體細(xì)胞的反轉(zhuǎn)座子改變了人類大腦的遺傳景觀

1、體細(xì)胞的反轉(zhuǎn)座子改變了人類大腦的遺傳景觀摘要反轉(zhuǎn)座子是可移動(dòng)的遺傳元素，使用“復(fù)制-粘貼”的機(jī)制遍布到后生動(dòng)物的基因組中，至少50%的人類基因來自反轉(zhuǎn)座子，有三個(gè)活躍家族（l1，AluandSVA)與插入的突變和疾病基因有關(guān)。體細(xì)胞中表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄后會(huì)抑制反轉(zhuǎn)座子區(qū)，除了胚胎早期發(fā)育細(xì)胞和一些惡性腫瘤細(xì)胞。近期的報(bào)告呈人類大腦中l(wèi)1的表達(dá)和拷貝數(shù)變異表明l1動(dòng)員也可能出現(xiàn)在后期的發(fā)展中。然而，相應(yīng)的綜合位點(diǎn)并沒被反映出來（基因的確定位置）。此時(shí)我們運(yùn)用一種高通量的方法去識(shí)別大量的l1，AluandSVA的種系突變，即就是將我們假定的l1體細(xì)胞7743分別插入到三個(gè)人的海馬體和尾狀核中，出人意料

2、的是我們分別在13692和1350體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)插入了Alu和SVA。我們的結(jié)果表明在人腦中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子動(dòng)員蛋白質(zhì)編碼基因產(chǎn)生了不同的表達(dá)活性。如此一來由反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子驅(qū)動(dòng)的體細(xì)胞基因組鑲嵌性可能重塑基因的電路來支撐正常的或不正常的神經(jīng)生物學(xué)過程。惡性腫瘤與衰老通常與毒性突變的積累有關(guān)從而導(dǎo)致功能喪失，細(xì)胞死亡或者失控生長(zhǎng)。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是明顯的誘變劑，據(jù)估計(jì)4億種反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子派生的結(jié)構(gòu)變異存在于全球人口中和超過70種涉及了遺傳和新合成反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子事件的疾病中。可能因轉(zhuǎn)座子能力的原因反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子大量甲基化和大量轉(zhuǎn)錄滅活。然而在神經(jīng)細(xì)胞系中已經(jīng)檢測(cè)到大量的體細(xì)胞L1反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。考慮到哺乳類動(dòng)物大腦組

3、織復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能以及它的自適應(yīng)和再生能力還有神經(jīng)生物學(xué)失常未找到的的病因，想必這些體細(xì)胞L1的插入可能有重大意義。觀察到大腦中的置換活動(dòng)有一種解釋大概是L1啟動(dòng)子會(huì)短暫釋放從神經(jīng)發(fā)生的表觀遺傳抑制期間。L1轉(zhuǎn)換能力可以反復(fù)地動(dòng)員不同的個(gè)人位點(diǎn)細(xì)胞來產(chǎn)生體細(xì)胞鑲嵌性。多方面證據(jù)支持這個(gè)模型，比如在不同年齡捐助者的大腦組織中的L1轉(zhuǎn)錄和拷貝數(shù)變異（CNV）以及動(dòng)員在轉(zhuǎn)基因老鼠體外設(shè)計(jì)的L1。重點(diǎn)是現(xiàn)在也不知道體細(xì)胞L1插入后將在基因組中的哪里出現(xiàn)，考慮到開放的核染色質(zhì)容易L1集成，這些事件中的無論哪一件都不同程度的影響大腦中蛋白編碼基因座的表達(dá)。在不同的細(xì)胞群中映射出個(gè)人逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子事件共同形成

