細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)

1、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌屋凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征2、學(xué)會(huì)用熒光探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)記來檢測(cè)正常活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的方法 二、實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞死亡根據(jù)其性質(zhì)、 起源及生物學(xué)意義區(qū)分為凋亡和壞死兩種 不同類型。 凋亡普遍存在于生命界， 在生物個(gè)體和生存中起著非 常重要的作用。 它是細(xì)胞在一定生理?xiàng)l件下一系列順序發(fā)生事件 的組合， 是細(xì)胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過程。 細(xì) 胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。在形態(tài)上可見凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞脫離接觸， 細(xì)胞變園， 細(xì)胞膜 向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞核固縮破裂呈團(tuán)塊狀或 新月狀分布、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜進(jìn)一步融合將細(xì)

2、胞分成多個(gè)完整包 裹的凋亡小體， 凋亡小體最后被吞噬細(xì)胞吞噬消化。 在凋亡過程 中細(xì)胞內(nèi)容物并不釋放到細(xì)胞外， 不會(huì)影響其它細(xì)胞， 因而不引 起炎癥反應(yīng)。在生物化學(xué)上， 多數(shù)細(xì)胞凋亡的過程中， 內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活化， 活性增加。核 DNA 隨機(jī)地在核小體的連接部位被酶切斷，降解 為 180-200bp 或它的整倍數(shù)的各種片斷。 如果對(duì)核 DNA 進(jìn)行瓊 脂糖電泳，可顯示以 180-200bp 為基數(shù)的 DNAladder （梯狀帶 紋）的特征。相比之下， 壞死是細(xì)胞處于劇烈損傷條件下發(fā)生的細(xì)胞死亡。 細(xì) 胞在壞死早期即喪失質(zhì)膜完整性， 各種細(xì)胞器膨脹， 進(jìn)而質(zhì)膜崩 解釋放出其中的內(nèi)容物， 引起

3、炎癥反應(yīng)， 壞死過程中細(xì)胞核 DNA雖也降解，但由于存在各種長度不等的 DNA 片斷，不能形成梯 狀帶紋，而呈彌散狀。一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡， 通常這 些因素在誘導(dǎo)凋亡的同時(shí)， 也可產(chǎn)生細(xì)胞壞死， 這取決于損傷的 劇烈程度和細(xì)胞本身對(duì)刺激的敏感程度。三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對(duì)急性粒細(xì)胞白血病，0.025急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明 HT 在u g/m范圍內(nèi)作用2小時(shí)，即可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。 本實(shí)驗(yàn)用1 u g/mlHT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60 細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)也有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生壞死。用Hoechst33

4、342 和碘化丙啶（propidiumiodide ， PI）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細(xì)胞。細(xì)胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如 PI 等不能穿過質(zhì)膜。當(dāng)細(xì)胞壞死時(shí)，質(zhì)膜不完整， PI 就進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，它可嵌入到 DNA 或 RNA中，使壞死細(xì)胞著色，凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞培養(yǎng)基在37 C,5%CO2 條件下培養(yǎng)。不著色。 而一些活細(xì)胞染料由于為親脂性物質(zhì)， 可跨膜進(jìn)入活細(xì) 胞，因而可進(jìn)行活細(xì)胞染色。 Hoechst33342 是一種活性熒光染 料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與 DNA 特異結(jié) 合（主要結(jié)合于 A-T ）堿基區(qū)），顯示凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。凡是 看到

5、有凋亡小體的細(xì)胞都是凋亡細(xì)胞。三、實(shí)驗(yàn)用品1、試劑：三尖杉酯堿（HT） , 300 U g/m, 100mmol/LTris-HCIpH7.5 ）， 5mol/LEDTA 緩沖液、堿性裂解液：0.2mol/LNaOH,1%SDS 、醋酸鈉： 3mol/LKAc （ pH4.8 ）；異丙 醇； 70%乙醇；溴酚藍(lán)，蔗糖指示劑。 TBE 電泳緩沖液， 1%瓊脂糖，溴乙錠。PI母液：500卩g/ml; Ho33342母液：2mmol/L。2、儀器設(shè)備：熒光顯微鏡，電泳儀，電泳槽，微量加樣器（1ml, 100al0.5、 1.5ml 離心管，載玻片，蓋玻片。四、實(shí)驗(yàn)材料人早幼粒白血病HL-60 細(xì)胞，

6、用含 1 0%小牛血清的 RPMI1640五、方法步驟1、三尖杉酯堿誘發(fā) HL-60 細(xì)胞凋亡(1 )實(shí)驗(yàn)前約24小時(shí)，接種兩瓶HL-60細(xì)胞，標(biāo)記、，每瓶含約6ml培養(yǎng)液，置37 C, 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2)實(shí)驗(yàn)前約 2.5 小時(shí)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 70% ，號(hào)瓶加入三尖杉酯堿2001使終濃度為1卩g/ml,號(hào)瓶中加入同等量PBS(pH7.4 )作對(duì)照。共同放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5 小時(shí)。2、 Ho33342 和 PI 雙重染色鑒別三種細(xì)胞(1)染色：將瓶中的細(xì)胞搖勻取 200 于1.5ml的離心管中，加入HO33342母液2卩,P120卩,染色15分鐘。2)滴片：取一載玻片用雙面膠圍成

7、一小室，從離心管中各取以上染色后的細(xì)胞懸液 10卩l(xiāng)加入小室內(nèi)蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發(fā)光，高倍鏡下觀察，區(qū)別三種細(xì)胞，并注意三者 比例。1. 誘導(dǎo)培養(yǎng) HL-60 細(xì)胞時(shí)間要準(zhǔn)確；2.熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞時(shí)，由于熒光易碎滅，觀察時(shí)要盡量快。其 細(xì)胞死亡根據(jù)其性質(zhì)、起源及生物學(xué)意義區(qū)分為凋亡和壞死他 兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個(gè)體和生存中起著非常重要的作用。它是細(xì)胞在一定生理?xiàng)l件下一系列順序發(fā)生事件的組合，是細(xì)胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過程。細(xì)胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。在形態(tài)上可見凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞脫離接觸，細(xì)胞變園，細(xì)胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

8、擴(kuò)張、細(xì)胞核固縮破裂呈團(tuán)塊狀或新月狀分布、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜進(jìn)一步融合將細(xì)胞分成多個(gè)完整包裹的凋亡小體，凋亡小體最后被吞噬細(xì)胞吞噬消化。在凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)容物并不釋放到細(xì)胞外，不會(huì)影響其它細(xì)胞，因而不引起炎癥反應(yīng)。在生物化學(xué)上，多數(shù)細(xì)胞凋亡的過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活化，活性增加。核 DNA 隨機(jī)地在核小體的連接部位被酶切斷， 降解為 180-200bp 或它的整倍數(shù)的各種片斷。如果對(duì)核 DNA 進(jìn)行瓊脂糖電泳，可顯示以 180-200bp 為基數(shù)的DNAladder （梯狀帶紋）的特征。相比之下，壞死是細(xì)胞處于劇烈損傷條件下發(fā)生的細(xì)胞死亡。細(xì)胞在壞死早期即喪失質(zhì)膜完整性，各種細(xì)胞器膨脹，進(jìn)而質(zhì)膜崩解釋放出其中的內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)，壞