樣品預(yù)稀釋設(shè)置樣品量、稀釋劑量和稀釋后樣品量三個(gè)數(shù)值，便可在分析前自動(dòng)對(duì)樣品進(jìn)行高倍稀釋。2. 底物耗盡值底物耗盡值（substrateexhaustlimit）在負(fù)反應(yīng)的酶活性測(cè)定中，可設(shè)置此參數(shù)，以規(guī)定一個(gè)吸光度下降限。若低于此限時(shí)底物已太少，不足以維持零級(jí)反應(yīng)而導(dǎo)致 檢測(cè)

8、結(jié)果不準(zhǔn)確。3. 前區(qū)檢查免疫比濁法中應(yīng)用，以判斷是否有抗原過(guò)剩。將終點(diǎn)法最后兩個(gè)吸光度值的差別（AA）設(shè)置一個(gè)限值，如果后一點(diǎn)的吸光度比前一點(diǎn)低，表示已有抗原過(guò)剩，應(yīng)稀釋樣 品后重測(cè)。4. 試劑空白吸光度范圍超過(guò)此設(shè)定范圍表示試劑已變質(zhì)，應(yīng)更換合格試劑。5. 試劑空白速率連續(xù)監(jiān)測(cè)法中使用，是試劑本身在監(jiān)測(cè)過(guò)程中沒(méi)有化學(xué)反應(yīng)時(shí)的變化速率。6. 方法學(xué)補(bǔ)償系數(shù)用于校準(zhǔn)不同分析方法間測(cè)定結(jié)果的一致性，有斜率和截距兩個(gè)參數(shù)。7. 參考值范圍對(duì)超過(guò)此范圍的測(cè)定結(jié)果，儀器會(huì)打印出提示。（三）某些參數(shù)的特殊意義1.最小樣品量最小樣品量是指分析儀進(jìn)樣針能在規(guī)定的誤差范圍內(nèi)吸取的最小樣品量。一般分析儀的最小樣

9、品量是2 U, 1目前也有小至1.6U1的。在樣品含高濃度代謝產(chǎn)物或高活性酶濃度的情況下往往需采用分析儀的最小樣品量作為減量參數(shù)，從而使分析儀檢測(cè)范圍（與 線性范圍不同）的上限得以擴(kuò)大。2.最大試劑量方法靈敏度很高而線性上限低的檢測(cè)項(xiàng)目，如血清白蛋白的漠甲酚氯法測(cè)定,以往手工法操作時(shí)樣品量10U1,試劑量4nil,這樣試劑量/樣品量比例（R/S）為200,線性 上限則為60g/Lo此法移植到分析儀上后，R/S卻很難達(dá)到200,致使線性上限變低。因此 對(duì)這類檢測(cè)項(xiàng)目最大試劑量非常重要。3. 彈性速率在酶活性測(cè)定中，當(dāng)酶活性太高，在連續(xù)監(jiān)測(cè)期中已不呈線性反應(yīng)時(shí)，有些儀器具有彈性速率（flexrat

10、e）功能，能自動(dòng)選擇反應(yīng)曲線上連續(xù)監(jiān)測(cè)期中仍呈線性的吸光度 數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果，使酶活性測(cè)定的線性范圍得以擴(kuò)大。如AST可從1000U/L擴(kuò)展至4000U/L, 從而減少稀釋及重測(cè)次數(shù)、降低成本。4. 試劑空白速率當(dāng)樣品中存在膽紅素時(shí)，膽紅素對(duì)堿性苦味酸速率法或兩點(diǎn)法測(cè)定肌有負(fù)干擾。因?yàn)槟懠t素在肌酹檢測(cè)的波長(zhǎng)505rini有較高光吸收，而且膽紅素在堿性環(huán)境中可 被氧化轉(zhuǎn)變，因而在肌酹反應(yīng)過(guò)程中膽紅素的光吸收呈下降趨勢(shì)。若在加入第一試劑后一段時(shí)間內(nèi)設(shè)置試劑空白速率，因?yàn)榇硕沃锌辔端嵘形磁c肌酊反應(yīng)，而膽紅素在第一試劑的堿性 環(huán)境中已同樣被氧化轉(zhuǎn)變，因而以第二試劑加入后的速率變化，減去試劑空白速率變化，便

