銅脅迫對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)_葉綠素?zé)晒鈪?shù)和抗氧化酶活性的影響_百

1、植物學(xué)通報(bào)2006, 23 (2: 129137Chinese Bulletin of Botany收稿日期:2005-07-26;接受日期:2005-12-20基金項(xiàng)目:教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(103093*通訊作者Authorforcorrespondence.E-mail:z gshen.研究論文.銅脅迫對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和抗氧化酶活性的影響胡筑兵陳亞華王桂萍沈振國(guó)*(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院南京210095摘要本文研究了銅(Cu脅迫下玉米(Zeamays 幼苗生長(zhǎng)、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和抗氧化酶活性的變化。研究結(jié)果表明,520mol .L -1Cu處理10天明顯抑

2、制玉米幼苗根系生長(zhǎng),并減少玉米幼苗的干物重,以及增加玉米幼苗地上部和根系含Cu量;玉米幼苗吸收的Cu大部分積累在根系,在地上部分布較少。Cu處理還降低玉米葉片的葉綠素含量和F v /F m 、ETR、q P 和q y 值。在10天的Cu處理期間,根系中S O D 、P O D 、C A T 和G R 活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。而葉片中的S O D、P O D、C A T 和G R 活性在處理前期不受Cu脅迫的顯著影響,處理后期則因Cu脅迫而增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)表明抗氧化酶在抵御過量Cu引起的氧化脅迫中發(fā)揮了一定的作用。關(guān)鍵詞玉米,銅脅迫,葉綠素?zé)晒?抗氧化酶Effects of Copper Stre

3、ss on Growth, Chlorophyll FluorescenceParameters and Antioxidant Enzyme Activities ofZea mays SeedlingsZhubingHu,YahuaChen,GuipingWang,ZhenguoShen *(CollegeofLifeSciences,NanjingAgriculturalUniversity ,Nanjing210095Abstract G rowth,c hlorophyllc ontent,c hlorophyllf luorescencep arametersa nda ctivi

4、tyo fa ntioxi-dantenzymesincornseedlingswereinvestigatedunderhydroponicssuppliedwithdifferentconcen-trationsofCu.Rootgrowthofcornseedlingswassignificantlyinhibitedanddryweightwasde-creasedwith5-20m ol .L -1Cu.ChlorophyllcontentandF v /F m ,ETR ,q Pandq y inleaveswerealso significantlydecreasedundere

5、xcessCu.TheCuconcentrationsinshootsandrootsincreasedwith increasingCuconcentrationinthenutrientsolution.However,mostabsorbedCubycornseedling waslocatedinroots.AtalllevelsofCutreatment,theamountofCuwassubstantiallyhigherinroots thaninshoots.Duringthe10-dayCutreatment,theactivitiesofSOD,POD,CATandGRin

6、itially increasedandthendecreasedinroots.Butfortheleaves,short-termtreatmentwithexcessCuhadno significanteffectontheseenzymeactivities.Prolongedexposurefor4daysresultedinincreased enzymea ctivities.T hus,a ntioxidante nzymesh avef unctionst oa lleviatet het oxice ffectso fo xidative stresscausedbyex

7、cessCu.KeywordsZeamays ,copperstress,chlorophyllfluorescence,antioxidantenzymes13023(2銅(Cu是植物生長(zhǎng)的必需微量元素,參與植物的光合作用等許多過程,在植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要的作用,但植物組織中過量的Cu又會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用(Marschner, 1995。過量的Cu能夠降低植物葉片中葉綠素含量,破壞類囊體上的色素蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu),影響植物的原初光化學(xué)反應(yīng)和PS的光合電子傳輸(Ptsikk et al., 1998; Mys liwa-Kurdziel and S trzatka, 2002; M