4、一個(gè)體細(xì)胞鑲嵌現(xiàn)象，最有挑戰(zhàn)的是每個(gè)突變的稀有等位基因。我們因此開發(fā)一種高通量的協(xié)議被稱為逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子測(cè)序。首先片段的基因組DNA是雜化自定義序列捕獲完整的L1，Alu和SVA逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的目標(biāo)數(shù)組53末端（如圖1a）。穩(wěn)定的ERVK和ERVILTR基礎(chǔ)作為負(fù)性的控制。其次，捕獲測(cè)序的DNA，每101單體單元序列樣本可生成25億個(gè)雙末端 (如圖1b)。最后設(shè)計(jì)保守的計(jì)算途徑去識(shí)別被映射的測(cè)序?qū)?如圖1c&d)。如下圖所示：Figure 1:整體RC-seq方法（a） 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子捕獲：剪切基因組DNA雜化特定的嵌合芯片探測(cè)反轉(zhuǎn)位子活動(dòng)（淺藍(lán)色背景可高亮顯示核苷酸）（b） 測(cè)序：雜交后，

5、用Illumina公司定序器篩選和分析DNA片段，在每一個(gè)基因序列中雙末端測(cè)序2.5*107bp，隨后配對(duì)到參照基因組中。（c） 測(cè)定的序列映射出一對(duì)單一的基因座顯示出已知的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入。（d） 測(cè)定的未配對(duì)序列的末端映射出單一的基因座和其他的末端映射出遠(yuǎn)端的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，顯示出新穎的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子事件。先前的工作相當(dāng)于在體外體細(xì)胞動(dòng)員L1拷貝數(shù)變異。為了L1的拷貝數(shù)變異我們用RC-seq來檢驗(yàn)這個(gè)假想，首先從三個(gè)捐獻(xiàn)者中（A,B&C）各選取5個(gè)大腦分區(qū)。一個(gè)顯著增加的是我們?cè)诰璜I(xiàn)者C的海馬體DNA提取物中觀察到大量的L1 ORF2基因的復(fù)制, 類似于捐獻(xiàn)者A，盡管A是小規(guī)模增加（如

6、圖2）。使用三個(gè)捐獻(xiàn)者的樣本將RC-seq運(yùn)用到他們大腦的5個(gè)分區(qū)中，其展示出最高和最低的L1拷貝數(shù)變異，包括捐獻(xiàn)者A尾狀核的技術(shù)復(fù)制。在七個(gè)基因庫(kù)中，總共有1.774億個(gè)序列雙末端用高通量轉(zhuǎn)錄組分析（RC-seq）而生成。RC-seq實(shí)現(xiàn)了深度分析其覆蓋了已知活躍的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，高度的重復(fù)性和有限序列的捕獲偏差。 圖2.在人腦中用多樣的定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來證實(shí)L1拷貝數(shù)變異。 L1開放閱讀框2的相對(duì)豐度對(duì)a衛(wèi)星重復(fù)序列使用基于現(xiàn)有的 TaqMan方法而被定量化。分析化驗(yàn)來自三個(gè)捐獻(xiàn)者的大腦的五個(gè) 區(qū)域的基因組 DNA（A,B&C）。海馬體（Hi）；硬膜（Pu）；顳中 回（TG）；尾狀

7、核（Ca）;額中回（FG）。價(jià)值是使每個(gè)捐獻(xiàn)者的 尾狀核正常化。這種誤差線相當(dāng)于一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。對(duì)每一個(gè)捐獻(xiàn)者 用重復(fù)測(cè)量的方法進(jìn)行方差分析其p<0.001，隨后成對(duì)比較調(diào)整最 小顯著差。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入的序列對(duì)的診斷結(jié)論是以插入位點(diǎn)，相對(duì)走向和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子家族為基礎(chǔ)而聚合叢生?？偣灿?5229個(gè)集群生成。近側(cè)的集群。近端集群排列在對(duì)位鏈上表明了兩個(gè)目的，位點(diǎn)插入并配對(duì)，結(jié)果產(chǎn)生24540個(gè)異常插入目錄。毫不奇怪的是，這絕大多數(shù)都是L1（32.2%）或者是Alu(60.9%)。從其他實(shí)驗(yàn)對(duì)象中隔離種系突變，我們結(jié)合可用的三大目錄L1和Alu多態(tài)性作為一個(gè)注記庫(kù)并在從提取的人全血基因組DNA上