11、 可消除膽紅素的負(fù)干擾。二、單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)方式（一）概念 采用一個(gè)波長(zhǎng)檢測(cè)物質(zhì)的光吸收強(qiáng)度的方式稱為單波長(zhǎng)（mono-wavelength）方式。當(dāng)反應(yīng)液 中含有一種組分，或在混合反應(yīng)液中待測(cè)組分的吸收峰與其它共存物質(zhì)的吸收波長(zhǎng)無(wú)重疊 時(shí)，可以選用。在吸光度檢測(cè)中，使用一個(gè)主波長(zhǎng)和一個(gè)次波長(zhǎng)的稱雙波長(zhǎng)方式。當(dāng)反應(yīng)液 中存在干擾物的較大吸收、從而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性時(shí)，采用雙波長(zhǎng)方式更好。（二）雙波長(zhǎng)的作用 雙波長(zhǎng)（di-wavelength）測(cè)定優(yōu)點(diǎn)是消除噪音干擾；減少雜散光影響；減少樣品本身光 吸收的干擾。從光源，到比色杯、單色器、檢測(cè)器的整個(gè)光路系統(tǒng)中，均存在著隨時(shí)間發(fā)生 變化的不穩(wěn)定的檢

12、測(cè)信號(hào)，即噪音，而雙波長(zhǎng)檢測(cè)是同時(shí)進(jìn)行的，兩種波長(zhǎng)檢測(cè)產(chǎn)生的噪音 基本上相同，因而能消除噪音干擾。當(dāng)樣品中存在非化學(xué)反應(yīng)的干擾物如甘油三酯、血紅蛋 口、膽紅素等時(shí)，會(huì)產(chǎn)生非特異性的光吸收，而干擾測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用雙波長(zhǎng)方式測(cè) 定可以部分消除這類干擾，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。（三）次波長(zhǎng)的確定方法 當(dāng)被測(cè)物的主波長(zhǎng)確定之后，再選擇次波長(zhǎng)。如根據(jù)甘油三酯等干擾物吸收光譜特征，選擇 次波長(zhǎng)，使干擾物在主、次波長(zhǎng)處有盡可能相同的光吸收值，而被測(cè)物在主、次波長(zhǎng)處的光 吸收值應(yīng)有較大的差異。一般來(lái)說(shuō)，次波長(zhǎng)應(yīng)大于主波長(zhǎng)lOOnmo以主波長(zhǎng)與次波長(zhǎng)吸光 度差來(lái)計(jì)算結(jié)果。（四）雙波長(zhǎng)的具體應(yīng)用 對(duì)于某些反應(yīng)速度

13、快且無(wú)法設(shè)置為兩點(diǎn)終點(diǎn)法的分析項(xiàng)目，尤其是單試劑分析中，可以利用 雙波長(zhǎng)的方式來(lái)部分消除樣品本身的光吸收T擾。冃前用單試劑法測(cè)定的項(xiàng)冃應(yīng)用雙波長(zhǎng)的 為血清總蛋白（雙縮腺法）主波長(zhǎng)500nm,次波長(zhǎng)576nm；血清白蛋白（澳甲酚氯法）主、 次波長(zhǎng)分別為600和700nm；鈣（偶氮硼III法）主、次波長(zhǎng)分別為660、770nm；磷（紫 外比色法）主、次波長(zhǎng)為340、405nm,鎂（二甲苯胺藍(lán)法）主、次波長(zhǎng)為505和600。三、單試劑和雙試劑方式 反應(yīng)過(guò)程中只加一次試劑稱單試劑方式，加兩次試劑便為雙試劑方式。目前的生化分析儀大 多可用雙試劑方式分析，其優(yōu)點(diǎn)是：可提高試劑的穩(wěn)定性，多數(shù)雙試劑混合成單一

14、工作試 劑時(shí)，其穩(wěn)定時(shí)間縮短；能設(shè)置兩點(diǎn)終點(diǎn)法，來(lái)消除來(lái)自樣品本身的光吸收T擾；在某 些項(xiàng)目檢測(cè)時(shí)能消除非特異性化學(xué)反應(yīng)的干擾。如血清ALT測(cè)定，血清中的內(nèi)源性丙酮酸 及其它酮酸也可與試劑中的指示酶(乳酸脫氫酶)起反應(yīng)，使結(jié)果偏高。若先加入缺乏a- 酮戊二酸的第一試劑，使其它酮酸與指示酶反應(yīng)之后再加入含有a-酮戊二酸的第二試劑, 啟動(dòng)真正的ALT酶促反應(yīng)生成丙酮酸，而丙酮酸與乳酸脫氫酶的反應(yīng)消耗的NAD+能真正 反映ALT的活性，從而消除以上副反應(yīng)的影響。四、測(cè)定過(guò)程的自動(dòng)監(jiān)測(cè) 各種自動(dòng)生化分析儀或多或少都具有對(duì)測(cè)定過(guò)程進(jìn)行各種監(jiān)測(cè)的功能，以便在沒(méi)有人"監(jiān)督" 化學(xué)反應(yīng)的情