8、 ysliwa-Kurdziel et a l., 2002; Ptsikk et al., 2002。Cu是可變價(jià)金屬離子,植物細(xì)胞中的Cu可以通過Haber-Weiss和Fenton反應(yīng)促使植物細(xì)胞累積羥自由基(.O H和過氧化氫(H2O2(PolleandSchzendb el, 2003。累積的活性氧可以引發(fā)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的過氧化作用,從而嚴(yán)重干擾植物正常的生理代謝(Maksymiec,1997;LombardiandSebastiani, 2005。活性氧產(chǎn)生后,植物體內(nèi)清除系統(tǒng)會(huì)啟動(dòng)以減輕或消除活性氧累積對(duì)植物的傷害,主要有酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)兩類。前者主要包括超氧化物歧化酶(sup

9、eroxidedismutase, SOD、過氧化氫酶(catalase,CAT、過氧化物酶(peroxidase,POD、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbateperoxidase,APX和谷胱甘肽還原酶(glutathionereductase,GR,后者主要指抗壞血酸(ascorbicacid,AsA、類胡蘿卜素(carote-noid,Car以及一些含巰基的低分子化合物等(Mittler,2002;JiangandZhang,2002a。重金屬脅迫下,抗氧化系統(tǒng)清除活性氧能力的高低直接與植物對(duì)重金屬的耐性強(qiáng)弱有關(guān)(江行玉和趙可夫,2001。本文通過測(cè)定不同濃度Cu處理下玉米幼苗生長(zhǎng)、葉

10、綠素?zé)晒鈪?shù)和抗氧化酶活性等的變化,探討過量銅對(duì)玉米(Zeamays幼苗生長(zhǎng)和光合作用的影響以及抗氧化酶在植物抵御銅脅迫中的作用,以期為深入揭示植物耐Cu的機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)供試材料玉米(Zeamays,品種為農(nóng)大108。種子經(jīng)10%NaClO表面消毒10分鐘,用自來(lái)水沖洗干凈,在20下浸種12小時(shí),在25光照培養(yǎng)箱中催芽。挑選露白一致的玉米種子播于石英砂中,幼苗長(zhǎng)出后,將其轉(zhuǎn)移到Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中,置于溫室中培養(yǎng)(溫度2030,濕度30%40%,光通量密度6080mol.m-2.s-1,每2天更換1次營(yíng)養(yǎng)液。待苗長(zhǎng)至兩葉一心后進(jìn)行不同濃度Cu處

11、理,Cu處理濃度設(shè)為:0.32、5、10和20mol.L-1,Cu以CuCl2.2H2O的形式加入。Cu處理后的第1、4、7和10天取樣,測(cè)定CAT、POD、GR、S O D和A P X活性以及最大光化學(xué)效率(F v/ F m、光化學(xué)猝滅系數(shù)(q P、實(shí)際量子產(chǎn)額(q y、電子傳輸速率(ETR的值。Cu處理后的第10天取樣測(cè)定葉片葉綠素、葉片丙二醛(M D A含量、根系長(zhǎng)度、根系M D A含量以及根系和地上部Cu含量和干物量。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。處理期間調(diào)節(jié)處理液pH為5.5。1.2測(cè)定方法1.2.1葉綠素含量的測(cè)定取0.1g葉片,用剪刀剪碎,浸泡在丙酮:乙醇(V:V=1:1溶液中24小時(shí),浸

12、泡液為待測(cè)液。測(cè)定方法參照張憲政(1992的方法。1.2.2MDA含量測(cè)定MDA含量參照趙世杰等(1994改進(jìn)的方法進(jìn)行測(cè)定。1.2.3Cu含量的測(cè)定烘干的植物樣品用瑪瑙研缽磨碎,用HNO3-HClO4(V:V=87:13混合液消煮(Zhaoetal.,1994,之后用TAS-986火焰原子吸收分光光度計(jì)(AAS測(cè)定Cu含量。1.2.4葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定樣品測(cè)定前,用濕紗布保濕,暗適應(yīng)30分鐘。在室溫下,用PAM210葉綠素?zé)晒鈨x(HeinzWalz,Germany程序3標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)(作用光通量密度600mol.m-2. s-1PAR測(cè)定。F v/F m、q y、q P和ETR的值由DE-TAC

