病原物分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告講解

1、病原物分離培養(yǎng)和純化7普通植物病理學(xué)題目病原物的分離培養(yǎng)和純化姓名學(xué)號(hào)所在學(xué)院農(nóng)學(xué)院年級(jí)專業(yè)植物保護(hù) 201201指導(dǎo)教師完成時(shí)間年月日病原物的分離培養(yǎng)和純化植物保護(hù)指導(dǎo)教師【 摘要】本實(shí)驗(yàn)主要通過用對(duì)十大功勞炭疽病病菌的分離和在 PDA培養(yǎng)基中對(duì)炭 疽病菌消毒后做無(wú)菌培養(yǎng)然后轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)過程觀察炭疽病菌的生長(zhǎng) 情況，了解分離與純化病原物的基本原理與方法， 掌握實(shí)驗(yàn)室常用的消毒滅菌方 法，并掌握培養(yǎng)基的制作和無(wú)菌操作技術(shù)。【關(guān)鍵字 】分離培養(yǎng)；純化 ；PDA培養(yǎng)基；滅菌；斜面試管培養(yǎng)基 柯赫氏法則 (Koch'sR ule) 是確定侵染性病害病原物的操作程序。如發(fā)現(xiàn)一 種不熟悉

2、的或新的病害時(shí)， 就應(yīng)按柯赫氏法則的四個(gè)步驟來(lái)完成診斷與鑒定。 診 斷是從癥狀等表型特征來(lái)判斷其病因， 確定病害種類。 鑒定則是將病原物的種類 和病害種類同已知種類比較異同， 確定其科學(xué)名稱或分類上的地位。 有些病害特 征明顯，可直接診斷或鑒定， 如霜霉病或稈銹病。 但在許多場(chǎng)合難以鑒定病原物 的屬、種。如花葉癥狀易于識(shí)別，要判斷由何種病原物引起，就必須經(jīng)詳細(xì)鑒定 比較后才能確定。 柯赫氏法則表述為：“ (1) 在病植物上常伴隨有一種病原微生物 存在；(2) 該微生物可在離體的或人工培養(yǎng)基上分離純化而得到純培養(yǎng)； (3) 將純 培養(yǎng)接種到相同品種的健株上，出現(xiàn)癥狀相同的病害； (4) 從接種發(fā)

3、病的植物上 再分離到其純培養(yǎng)，性狀與接種物相同” 【1】。如果進(jìn)行了上述四步鑒定工作得到確實(shí)的證據(jù)， 就可以確認(rèn)該微生物即為其 病原物。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 供試材料 十大功勞炭疽病病害部位、 PDA培養(yǎng)基(自制)1.1.2 試驗(yàn)試劑及儀器 超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、試管、接種鏟、接種針、 70%酒精、 0.1 升 汞、電爐等1.2 方法(大田苗圃鑒定 )1.2.1 培 養(yǎng)基 的配制“培養(yǎng)基按成分及對(duì)成分了解程度分為天然培養(yǎng)基、半組合培 養(yǎng)基、 組合 培養(yǎng)基三類，從物理性分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基兩種，培養(yǎng)基不同，配制方 法不同。”【1】本實(shí)驗(yàn)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，簡(jiǎn)稱

4、 PDA培養(yǎng)基。（ PDA培養(yǎng) 基是植物實(shí)驗(yàn)室最常用的培養(yǎng)基，主要用于植物病原真菌的分離培養(yǎng)。 ） PDA培 養(yǎng)基的配制方法：首先準(zhǔn)備優(yōu)質(zhì)去皮馬鈴薯 200 克、葡萄糖 10-20 克、瓊脂 20 克，加水至 1000ml。將馬鈴薯切成小塊，加水 1000ml 煮沸約半小時(shí)，煮沸過程 中要不斷攪拌， 然后用雙層紗布濾去薯塊， 補(bǔ)足水量，加入小塊瓊脂， 加熱融化， 再加糖， 待完全溶化后， 趁熱分裝于三角瓶和試管中， 注意每個(gè)三角瓶不宜裝太 多，以少于 1/2 為宜，試管中用于制備斜面培養(yǎng)基，也應(yīng)較少， 1/3 左右為宜， 然后將三角瓶和試管塞好棉塞以備滅菌。由于 PDA略帶酸性，適于真菌生長(zhǎng)，