15、況下提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。高檔分析儀的監(jiān)測(cè)功能更強(qiáng)。1.試劑空口監(jiān)測(cè)每種試劑都有一定的空白吸光度范圍，試劑空白吸光度的改變往往提示著該試劑的變質(zhì)：如利用Trinder反應(yīng)為原理的檢測(cè)試劑會(huì)因酚被氧化為醍而變?yōu)榧t色；堿性 磷酸酶、丫一谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、淀粉酶等檢測(cè)試劑會(huì)因基質(zhì)分解出硝基酚或硝基苯胺而變黃;有些試劑久置后變渾濁。這些情況均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨 基轉(zhuǎn)移酶等負(fù)反應(yīng)檢測(cè)項(xiàng)目，其試劑在放置過(guò)程中空白吸光度會(huì)因NADH自行氧化為NAD +而下降等。試劑空白的測(cè)定方法有兩種：每瓶試劑在使用前通過(guò)對(duì)試劑空白校準(zhǔn)來(lái)確定試劑空白吸光 度，這種方式適用于先取樣品后加試劑的分析儀。每

16、個(gè)樣品測(cè)定前均檢測(cè)試劑空白吸光度, 適用于先加試劑后取樣品的分析儀。2.試劑空白變化速率監(jiān)測(cè)一些酶試劑在反應(yīng)溫度下不穩(wěn)定，其空白吸光度可隨著時(shí)間逐漸發(fā)生變化，這種變化的主要原因與工具酶或輔酶的純度有關(guān)，且因試劑的組成和生產(chǎn)廠家的 不同而不同。這種變化會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，一般使結(jié)果偏高。如果設(shè)置此項(xiàng)監(jiān)測(cè)，分 析儀在結(jié)果計(jì)算時(shí)會(huì)自動(dòng)減去試劑空白變化速率。在以監(jiān)測(cè)NAD (P) H減少為指示反應(yīng)的酶活性測(cè)定中，空口速率可監(jiān)測(cè)并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原 為底物的酶活性測(cè)定中，空白速率可監(jiān)測(cè)并消除底物自身分解造成的吸光度升高。有關(guān)空口 速率監(jiān)測(cè)在膽紅素對(duì)堿性苦味酸速率法測(cè)定

17、肌酊負(fù)T擾消除中的作用，已如前述。3樣品信息監(jiān)測(cè)由于樣品的溶血、脂濁、黃疸會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生非化學(xué)反應(yīng)的T擾。根據(jù)溶血、脂濁、黃疸的光譜吸收特性，用雙波長(zhǎng)或多波長(zhǎng)檢測(cè)其性質(zhì)和程度，一般是測(cè)定樣品 在600nm / 570nm 700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小來(lái)分別判斷樣品溶血、脂濁和黃疸程度。然后在結(jié)果計(jì)算時(shí)自動(dòng)減去這部分T擾，這將有利于提高分析結(jié)果的 可靠性。4.結(jié)果可靠性監(jiān)測(cè)(1)終點(diǎn)監(jiān)測(cè)：終點(diǎn)法測(cè)定要判斷所選的測(cè)光點(diǎn)是否到達(dá)終點(diǎn)或平衡點(diǎn)。一些分析儀在所選終點(diǎn)后再選一個(gè)測(cè)光點(diǎn)，比較這兩點(diǎn)吸光度的差異來(lái)判斷反應(yīng)是否到達(dá)終點(diǎn)。(2)線性期監(jiān)測(cè)：連續(xù)監(jiān)測(cè)法選擇時(shí)間一吸光度反應(yīng)曲線上的線性期來(lái)計(jì)算酶活性或被測(cè)物濃度，因此儀器要確定此連續(xù)監(jiān)測(cè)期是否呈線性。其監(jiān)測(cè)方法為將連續(xù)監(jiān)測(cè)到的各吸光 度值進(jìn)行線性回歸，計(jì)算出各點(diǎn)的方差，根據(jù)方差值的大小來(lái)判斷是否呈線性；取連續(xù)監(jiān) 測(cè)期開始若干點(diǎn)的變