8、執(zhí)行RC-seq，有6150個(gè)集群生成并被現(xiàn)有的大腦集群RC-seq所分割。來自超過一個(gè)地區(qū)或個(gè)人的任何大腦集群都容納了高通量轉(zhuǎn)錄組分析序列，重疊血液的高通量轉(zhuǎn)錄組分析簇或者匹配成一個(gè)已知的被指定的種系插入物的多形性。總的來說，在大腦中相對(duì)于只有1.9%的L1來說，有8.4%的Alu插入序列就被注釋為種系。幾乎所有的未注釋的L1插入序列匹配不到三個(gè)診斷RC-seq序列并且考慮到潛在的體細(xì)胞插入序列。 圖 3. 描述非引用基因組插入序列 （a）每個(gè)家族的插入序列比例。 （b）根據(jù)所有的大腦數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)L1插入序列進(jìn)行注釋。經(jīng)不到三個(gè)序列而檢測(cè)到的絕大多數(shù)插入序列是不能被注釋的而且考慮到了普遍的體細(xì)胞

9、插入序列。候選的插入序列通過PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管測(cè)序而被驗(yàn)證確認(rèn)。35個(gè)L1，Alu,SVA和LTR種系的插入序列通過一次PCR就很容易被確認(rèn)。鑒于目標(biāo)分子的豐度較低和L1 3末端的高基因頻率，我們對(duì)體細(xì)胞插入序列設(shè)計(jì)了一個(gè)5末端的巢式PCR驗(yàn)證試驗(yàn)。在我們挑選出的29個(gè)樣本中（14L1和15Alu）驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)每個(gè)家族中被普遍認(rèn)為的體細(xì)胞插入序列中有全長(zhǎng)850kbp的L1插入序列和全長(zhǎng)2601kbp的Alu插入序列分別地顯示11.0%和19.0%。選取的樣本幾乎都是基于插入長(zhǎng)序列的5末端的剪切程度而優(yōu)先考慮其外顯子和內(nèi)含子。最佳的草案是，結(jié)合大量輸入的DNA最后導(dǎo)致了這個(gè)確認(rèn)：14個(gè)L1 14序列

10、和12個(gè)ALU 15序列。在可用的輸入原料處于無活性之前，我們將四個(gè)體細(xì)胞的SVA插入序列也同樣用相同的方法進(jìn)行分析和二次確定。反復(fù)對(duì)3接頭進(jìn)行PCR擴(kuò)增持續(xù)生產(chǎn)非目標(biāo)擴(kuò)增物，完全基于5接頭的脫離驗(yàn)證。由于這個(gè)原因我們不能通過實(shí)驗(yàn)來確定這個(gè)靶位點(diǎn)重復(fù)序列，那只是象征性的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子領(lǐng)導(dǎo)目標(biāo)反轉(zhuǎn)錄（TPRT)。我們提議由于上輸?shù)幕祀s因素所以確認(rèn)在5末端插入序列的3接頭并沒有有效的擴(kuò)增。以及在目標(biāo)擴(kuò)增物上存在很長(zhǎng)的多聚腺苷酸尾部（polyA）但我們發(fā)現(xiàn)在非目標(biāo)擴(kuò)增物上往往沒有。不管如何，靶位點(diǎn)重復(fù)序列在某些案例中會(huì)通過高通量轉(zhuǎn)錄組分析而直接被發(fā)現(xiàn)（如補(bǔ)充圖.1d）。在一項(xiàng)種系插入序列的檢查中進(jìn)行深