13、H軟件直接讀出。1.2.5酶液提取、酶活性及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定取0.5g葉片,加入預(yù)冷的3.0mL50mmol.131 2006胡筑兵等:銅脅迫對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和抗氧化酶活性的影響L-1磷酸緩沖液(內(nèi)含1mmol.L-1乙二胺四乙酸和1%聚丙烯吡咯烷酮研磨至勻漿,4冷凍離心(10000g,30分鐘,上清液為酶提液。APX 的提取需在提取液中加1.0mmol.L-1AsA。S O D、C A T、A P X和G R活性參照J(rèn) i a n g和Zhang(2002b的方法測(cè)定。SOD活性以抑制氮藍(lán)四唑(NBT光氧化還原50%的酶量為1個(gè)酶活性單位(U,活性用U.mg-1protein表

14、示。CAT活性用A240tein.min-1表示; APX活性用A290tein.min-1表示; GR活性用A340tein.min-1表示。不同波長(zhǎng)下的吸光度變化用島津UV-2450分光光度計(jì)連續(xù)測(cè)定。POD活性參照Hammerschmidt 等(1982的方法測(cè)定,用島津UV-2450分光光度計(jì)連續(xù)測(cè)定460nm處的吸光度,POD活性用A460tein.min-1表示。蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照Bradford(1976的方法。1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)均采用Excel統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)差;采用SPSS11.5軟件根據(jù)最小顯著差數(shù)法(LSD法進(jìn)

15、行差異顯著性(P0.05分析。2結(jié)果與分析2.1Cu脅迫對(duì)植株生長(zhǎng)、葉綠素含量、含C u量和MD A含量的影響與對(duì)照(0.32mol.L-1Cu相比,520mol.L-1Cu處理明顯抑制玉米幼苗根系生長(zhǎng),減少玉米幼苗根系和地上部干物重(P0.05(表1。Cu處理也顯著降低葉片葉綠素含量(P0.05,而10和20mol.L-1Cu處理顯著增加玉米根系和葉片中的MDA含量(P0.05 (表1。2.2Cu脅迫對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響圖1顯示了不同濃度Cu處理下的玉米幼苗葉片F(xiàn) v/F m、ETR、q P和q y的變化趨勢(shì)。與對(duì)照相比,520mol.L-1Cu處理4天顯著降低玉米幼苗葉片的F v/F m

16、、E T R、q P和q y值。Cu處理濃度越高,F v/F m、ETR、q P和q y值的下降程度越大。而520mol.L-1Cu處理1天則對(duì)葉片中的F v/F m、ETR、q P和q y值沒有顯著影響。2.3Cu脅迫對(duì)根系抗氧化酶活性的影響不同濃度Cu處理下,玉米幼苗根系中C A T、P O D和S O D活性的變化趨勢(shì)見圖2。隨著Cu處理時(shí)間的延長(zhǎng),CAT、POD和SOD表1Cu處理10天對(duì)玉米幼苗根系長(zhǎng)度、干物重、含Cu量、葉綠素含量和MDA含量的影響Table1Rootlength,dryweight,Cucontent,chlorophyllcontentandMDAcontent

17、ofseedlingsofZeamaysgrownu nder excess Cu supply for 10 daysCu concentrations (mol.L-10.3251020 Root Length (cm.plant-116.40.3a14.70.1b13.50.3c11.10.1d Root dry weight (mg.plant-124.80.4a21.31.2b21.01.1b20.50.9b Shoot dry weight (mg.plant-195.22.4a75.012.5b71.54.8b80.02.6b Root Cu content (g.g-1 DW9

18、6.95.2d591.449.3c715.978.1b1012.324.4a Shoot Cu content (g.g-1 DW16.20.3b21.92.0a20.51.6a24.22.8a Chlorophyll content (mg.g-1 FW 3.160.30a 2.690.04b 2.250.22c 2.150.08c Root MDA content (nmol.g-1 FW 1.370.19b 1.510.18b 1.940.40a 1.930.29a Leave MDA content (nmol.g-1 FW 3.150.21b 3.360.15b 3.750.15a

