胚胎干細(xì)胞分化

1、小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟以下是根據(jù)NIH老年病研究所提供的英文的R1胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)protocol整理而成。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)作部分修改。1、一般培養(yǎng)-保持胚胎干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)培養(yǎng)基細(xì)胞復(fù)蘇凍存細(xì)胞明膠包被細(xì)胞傳代2 、體外分化培養(yǎng)基包被有多聚鳥(niǎo)氨酸/纖維結(jié)合蛋白的培養(yǎng)板（使用或不使用蓋玻片）體外分化方法注：以下培養(yǎng)針對(duì)于小鼠的R1胚胎干細(xì)胞系，其它胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)可以參考。不過(guò)人的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)不可以采用下面的protocol，需要用專用的protocol和培養(yǎng)基。一般培養(yǎng)-維持ES細(xì)胞處于未分化狀態(tài)ES細(xì)胞培養(yǎng)用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed細(xì)胞的培養(yǎng)基（高糖）來(lái)阻止細(xì)胞的分化。為細(xì)胞

2、提供包被有0.1明膠的平板作為粘附細(xì)胞的基質(zhì)。建議每23天從達(dá)到8090融合的平板按1：8的比率傳代細(xì)胞一次，細(xì)胞傳代以后，在將細(xì)胞接種在0.1明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過(guò)預(yù)先將細(xì)胞接種在沒(méi)有經(jīng)過(guò)包被的組織培養(yǎng)板2個(gè)小時(shí)，使分化細(xì)胞粘附，從而將分化和未分化細(xì)胞分開(kāi)。將細(xì)胞全程置于37，5CO2，100濕度條件下培養(yǎng)。如果在Feed細(xì)胞，那么就需要采用MMC進(jìn)行處理，抑制Feed細(xì)胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暫不提及Feed細(xì)胞。Feed細(xì)胞可以來(lái)源于STO細(xì)胞或原代胚胎成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（該溶液也能用于EB培養(yǎng)基-

3、見(jiàn)下文）。分裝在50ml 離心管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20。通過(guò)將21ml該溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制備培養(yǎng)基，0.22 m濾膜過(guò)濾。貯存于4，時(shí)間不要超過(guò)2周。 貯存液          DMEM(高糖)          馬血清（HS）         &

4、#160;L-谷氨酰胺（200mM）          MEM NEAA（10mM）          HEPES（1M）          -巰基乙醇（55Mm）          PEST

5、0;         LIF         復(fù)蘇細(xì)胞細(xì)胞被凍存在10二甲基亞砜（DMSO）中防止結(jié)晶的形成，結(jié)晶的形成會(huì)損害細(xì)胞。然而，二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞有毒性，快速的進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇是很重要的。步驟：1從液氮中取出一管細(xì)胞；2將凍存管置于37水浴中2分鐘（或放到管內(nèi)溶液恰好完全溶解）；3將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一15ml Falcon管中；4加入5ml ES培養(yǎng)基（用培養(yǎng)基沖洗凍存管）；5離心3分鐘；6棄上清，用2ml ES培養(yǎng)基

6、重懸細(xì)胞，至少吹打10次；7接種在明膠包被（見(jiàn)下文）的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿；8孵育。凍存細(xì)胞凍存液90HS和10DMSO步驟：11×PBS洗細(xì)胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內(nèi)；2用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞；3將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml 離心管管內(nèi)并離心3分鐘；4棄去上清并將細(xì)胞重懸于冷的凍存液中（10 cm的培養(yǎng)皿用2ml，15cm的培養(yǎng)皿用67ml。）5分裝于凍存管內(nèi)，每管1ml；6置80過(guò)夜，第二天移入液氮。Geltin（明膠）包被準(zhǔn)備500ml 0.1geltin溶液1將0.5 g明膠溶解在500ml無(wú)鈣鎂的PBS中（5065水浴1530分鐘）。2最好在溶液沒(méi)有冷卻的情況下通過(guò)0.22 m濾膜過(guò)濾

7、，貯存在4。包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿1加入足量的明膠溶液覆蓋培養(yǎng)平面（15 cm培養(yǎng)皿加2ml，10 cm培養(yǎng)皿加0.51 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆蓋培養(yǎng)表面就行了。）；2置室溫30分鐘；3去除明膠溶液，將培養(yǎng)板貯存在包裝袋中室溫放置，最好將板子平放或倒扣，以免明膠污染蓋子和流出培養(yǎng)板。細(xì)胞傳代建議每2天傳代細(xì)胞一次，過(guò)度生長(zhǎng)的細(xì)胞會(huì)降低細(xì)胞的自然分化率，我們建立了一種純化方法來(lái)去除分化細(xì)胞，在將細(xì)胞接種在明膠包被的培養(yǎng)板上之前，通過(guò)將分化細(xì)胞黏附在沒(méi)有包被的組織培養(yǎng)板上去除分化細(xì)胞。純化步驟包含在下面的方法中。1去除培養(yǎng)液；2無(wú)鈣鎂PBS（Gibco）洗滌；3加入胰酶EDTA（Gibc