11、度測(cè)序，在他們的5末端和3末端顯示有86%呈遞靶位點(diǎn)重復(fù)序列。由于他們的豐度很低所以測(cè)序覆蓋率低，只有三個(gè)被普遍認(rèn)為的體細(xì)胞插入序列在兩個(gè)目的中通過高通量轉(zhuǎn)錄組分析至少一個(gè)序列而被檢測(cè)到。其中的兩個(gè)例子（1L1和1Alu）提出了靶位點(diǎn)重復(fù)序列。盡管有這些和那些數(shù)據(jù)強(qiáng)有力的支持逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子作為體細(xì)胞動(dòng)員的主要原因，一些數(shù)量不足的例子中對(duì)兩個(gè)末端進(jìn)行測(cè)序來區(qū)分是否是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子領(lǐng)導(dǎo)的目標(biāo)反轉(zhuǎn)錄或者另一種逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子負(fù)主要責(zé)任。這每個(gè)插入序列的體細(xì)胞來源根據(jù)高通量轉(zhuǎn)錄組分析和PCR的結(jié)果在一次大腦組織化驗(yàn)中證明了它的存在而且在其他中不存在。作為說明性的例子，一個(gè)體細(xì)胞的L1插入序列的內(nèi)含子組蛋白去乙

12、?；笗?huì)在圖4a和圖4b中詳細(xì)表明同時(shí)一個(gè)體細(xì)胞的Alu插入序列的外顯子RAI1會(huì)顯示在圖4c和圖4d。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這些插入序列通過體內(nèi)發(fā)生高通量轉(zhuǎn)錄組分析而被檢測(cè)到并且并不代表測(cè)序工件。圖4. 在體細(xì)胞插入序列中發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；?HDACI)和維甲酸誘導(dǎo)1（RAI1）。 （a）對(duì)齊捐獻(xiàn)者C的尾狀核高通量轉(zhuǎn)錄組分析序列結(jié)果表明在組蛋白去乙?；傅幕?區(qū)內(nèi)存在反義的L1插入序列。巢式PCR的引物設(shè)計(jì)跨越L1 5終末端，起始反應(yīng)就結(jié)合外逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和引物插入位點(diǎn)，第二步反應(yīng)是結(jié)合內(nèi)部逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和引物插入位點(diǎn). （b)巢式PCR擴(kuò)增的目標(biāo)用毛細(xì)管測(cè)序確認(rèn)其特異性，在尾狀核中實(shí)現(xiàn)而不是在海

13、馬體中。測(cè)序表明在9號(hào)染色體存在L1動(dòng)員還伴隨者5的轉(zhuǎn)換。 （c)對(duì)齊捐獻(xiàn)者A尾狀核的高通量轉(zhuǎn)錄組分析序列對(duì)顯示出在有一種ALU插入序列在外顯子3上，也進(jìn)行RAI1的CDS分析。 （d）至于（b)的尾狀核中獲得巢式PCR擴(kuò)增的目標(biāo)物而不是在海馬體中。結(jié)果表明在4號(hào)染色體上存在ALU動(dòng)員。 注釋：在圖a和圖c中L1和ALU的原理圖不是按比例畫的。 捐贈(zèng)者成分注釋顯示體細(xì)胞L1插入序列的80.2%相當(dāng)于最近大多數(shù)人類活躍的L1-Ta & pre-Ta亞科。正常的海馬體：捐獻(xiàn)者A,B和C的體細(xì)胞插入序列的尾狀核比例分別為1.3，0.5和2.2，這些并聯(lián)的趨勢(shì)來自對(duì)L1的拷貝數(shù)變異（CNV）分

