microRNA(miRNA)莖環(huán)法引物設計及過程原理說明

1、microRNA（miRNA）引物設計及過程原理說明microRNAs的平均長度23nt左右，所以miRNA引物設計與常規(guī)引物設計存在很大差別，以下講解一下整個miRNA引物設計的過程加上實驗流程，以幫助大家對各方面的學習。首先，引物設計之前先介紹miRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的過程。我們拿經(jīng)典頸環(huán)序列GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC作介紹。打開DNAstar軟件的PrimerSelect；file打開下拉菜單；打開Enter New Primer；粘貼頸環(huán)序列；點擊OK。頸環(huán)結(jié)構(gòu)已經(jīng)輸入，下面查看頸環(huán)結(jié)構(gòu)回形成的那些發(fā)夾結(jié)構(gòu)。選擇頸環(huán)結(jié)構(gòu)

2、（鼠標點一下）；點擊Report下拉菜單；選擇Primer Hairpins。第一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)是實驗所需的結(jié)構(gòu)(dG=-20.4kc/m)。下面結(jié)合has-miR-122-5P合成cDNA的具體過程講解has-miR-122-5P：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU將U轉(zhuǎn)T，方便后面使用：TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTmiRNAs的頸環(huán)結(jié)構(gòu)引物：是將miRNAs的3端后6位堿基反向互補添加到經(jīng)典頸環(huán)結(jié)構(gòu)的3端形成的結(jié)構(gòu)。(自己根據(jù)后面圖片想一下原因，加6個堿基為經(jīng)驗所授)has-miR-122-5P的后6位：GTTTGThas-miR-122-5P的后6位的反向互補序

3、列：ACAAAC頸環(huán)引物序列：5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAC -3查看形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（方法前面有講）看一下miRNA和頸環(huán)引物在一起會是怎么樣子：在含反轉(zhuǎn)錄酶及適當?shù)臈l件下，miRNA和其頸環(huán)引物將會合成cDNA鏈：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAACACCATTGTCACACTCCA查看cDNA結(jié)構(gòu)：我們知道了cDNA的合成過程和序列，同時學習了miRNA的反轉(zhuǎn)錄過程。下面進入重頭戲，教大家如何進行miRNA引物設計。首先如果你的前面實驗是芯片的就在miR

4、base上再查看核對一遍，如果是測序?qū)嶒灥男枰獙iRNA的名字3p或5p及之前的部分復制到miRAN上查找完整序列。將得到的miRNA完整序列復制到一個excel表中，然后使用查找替換將U改為T（一定要記住改換，要不然primer5.0是不認U的）。為了后面引物設計方便，需要以miRNA序列構(gòu)建引物，所以需要將miRNA的cDNA的反向互補序列找出。使用primer5.0。打開File下拉菜單；New；DNA Sequence。由于正規(guī)設計過程中不會先把cDNA序列找出來，所以直接操作過程為先將miRNA序列（U改T）輸入，再輸入頸環(huán)結(jié)構(gòu)序列的反向互補序列。復制miRNA序列（U改T）；點擊

5、primer5.0序列框，使用組合鍵“Ctrl+V”粘貼序列；選擇正向序列。復制頸環(huán)結(jié)構(gòu)序列；點擊primer5.0序列框，使用組合鍵“Ctrl+V”粘貼序列；選擇反向互補序列輸入Reverse Complemented。到這一歩cDNA的反向互補序列已經(jīng)輸入完畢，下一歩是在primer5.0上進行引物設計。1. 在序列前面輸入9個N（這個是個人習慣，也有人是6個或以上的A，也有人是不輸入就直接設計引物的），因為miRNA序列太短，很多時候不能設計出符合實驗需要的miRNA，所以在設計正向引物時，一般需要加入3-6個堿基，最多時加入8個堿基，以滿足正向引物的設計；2. 點擊Function框下

6、的Primer，開始設計上下游引物；3. 有經(jīng)典頸環(huán)結(jié)構(gòu)自然也就少不了常用的下游引物，一般使用CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT;CGCAGGGTCCGAGGTATTC。同時還可以適當?shù)脑陬i環(huán)序列中前后移動堿基設計下游引物；4. 自動跳出的顯示框中默認選擇的是下游引物，正好符合先將常用下游引物輸入的操作。下游引物相當比較固定，先輸入下游引物對整個引物設計能夠提高設計效率。5. 點擊框內(nèi)的Edit Primers；選擇所有引物序列；使用組合鍵“Ctrl+V”輸入下游引物，輸入方式為反向輸入Reversed；點擊OK；點擊Analyze分析引物基本信息；點擊Prime尋找引物在序列里結(jié)合部位

7、；點擊OK確定下游引物；6. 點擊上下游轉(zhuǎn)換鍵（圖示），開始設計上游引物；點擊Edit Primers；7. 去除前面的9個N；點擊Analyze；點擊prime；查看前面不添加序列時的上游引物狀況如何。在這里的主要問題是Tm值太低，第二個問題是長度稍短。8. 絕大多數(shù)情況下在前邊添加的序列已GC為主，且在加GC序列時如果序列中間不以AT隔開則TM值上升比值高，同理加AT序列。不要出現(xiàn)GCGC、ATAT、GCCG、或連續(xù)4個不同的核苷酸，這些失誤會造成引物評分的降低。個人喜歡加CGGGC、GCGGGC、A/TGCCCG等。9. 例如加入ACGGGC（5端加入，別在3端）；點擊Analyze；點

8、擊prime；查看引物的長度和TM值差不多了就行。當然不是全行了，還要查看引物的自身頸環(huán)結(jié)構(gòu)，自身引物配對，重要指標為dG（當然還有其他，哈哈）。下游引物不用看了，因為是經(jīng)典嘛，呵呵。點擊OK。10. 再查看一下引物對之間的匹對情況，加以對上游引物的修改，或者更換下游引物。有必要點擊比對框下的All查看所以的匹對情況，呵呵，希望你懂的。11. 想做好實驗的同學可以在DNAstar的PrimerSelect中進一步查看引物對的狀況，因為這兩款軟件讓人感覺還是有很大不同的。例如PrimerSelect中引物的Tm值會比primer5.0中底5.5度左右（自己可以試一下）；同時PrimerSelect中對5端中的匹對情況比較放松（可以用經(jīng)典下游引物CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT看一下）；primer5.0中有的dimer在更