5、因此不用調(diào)節(jié) pH 值。1.2.2 滅菌為了得到某種病原物的純培養(yǎng)， 用于培養(yǎng)病原物的器物和培養(yǎng)基必須經(jīng)過滅 菌才能使用。 滅菌前在三角瓶中加入少許孟加拉紅抑制細(xì)菌和放線菌的生長(zhǎng)。 本 實(shí)驗(yàn)采用高壓蒸汽滅菌法對(duì)做好的 PDA培養(yǎng)基和試管內(nèi)斜面培養(yǎng)基滅菌。高壓蒸汽滅菌法又稱濕熱滅菌， 它是利用高壓提高蒸汽溫度， 達(dá)到滅菌的目 的，其操作步驟如下：A、關(guān)好清水閥門，放入清水至標(biāo)準(zhǔn)度為止注意水量要加足，否則易造成事 故。B、將要滅菌的培養(yǎng)基、滅菌水等裝入鐵絲籠中，并用牛皮紙蓋好后放入滅 菌鍋中，關(guān)上氣蓋，旋緊螺旋時(shí)，先將每個(gè)螺旋旋轉(zhuǎn)到一定程度，不要太緊，再 旋緊相對(duì)的兩個(gè)旋鈕，以達(dá)到平衡旋緊，否則易

6、造成漏氣不能徹底滅菌。C、通電加溫，同時(shí)打開排氣閥門排盡鍋內(nèi)的空氣，當(dāng)活門噴出的全是蒸汽 的時(shí)候即可關(guān)閉閥門， 一定要排盡空氣以達(dá)到徹底滅菌的目的， 通常溫度表上升 至 90時(shí)打開放氣降至零點(diǎn)再關(guān)閉。D、溫度表的指針上升時(shí)壓力也隨之升高， 當(dāng)壓力表升至 15 磅時(shí)蒸汽壓相當(dāng) 于一個(gè)大氣壓，此時(shí)計(jì)算滅菌時(shí)間，控制熱源，使處于 15 磅壓力保持 30分鐘， 就能達(dá)到完全滅菌目的，然后停止加溫。E、一般應(yīng)待壓力表降至 5 磅時(shí)稍微打開排氣活門，使鍋內(nèi)蒸汽緩慢排除，然后加大活門開口，勿使排氣過快。F、當(dāng)壓力表降至 0 時(shí)鍋內(nèi)蒸汽完全排盡時(shí)，打開鍋蓋取出培養(yǎng)基。然后將 高壓鍋內(nèi)水排出。G、抽取上述培養(yǎng)基

7、放入 25恒溫箱中，48 小時(shí)不見雜菌證明培養(yǎng)基已達(dá)到 目的。有些培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后容易失去營(yíng)養(yǎng)成分，則可采用間歇性蒸汽滅菌法， 即每天保持 100一個(gè)小時(shí)連續(xù)三天也可達(dá)到滅菌效果。1.2.3 病原真菌的分離培養(yǎng)為了獲得分離菌的純培養(yǎng)， 必須進(jìn)行分離菌的純化， 本實(shí)驗(yàn)采用組織分離法 分離炭疽病菌。 分離培養(yǎng)一般在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行， 無(wú)菌室和無(wú)菌箱要經(jīng)過噴霧 除塵，并用紫外線照射消毒， 工作前將所需物品放在超凈工作臺(tái)內(nèi)， 操作人員需 用肥皂洗手，操作時(shí)還需用 70%的酒精擦拭雙手，操作時(shí)呼吸要輕，不要說(shuō)話。操作方法如下：A、取滅菌培養(yǎng)基一個(gè)置于濕紗布上，在皿蓋上表明分離日期、材料和分離 人姓名，

8、并分別將 10s、15s、20s、25s 四個(gè)標(biāo)示均勻標(biāo)示到培養(yǎng)皿背面?zhèn)溆?。點(diǎn) 燃酒精燈。B、將培養(yǎng)皿拿在手上在酒精燈上烘烤皿口一圈，用無(wú)菌培養(yǎng)操作法向培養(yǎng) 皿中加入 25%乳酸 1-2滴，然后將溶化冷至 60攝氏度左右的 PDA 培養(yǎng)基倒入培 養(yǎng)皿中，每皿倒 15-20 毫升，輕輕搖動(dòng)使成平面，凝固后即成平板培養(yǎng)基。C、取十大功勞炭疽病新鮮病葉，選擇典型的單個(gè)病斑，用剪刀或解剖刀從 病斑邊緣既病健接合部切取長(zhǎng)寬 3-4mm 的方形小塊病組織數(shù)塊。D、取 5 個(gè)滅菌培養(yǎng)皿，兩個(gè)分別加入 75%酒精、 0.1%升汞，其余三個(gè)加入 適量無(wú)菌水。將切好的病組織放入 75%酒精中浸泡 3-5 秒（消除

