胚胎干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的研究現(xiàn)狀與展望

1、胚胎干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的研究現(xiàn)狀與展望         10-05-03 09:40:00     作者：江斌， 陳鴻輝    編輯：studa20【摘要】  胚胎干細(xì)胞具有多向分化潛能，在組織修復(fù)治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。近年研究表明，胚胎干細(xì)胞在細(xì)胞因子、激素、微環(huán)境等作用下能夠分化為軟骨細(xì)胞。本文對近年來胚胎干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞定向分化中的各種因素進(jìn)行綜述。 【關(guān)鍵詞】  胚胎干細(xì)胞； 軟骨細(xì)胞； 分化

2、0;   Abstract：Embryonic stem cell possess multidirectional differentiation capacity and can differentiate into all sorts of cells of three germ layers, it has the widely use in the treatment of tissue repair. Recent study shows that,embryonic stem cells can differentiate into cartilage cel

3、ls in the effect of cytokines,hormones,microenvironment etc. In the is review,the author explore several studies and review the effects of different factors to the differentiation of embryonic stem cell to chondrocyte.    Key words：embryonic stem cell;  chondrocyte;  differe

4、ntionation    關(guān)節(jié)軟骨因損傷而導(dǎo)致衰退，甚至發(fā)生退行性關(guān)節(jié)炎。有近70的65歲以上老年人受退行性關(guān)節(jié)炎的影響。由于沒有神經(jīng)和血管分布，軟骨雖然有一定的自我修復(fù)能力，但是大于5 mm以上的局部軟骨損傷就不能進(jìn)行自我修復(fù)了，關(guān)節(jié)炎類軟骨疾病一直不能得到很好的手術(shù)治療。軟骨組織的傳統(tǒng)修復(fù)方法是自體組織分離的軟骨細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)，但是卻面臨著成熟軟骨組織擴增能力有限，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞逐漸老化而喪失增殖能力，難以滿足組織構(gòu)建需要和逐漸喪失其原有特性而分化成其他組織的問題。而胚胎干細(xì)胞(ES)和骨髓干細(xì)胞(MS)具有自我更新和多功能分化潛能的特性，在適當(dāng)培

5、養(yǎng)條件下可被誘導(dǎo)分化成軟骨組織，其通過體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)(SCNT)有可能提供無免疫原性的“通用型”種子細(xì)胞，并同時排除倫理學(xué)問題，這將為軟骨疾病的治療提供大量的健康備用組織。相對MS細(xì)胞ES細(xì)胞有巨大的增殖潛力，顯著的分化成為軟骨細(xì)胞的能力和在體外能自發(fā)分化成為軟骨或者骨細(xì)胞1，因此有理由認(rèn)為胚胎干細(xì)胞在軟骨組織工程中細(xì)胞來源是一個長遠(yuǎn)時期的最佳選擇。1  胚胎干細(xì)胞    1.1  胚胎干細(xì)胞的概念    1981年美國科學(xué)家Evans、Kaufman從小鼠胚胎中分離出胚胎干細(xì)胞并成功建系2，他們的研究被公認(rèn)為最

6、早的對胚胎干細(xì)胞進(jìn)行的研究。  1998年Thomson、Gearhrt利用內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和原始生殖細(xì)胞分別建立了人胚胎干細(xì)胞系，從此掀開了胚胎干細(xì)胞研究新的一頁3。胚胎干細(xì)胞是一種高度未分化細(xì)胞，它具有發(fā)育全能性，可以分化為成體中所有的組織和器官。    1.2  胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性    (1)全能性，體外培養(yǎng)的條件下，可分化為內(nèi)、中、外3個原始胚層來源的全部細(xì)胞類型；(2)無限增殖性；(3)胚胎干細(xì)胞易于進(jìn)行基因改造操作；(4)胚胎干細(xì)胞保留正常2倍體的性質(zhì)且核型正常；(5)高端粒酶活性。有報道ES細(xì)胞培養(yǎng)1年