8、o）。37孵育5分鐘。4加入ES培養(yǎng)基使胰酶失活；5將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15 ml離心管中離心3min；6去除上清，將細(xì)胞重懸于2 ml ES培養(yǎng)基，至少吹打1020次。如果加入培養(yǎng)基的量較少會(huì)比較容易將細(xì)胞團(tuán)弄散分開(kāi)。ES細(xì)胞有聚集成團(tuán)的傾向，傳代過(guò)程中仔細(xì)將細(xì)胞弄散分開(kāi)很重要。這樣可能會(huì)減少細(xì)胞的自然分化。7將細(xì)胞接種在沒(méi)有包被的組織培養(yǎng)皿中（使用和一開(kāi)始同樣規(guī)格的培養(yǎng)皿）放入溫箱2小時(shí)（分化細(xì)胞在該時(shí)間內(nèi)將黏附，而ES細(xì)胞仍將保持懸浮）；8將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入geltin包被的組織培養(yǎng)皿。吹打以確保細(xì)胞被分散開(kāi)（前面已經(jīng)提到-ES細(xì)胞有聚集成團(tuán)的傾向）9建議按1：41：10的比率傳代 (ATCC

9、)保持細(xì)胞的傳代比率很重要，以我們的經(jīng)驗(yàn)，1：8的比率是好的，可以使細(xì)胞的自然分化降到最低。當(dāng)你使用不同規(guī)格的培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞傳代可以使用表1來(lái)計(jì)算傳代比率。體外分化胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)外可以分化為各種類型的細(xì)胞。我們的體外分化方法有利于神經(jīng)前體細(xì)胞通過(guò)在最少量的培養(yǎng)基內(nèi)選擇（第3步），在有bFGF存在的情況下擴(kuò)增（第4步）并最終分化在第5步。細(xì)胞全程培養(yǎng)在37，5CO2，100濕度條件下。一般體外誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，也可以采用低濃度的RA進(jìn)行誘導(dǎo)。時(shí)間線（總時(shí)間為2734天）第2步；41天 第3步；410天 第4步；4天 第5步；1015天 體外向心肌細(xì)胞方向分化胚胎干細(xì)胞在體外去除LIF情況

10、下會(huì)自然向心肌細(xì)胞方向分化，小鼠的R1系一般在第7-8天自然出現(xiàn)搏動(dòng)的心肌細(xì)胞，與胚胎發(fā)育時(shí)間線是完全一致的。培養(yǎng)基EB配制一20×不含DMEM，F(xiàn)BS，LIF的溶液（該溶液也能用于ES培養(yǎng)基-見(jiàn)前述）。分裝在50ml 離心管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20。將21ml該溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.2m濾膜過(guò)濾。貯存于4。 貯存液          DMEM(高糖)     &#

11、160;    胎牛血清          L-谷氨酰胺（200mM）          MEM NEAA（10mM）          HEPES（1M）        

12、0; -巰基乙醇（55Mm）          PEST（P104U/mlS104g/ml          ITSFn and N3（分化培養(yǎng)基）：配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分裝在15ml 離心管中，（稀釋為1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2m濾膜過(guò)濾，貯存在-20。將該溶液加入DMEM/F12中制備培養(yǎng)基，貯存于4。 貯存

13、液          DMEM(高糖)          轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/ml          胰島素5mg/ml          亞硒酸鈉300M    

14、;      黃體酮（20M）          腐胺（100M）          PEST（P104U/ml S104g/ml）          層粘連蛋白100g/ml     &#

15、160;    纖維連接蛋白250g/ml           堿性rhFGF, 10g/ml          *在第4步將bFGF加入N3培養(yǎng)基使終濃度為10ng/ml。ITSFn and N3培養(yǎng)基貯存液的準(zhǔn)備使用無(wú)菌的溶劑和稀釋液，在分裝之前要對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾，如果因?yàn)槟承┰蛉芤涸诜盅b之前沒(méi)有進(jìn)行過(guò)濾，需要在管子上標(biāo)明以便別人在使用時(shí)知道該溶液不能直

16、接用于細(xì)胞培養(yǎng)。貯存液  溶劑，貯存液，稀釋劑和儲(chǔ)存轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/ml  胰島素5mg/ml  亞硒酸鈉300M  黃體酮（20M）  腐胺（100M）  PEST（P104U/ml S104g/ml）  層粘連蛋白（100g/ml）  纖維連接蛋白（250g/ml ）  堿性rhFGF, （10g/ml）  包被有多聚鳥(niǎo)氨酸/纖維結(jié)合蛋白的培養(yǎng)板（使用或不使用蓋玻片）包被液的準(zhǔn)備多聚-L-賴