19、3.770.26a 注:表中數(shù)值為:平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差,不同字母表示差異顯著(P0.05,LSDtest.Notes:Dataarepresentedintheformatofmean s tandarderror;Differentlettersmeansignificantdifferenceat P0.05accordingtoLSDtest.13223(2活性的變化趨勢(shì)基本相同。在Cu處理的前4天,520mol.L-1Cu處理植株的根系CAT、POD和SOD活性均高于對(duì)照,這3種酶活性均有隨著Cu處理濃度的增加而升高的趨勢(shì)。但過量Cu處理延長(zhǎng)到7天,根系CAT活性明顯降低并低于對(duì)照,而SO

20、D活性降低到對(duì)照植株的水平。過量Cu處理植株根系POD活性則在處理的第10天降低到對(duì)照水平以下。短時(shí)間的過量Cu處理(1和4天,有提高玉米幼苗根系中GR活性的趨勢(shì),但延長(zhǎng)Cu處理時(shí)間則降低GR活性(圖2。如20mol.L-1Cu 處理10天,GR活性比對(duì)照減少了28%。與對(duì)照相比,5和10mol.L-1Cu處理對(duì)玉米幼苗根系A(chǔ)PX活性沒有顯著影響,但20mol.L-1Cu 處理顯著提高根系中APX活性(圖2。2.4Cu脅迫對(duì)葉片抗氧化酶活性的影響與對(duì)照相比,520mol.L-1Cu處理1天對(duì)玉米幼苗葉片中C A T、P O D、S O D和GR活性沒有顯著影響(圖3。Cu處理時(shí)間延長(zhǎng)至4天,葉

21、片POD和SOD活性提高并顯著高于對(duì)照,而CAT活性則在處理的第7天才顯著提高(圖3。GR活性從Cu處理時(shí)間的第4天開始,隨Cu 處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸提高,并顯著高于對(duì)照(圖3。而葉片中APX活性變化與其他酶具有一定差異,在Cu處理的第1天,APX活性明顯低于對(duì)照,但隨著Cu處理時(shí)間的延長(zhǎng),APX活性逐漸上升, 并顯著高于對(duì)照(圖3。133 2006胡筑兵等:銅脅迫對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和抗氧化酶活性的影響3討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5mol.L-1Cu即對(duì)玉米幼苗產(chǎn)生毒害作用。與對(duì)照相比,Cu脅迫下的玉米幼苗根系和地上部生長(zhǎng)受到明顯抑制,并且隨著營(yíng)養(yǎng)液中Cu濃度的增加,生長(zhǎng)的受抑制程度也越明

22、顯(表1。植物對(duì)重金屬的耐性可以分為排斥機(jī)制和耐性機(jī)制,在排斥機(jī)制中, 植物 （） 通過減少根系吸收和向地上部運(yùn)輸來(lái)降低重金 屬含量（，）； 而在耐性機(jī)制中， 物通過 植 合成蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸和有機(jī)酸等化合 物來(lái)螯合細(xì)胞內(nèi)的游離金屬離子（，； ，；，； ，）。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示玉米幼苗吸 收的以上累積在根系，隨著營(yíng)養(yǎng)液中 濃度的增加（ ）， 葉片含量的 胡筑兵等：銅脅迫對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)、 葉綠素?zé)晒鈪?shù)和抗氧化酶活性的影響 上升并不明顯（表）， 顯示玉米幼苗對(duì)過量銅的 耐性機(jī)理主要是排斥機(jī)制， 這與其他植物的耐 機(jī)制相一致（，； ，； ，； ， ）。 同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 ；，）。 在誘導(dǎo) 活

23、性氧產(chǎn)生方面，可以直接接受中電子 形成，將氧化成，然后通過反 應(yīng)生成.O和（zendb， ）。 活性氧能夠攻擊質(zhì)膜和細(xì)胞器膜中的 不飽和脂肪酸，引起膜脂過氧化，膜透性增大 （ ，）。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示過量 處理下含量明顯上升（表）。 因此，膜 脂過氧化可能是 毒害植物的重要途徑之 一。目前有許多研究結(jié)果表明 對(duì)抗氧化酶 （，和等）活性的影響可 能同時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)和抑制兩個(gè)方面。 一方面， 過量明顯提高抗氧化酶在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)， 誘導(dǎo)同工酶的表達(dá)， 及對(duì)酶蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行加工 以 與修飾， 提高酶的總活性（， ；，）。 另一方 面， 脅迫下產(chǎn)生的活性氧可以破壞 、 和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，因而破壞抗氧化酶的表