9、表面張力） ，然 后按無(wú)菌操作法將病組織移入 0.1%升汞液中分別進(jìn)行表面消毒 10s、 15s、20s、 25s，然后放入滅菌水中連續(xù)漂洗三次，除去殘留消毒劑。E、將漂洗后的病組織放到無(wú)菌吸水紙上吸取多余水分，減少細(xì)菌污染，然 后在酒精燈火線前用無(wú)菌操作法分別將消毒時(shí)間為 10s、15s、20s、25s 的病組織 各 1 個(gè)分別放入培養(yǎng)皿對(duì)應(yīng)標(biāo)識(shí)的位置，然后迅速將培養(yǎng)皿蓋上。F、將培養(yǎng)皿放到 25左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。前兩天主要觀察是否被細(xì)菌污染，后兩天主要觀察待分離菌生長(zhǎng)情況。G、若病組織長(zhǎng)出較為一致的菌落則多半為要分離的病原菌，為確定病原物 是否為需要分離培養(yǎng)的病原物， 可挑取菌落鏡檢， 觀

10、察其形態(tài)特征， 若與之前看 到的一致即為所需病原物。 待病原菌生長(zhǎng)到一定情況， 取出培養(yǎng)皿， 在超凈工作 臺(tái)內(nèi)用接種環(huán)在菌落邊緣挑取小塊移入斜面培養(yǎng)基上 （接種環(huán)使用前在酒精燈火 焰上烘烤數(shù)秒，防止雜菌滋生） ，在 25左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，數(shù)日后觀察待分離 菌生長(zhǎng)狀況，如無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即得到該病菌的純菌種，便可置于冰箱中保存。如需驗(yàn)證此病害，可將分離培養(yǎng)所得病原物通過無(wú)菌操作接種到健康的相同 植株上，保濕培養(yǎng)數(shù)日，觀察其所致病害特征是否與原來(lái)一致，如一致，可再將 其病原物分離培養(yǎng)觀察其性狀是否與第一次分離培養(yǎng)的病原物一致。 2結(jié)果與分析2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分離培養(yǎng)所得病原物菌落在平板培養(yǎng)基中生長(zhǎng)不佳，

11、 均只出現(xiàn) 2 個(gè)菌落。菌 落呈灰白色或近深灰色，有少數(shù)被細(xì)菌污染，呈乳膠狀，灰色。約 3 天后接種到 斜面培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)數(shù)天后觀察生長(zhǎng)良好，無(wú)雜菌污染，呈黑褐色。挑取菌落部分與顯微鏡下觀察， 其分生孢子著生于分生孢子盤內(nèi)壁上， 分生 孢子梗呈無(wú)色或褐色， 分生孢子為無(wú)色單胞， 長(zhǎng)橢圓形或新月形， 有的分生孢子 盤上還長(zhǎng)有黑褐色剛毛。2.2 結(jié)果分析本實(shí)驗(yàn)過程主要為柯赫氏法則的前兩步， 通過實(shí)驗(yàn)操作， 了解了分離培養(yǎng)的 基本原理和方法， 基本掌握了消毒滅菌方法和培養(yǎng)基的制作、 無(wú)菌操作技術(shù)， 了 解了柯赫氏法則的程序和方法。3 結(jié)論與討論普通植物病理學(xué) 上對(duì)炭疽病屬菌物描述如下： “分生孢子盤在寄生角質(zhì) 下、表皮或表皮下，黑褐色，人工培養(yǎng)時(shí)有時(shí)產(chǎn)生菌核，在菌核和分生孢子盤上 有時(shí)生有黑褐色的剛毛， 分生孢子梗無(wú)色至褐色， 產(chǎn)生內(nèi)壁芽生式分生孢子， 分 生孢子為無(wú)色， 單胞，長(zhǎng)橢圓形或新月形， 有的含有 1-2 個(gè)油球萌發(fā)之后芽管頂 端產(chǎn)生附著胞， 引起多種瓜果和蔬菜炭疽病。 ”【2】普通植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 上 對(duì)此描述大致一致。本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)得到的病原物特征與炭疽病病原物描述一致， 因此可以得知 所得病原物為半知菌類腔孢綱黑盤孢目 (Melanconiales)炭疽病屬(Colleto