17、氨酸，15g/ml把75ml多聚-L-賴氨酸和425ml 1×PBS混合。貯存在4。纖維結(jié)合蛋白，1g/ml 把0.5ml纖維結(jié)合蛋白和500ml 1×PBS混合。包被過(guò)程：1加入多聚-L-賴氨酸，至少23小時(shí)（過(guò)夜也行）2吸出多聚-L-賴氨酸3加入纖維結(jié)合蛋白，大約12小時(shí)4吸出纖維結(jié)合蛋白，放置30分鐘晾干5貯存在424孔板用200l，6孔板用500l。震蕩培養(yǎng)板確保溶液能夠覆蓋蓋玻片或培養(yǎng)孔。有時(shí)需要?jiǎng)×艺鹗幣囵B(yǎng)板。體外分化方法第1步：ES培養(yǎng)基在LIF存在的條件下維持細(xì)胞培養(yǎng)第2步：EB培養(yǎng)基使用細(xì)菌培養(yǎng)皿去除LIF后胚狀體的形成需要4天。1分散純化細(xì)胞（參見(jiàn)上面的

18、細(xì)胞傳代部分）2純化2小時(shí)后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有ES培養(yǎng)基的50ml Falcon管中，計(jì)數(shù)細(xì)胞取適量體積放入15ml管中離心3分鐘。3用2mlEB培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打至少10次制成單細(xì)胞懸液4一個(gè)15cm的細(xì)菌培養(yǎng)皿接種45×106個(gè)細(xì)胞（1個(gè)完全融合的組織培養(yǎng)皿通常足以接種4個(gè)同樣規(guī)格的細(xì)菌培養(yǎng)皿）。52天后更換培養(yǎng)基 將胚狀體轉(zhuǎn)入錐形管中放置35分鐘使細(xì)胞沉降。棄去上清，將細(xì)胞重懸于新鮮培養(yǎng)基并接種在新的細(xì)菌培養(yǎng)皿中。6用EB培養(yǎng)基培養(yǎng)的第4天將細(xì)胞轉(zhuǎn)入沒(méi)有包被的組織培養(yǎng)皿中（這即是細(xì)胞的移植步驟）。1個(gè)組織培養(yǎng)皿之中放置1個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)皿，在進(jìn)行第3步之前一天將胚狀體黏附在同樣規(guī)格的培

19、養(yǎng)板上。形成胚狀體需要4天時(shí)間。在EB培養(yǎng)基中再培養(yǎng)1天使胚狀體粘附在組織培養(yǎng)皿的表面。這一天被認(rèn)為是第2步和第3步的分界。第3步-ITSFn培養(yǎng)基在最少量培養(yǎng)基中選擇神經(jīng)前體細(xì)胞1在胚狀體接種在組織培養(yǎng)皿一天后將培養(yǎng)基換成ITSFn培養(yǎng)基2并非所有胚狀體在這一時(shí)期都已經(jīng)發(fā)生粘附，因此在移除培養(yǎng)基時(shí)要小心謹(jǐn)慎以使大部分胚狀體留在培養(yǎng)皿內(nèi)。3保持細(xì)胞在ITSFn中培養(yǎng)大約10天，根據(jù)需要更換培養(yǎng)基-大約每隔一天。觀察細(xì)胞形態(tài)，神經(jīng)樣細(xì)胞大約出現(xiàn)在第4到第7天。當(dāng)神經(jīng)樣細(xì)胞能夠被鑒別時(shí)，轉(zhuǎn)入到第4步。步驟的轉(zhuǎn)換應(yīng)該在神經(jīng)前體細(xì)胞出現(xiàn)第一個(gè)清晰的標(biāo)志幾天以后，通常是在第3步的第6到第10天。第4步N

20、3培養(yǎng)基bFGF通過(guò)將神經(jīng)前體細(xì)胞培養(yǎng)在含有10ng/ml bFGF的培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。1.PBS洗滌，加入1-2ml 胰酶237孵育5分鐘3用4mlEB培養(yǎng)基終止胰酶活性，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入錐形管中放置35分鐘移出細(xì)胞團(tuán)，將上清移入一新的離心管離心。4將細(xì)胞重懸于含有bFGF的N3培養(yǎng)基。5將細(xì)胞接種在包被多聚-L-鳥(niǎo)氨酸/纖維連接蛋白的蓋玻片上（最好將蓋玻片放于24孔培養(yǎng)板或6孔培養(yǎng)板，6孔培養(yǎng)板中每孔放置5個(gè)蓋玻片如果是塑料的放置4個(gè)，以使最大可能的獲得樣品數(shù)量）。24孔板接種3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。62天后更換培養(yǎng)基第5步N3培養(yǎng)基通過(guò)撤除bFGF使神經(jīng)前體細(xì)胞分化1細(xì)胞被接種在蓋玻片上4天后將培養(yǎng)基換成不含bFGF的N3培養(yǎng)基2根據(jù)需要換液（大約每隔一天）3分化1015天后固定細(xì)胞移除培養(yǎng)基PBS洗滌加入4%福爾馬