14、析（圖2）。蛋白質(zhì)編碼基因座相比于期望數(shù)值和先前的種系頻率是被不成比例的影響。相比于隨機(jī)期望數(shù)，在大腦的已有的基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)顯示基因中含有兩倍的L1內(nèi)含子很有可能是產(chǎn)生了不同的高表達(dá)。關(guān)鍵位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)含有體細(xì)胞L1插入序列，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的腫瘤抑制基因被剪切（多巴胺受體和神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）。全球，一個(gè)基因本體的分析濃縮為兩條分別是神經(jīng)的形成和突觸的功能。現(xiàn)在工作中的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是在正常的腦細(xì)胞中不像L1，ALU逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，此前還沒有被報(bào)道。無論如何，在制造了一個(gè)可信的體細(xì)胞的L1和Alu動(dòng)員巧合后，這L1的轉(zhuǎn)錄機(jī)制已經(jīng)熟知會(huì)在翻譯中動(dòng)員ALU并且體細(xì)胞ALU插入序列的83.0%相

15、當(dāng)于大多數(shù)人類活躍的AluY亞科。在每個(gè)原理的基礎(chǔ)上觀察到Alu活性相比于L1近似降低二十倍。如此一來，Alu CNV如果通過定量PCR分析將會(huì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這不太可能。這Alu插入序列和L1插入序列的基因模型也會(huì)不同；相比于L1，體細(xì)胞Alu插入序列會(huì)沒有過多的內(nèi)含子但更常見的是過多的外顯子。Alu外顯子是很重要的因?yàn)樗沁z傳性疾病基因。總的來說，L1，Alu或者更有限的范圍內(nèi)，SVA動(dòng)員產(chǎn)生大數(shù)量的插入物其會(huì)影響蛋白質(zhì)編碼基因。我們的研究結(jié)果提供了強(qiáng)有力的證據(jù)其體細(xì)胞L1和Alu動(dòng)員從根本上改變了人類大腦基因組全景并且逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是這種現(xiàn)象下的最主要的機(jī)制原理。與種系的活性度形成對(duì)照，體細(xì)

16、胞插入序列會(huì)不成比例的影響蛋白質(zhì)編碼基因座。他們會(huì)生成一個(gè)有毒的表現(xiàn)型因?yàn)樵谶M(jìn)化中進(jìn)行強(qiáng)烈的再次選擇而產(chǎn)生突變所以種系插入序列很難發(fā)現(xiàn)這樣的區(qū)域。體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在另一方面為了下一代而存在并且在一個(gè)特定的環(huán)境背景下可能會(huì)影響蛋白質(zhì)編碼基因座，或許被吸引到開放的核染色質(zhì)的轉(zhuǎn)錄區(qū)。除了插入序列外顯子的這些顯而易見的影響，內(nèi)含子事件可以作為微妙的“轉(zhuǎn)錄變阻器”或獨(dú)聯(lián)監(jiān)控份子類似于插入小鼠體內(nèi)的刺鼠基因IAP插入序列負(fù)責(zé)可行的黃色等位基因。最近的一些研究已經(jīng)編目人類細(xì)胞種系和腫瘤細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入序列。通過高通量轉(zhuǎn)錄組分析我們已經(jīng)衍生這些數(shù)據(jù)到大腦中和串聯(lián)體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子到神經(jīng)生物學(xué)基因中。比如，HDAC1是一個(gè)全基因組轉(zhuǎn)錄監(jiān)管機(jī)構(gòu)其控制L1啟動(dòng)子規(guī)范化并且在精神疾病和腫瘤形成中有牽連。另一個(gè)例子在這里突出顯示，RAI1是一個(gè)在大腦中高度表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子其與精神分裂癥和Smith-Mageniszon綜合征有聯(lián)系。在RAI1中的Alu插入序列的外顯子，如圖4c所示，因此會(huì)有表型的影響。海馬體呈現(xiàn)出更傾向于體系胞L1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，那是很有趣的在成熟的神經(jīng)細(xì)胞中其顆粒下層是一個(gè)很重要的來源。這也符合L1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子有關(guān)神經(jīng)可塑性的假說。更有趣的是APOBEC的可能性，RNA/DNA編輯酶在靈長(zhǎng)類動(dòng)物血統(tǒng)中經(jīng)強(qiáng)烈積極的選擇下擴(kuò)展并被證明控制著L1的流動(dòng)性，也許可以調(diào)節(jié)