7、，繁殖300代后仍具有高端粒酶活性。    1.3  胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的過程    胚胎干細(xì)胞逆軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化大致經(jīng)歷的過程：首先把胚胎干細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液，使其擺脫滋養(yǎng)層細(xì)胞。在無黏性附性的懸浮液中生長，ES細(xì)胞就會發(fā)育成為類胚體(EBs)。然后類胚體在一些細(xì)胞因子、生長因子及化學(xué)物質(zhì)的誘導(dǎo)條件下形成中胚層細(xì)胞，隨后未分化的中胚層間充質(zhì)細(xì)胞形成軟骨祖細(xì)胞，軟骨祖細(xì)胞經(jīng)過化學(xué)趨化、聚集、增殖成為成軟骨細(xì)胞(分為肥大和鈣化軟骨細(xì)胞)，最后成軟骨細(xì)胞合成胞外基質(zhì)最終分化成為軟骨和骨。  

8、0; 2  胚胎干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞定向分化的主要影響因素    誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向特定細(xì)胞分化是目前的難點。胚胎干細(xì)胞的研究主要集中在神經(jīng)、血液和血管內(nèi)皮等細(xì)胞的分化，而向軟骨細(xì)胞分化的研究相對比較少，近年來ESC向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化方面的研究已經(jīng)成為一個熱點。而在胚胎干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化中外基質(zhì)的組成、電荷性質(zhì)、表面粗糙度以及幾何構(gòu)型都對軟骨的生長有很大的影響，其主要影響因素有：    2.1  細(xì)胞所處的培養(yǎng)環(huán)境    體內(nèi)機械條件在胚胎干細(xì)胞移植關(guān)節(jié)的軟骨組織形態(tài)里面起著很重要的作用。不同

9、的培養(yǎng)環(huán)境對軟骨細(xì)胞的分化和純度影響差別很大，相對來說3D環(huán)境更適合于軟骨細(xì)胞的生長。到目前為止ES向軟骨細(xì)胞分化已經(jīng)在2D培養(yǎng)基、微團(tuán)培養(yǎng)基、小球培養(yǎng)基中完成。而有相關(guān)研究將細(xì)胞包被在水凝膠4，5或薄的生物材料中再一次證明了3D環(huán)境更加適合軟骨形成。最近Jukes JM6發(fā)現(xiàn)了一個更新、更好的4 mm厚的PEOTPBT 3D混合共聚物軟骨支架做為關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的支架。除了這些外，體內(nèi)的機械條件的改變也會對胚胎干細(xì)胞移植到軟骨組織形態(tài)產(chǎn)生很大的影響。Nakajima M7用ES細(xì)胞對兔的髕骨軟骨全層缺損進(jìn)行移植，移植后將其分為關(guān)節(jié)活動組和關(guān)節(jié)固定組，在術(shù)后3周發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)活動組形成了巨大的畸胎瘤。&

10、#160;   2.2  細(xì)胞因子及生長因子    軟骨細(xì)胞分化通過許多生長因子、細(xì)胞因子和分子信號進(jìn)行調(diào)節(jié)。不同生長因子對產(chǎn)生軟骨細(xì)胞的能力不同。Koay8在EBs細(xì)胞中添加TGF-D 3和BMP-2時產(chǎn)生具有高度膠原I型組織的纖維軟骨結(jié)構(gòu)，相反的TGF-3+TGF-1+IGF-I產(chǎn)生的組織結(jié)構(gòu)不含I型膠原。而骨形成蛋白家族BMPs和SOX9在促進(jìn)軟骨分化和增殖中起著很重要的作用。Kramer研究中9發(fā)現(xiàn)了類胚體培養(yǎng)基中加入BMP2、BMP4，軟骨小瘤的數(shù)量會增加。BMP2、4在軟骨形成早期促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和成熟，維持軟骨細(xì)胞的表