24、 達(dá)系統(tǒng)和結(jié)構(gòu)， 降低酶的活性（，； ，；，； ，）。 在處理初 期（天）， 一些抗氧化酶活性的升高可能與植 物適應(yīng)誘導(dǎo)活性氧增加有關(guān)，而延長(zhǎng)處 理時(shí)間降低一些抗氧化酶活性則可能是細(xì)胞中 過量可能直接作用于酶蛋白或影響基因表 達(dá)的結(jié)果。至于玉米幼苗葉片在 處理初期 （天）， 因運(yùn)輸?shù)降厣喜康妮^少而對(duì)抗氧化 酶活性沒有產(chǎn)生顯著影響。但隨 處理的延 長(zhǎng)和地上部積累量的增加， 也一定程度上誘 導(dǎo)增加抗氧化酶的活性（圖）。 結(jié)果表明抗氧 化酶的增強(qiáng)可能是玉米幼苗對(duì)脅迫的早期 響應(yīng)之一， 根系抗氧化酶對(duì)過量的響應(yīng)明顯 早于葉片抗氧化酶的響應(yīng)。 此外，我們的研究 結(jié)果顯示在過量的脅迫下葉片中抗氧化酶 活性

25、與葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化趨勢(shì)相一致（圖 和圖）， 表明抗氧化酶在抵御過量引起的氧 化脅迫中發(fā)揮了一定的作用。 處理后，葉片中含量上升均不明顯，但葉 片中光合作用的指標(biāo)和抗氧化酶活性變化顯著 （表，圖和圖），我們推測(cè)處理后根系中 高含量可能作為一種信號(hào)分子， 激活葉片中 的活性氧清除系統(tǒng)（，）。 同時(shí)， 過 量能明顯引起根系累積， 是一個(gè)重 要的信號(hào)分子， 也是一種主要的活性氧（， ）。根系中過量的 可能被轉(zhuǎn)移到葉片 中， 引起葉片中的氧化脅迫， 脂質(zhì)過氧化程度增 加， 光合作用能力下降（ ，）。 過量能明顯降低植株葉片色素含量， 破 壞內(nèi)囊體膜結(jié)構(gòu)， 飾加工色素分子和降低色素 修 合成酶的活性等

26、， 從而降低植物光合作用效率 （Ptsikk et al., 1998; ysliwa-Kurdziel and Strzatka, 2002; Mysliwa-Kurdziel et al., 2002; Ptsikk et al., 200）。 葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)被認(rèn)為 是快速檢測(cè)植物光合機(jī)構(gòu)無(wú)損傷的最靈敏的探 針。 用于度量 原初光能轉(zhuǎn)換效率， 則表示通過 的電子傳輸速率。 是 天線色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞 的份額，較低的 反映中開放的反應(yīng)中心 比例和參與 固定的電子減少。 是 的實(shí)際光化學(xué)效率， 反映吸收的光子供給 反應(yīng)中心的效率（焦德茂，）。 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果顯示， 過量 明顯降

27、低 、 、 和 值（表和圖），表明玉米幼苗利用光能的 效率明顯下降，的電子傳遞嚴(yán)重受阻， 這必 然導(dǎo)致光合作用效率的降低。過量 降低葉 片的光合作用效率可能是抑制植物生長(zhǎng)的 原因之一。 氧化脅迫是毒害的一種重要機(jī)制（ ，；，； chzendbel， S 1015. （） 參考文獻(xiàn) 江 行 玉 ， 趙 可 夫 （）植物重金屬傷害及其抗性機(jī) 理 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào) ， 焦 德 茂 （）運(yùn)用光合機(jī)理揭示生理育種途徑（北 京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社）， 張 憲 政 （） 作物生理研究法（北京： 農(nóng)業(yè)出版社）， 趙 世 杰，許 長(zhǎng) 成，鄒 琦 ，孟 慶 偉（） 植物組織中丙 二醛測(cè)定方法的改進(jìn) 植物生理學(xué)通訊

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