11、型，還可以抑制軟骨細(xì)胞的過度分化。Toh WS 10也證明了BMP2能提高軟骨細(xì)胞的分化和影響EB細(xì)胞分化的方向。而在胚胎發(fā)育的過程中，軟骨前體細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞都表達(dá)SOX9。體外ES細(xì)胞失去SOX9功能后導(dǎo)致分化軟骨細(xì)胞缺陷11，而異位SOX9的表達(dá)可以使非軟骨組織表達(dá)col-、SOX基因家族的另外兩個成員L-SOX5、SOX6和SOX9聯(lián)合作用可以成功誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，此誘導(dǎo)不受培養(yǎng)條件的影響，同時還抑制肥大細(xì)胞和造骨細(xì)胞的分化過程12；而白介素-1(IL-1)就通過降低SOX9和COL2a表達(dá)，從而抑制軟骨分化13。Wnt蛋白家族在胚胎的發(fā)育和分化中起重要的作用。Derfou

12、l等14通過基因轉(zhuǎn)染使鼠胚胎間充質(zhì)系C3HIOTl2表達(dá)Wnt-3a，他們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)高堿性磷酸酶活性，而且Wnt-3a能顯著抑制其他成骨的標(biāo)志基因如骨唾液蛋白、骨橋蛋白基因的表達(dá)。Smad基因家族是新進(jìn)發(fā)現(xiàn)的一個重要的新基因家族。TGF-轉(zhuǎn)化生長因子對軟骨細(xì)胞分化有重要的誘導(dǎo)作用，而Smad通過影響TOF-以達(dá)到調(diào)控軟骨細(xì)胞分化的作用。Runx2家族主要在骨軟骨形成中發(fā)揮作用，是軟骨細(xì)胞與造骨細(xì)胞分化晚期的一個潛在的誘導(dǎo)者15。Runx2通過維持啟動早期軟骨細(xì)胞分化來促進(jìn)軟骨發(fā)生。除此以外，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)家族以及胰島素樣生長因子(IGF)16家族也有誘導(dǎo)ES向骨組織分化的能

13、力。而Greco SJ17最新發(fā)現(xiàn)胚胎轉(zhuǎn)錄因子OCT4在ESCs中促進(jìn)ESCs特殊基因型的表達(dá)和調(diào)節(jié)ESCs細(xì)胞分裂周期。    2.3  其他誘導(dǎo)物在軟骨發(fā)生中的誘導(dǎo)作用    其他誘導(dǎo)物如地塞米松、甲狀腺素、前列腺素E2和抗壞血酸等也被證實可引發(fā)軟骨形成。Vc被證實是體外培養(yǎng)細(xì)胞合成膠原的必備物質(zhì)，并能調(diào)節(jié)ATP酶活性及蛋白的合成。  -磷酸甘油作為堿性磷酸酶的底物，可為成骨細(xì)胞提供磷離子。1，25-二羥3也能引發(fā)軟骨形成18。還有研究證實，在含有牛血清(FCS)的培養(yǎng)液中，ES細(xì)胞就能分化為軟骨細(xì)胞，而不用添

14、加任何特殊的生長因子。而Zur Nieden19研究發(fā)現(xiàn)，視黃酸(retinoicacid)加上TGF -3和甲狀旁腺可以增加成軟骨化。與細(xì)胞因子及生長因子類誘導(dǎo)物相比，化學(xué)誘導(dǎo)物的成分確定，作用也更為穩(wěn)定，可以持續(xù)幾天至幾周，其對軟骨細(xì)胞分化的作用也是至關(guān)重要的。另外還有些胞外基質(zhì)如粘多糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等通過介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分化和成熟。    3  中藥有效成份促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化的作用    除了上述細(xì)胞因子、生長因子等誘導(dǎo)物外，許多中醫(yī)中藥的有效成份在促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化的過程中也發(fā)揮著一定的作用。國內(nèi)曾經(jīng)報道補腎健骨湯能夠減少關(guān)節(jié)滑液分泌，在軟骨破壞區(qū)出現(xiàn)大量幼稚軟骨細(xì)胞，確有修復(fù)軟骨作用。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)中藥軟骨細(xì)胞的增殖