實驗一-酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)(共13頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上 實驗一 酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)（28學(xué)時）一、 目的和要求1 用旋光儀對酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行測定。2 了解掌握蔗糖酶的制備和酶活力的測定。3 學(xué)會米氏常數(shù)的測定。二、 實驗原理蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)蔗糖 水 葡萄糖 果糖這個反應(yīng)在H+或蔗糖酶的催化下可以很快的進(jìn)行。蔗糖及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物都有不對稱的碳原子，它們都有旋光性，但是它們的旋光能力不同，所以可以利用體系在反應(yīng)過程中旋光度的變化來描述反應(yīng)進(jìn)程。溶液的旋光度與溶液中所含旋光物質(zhì)的旋光能力、溶劑的性質(zhì)、溶液的濃度、測量樣品管的長度等均有關(guān)系。當(dāng)其他條件不變時，旋光度a與反應(yīng)物濃度C成線形關(guān)系，即akC作為反應(yīng)物的蔗糖是右旋性物質(zhì)，

2、其比旋光度為66.6；生成物的葡萄糖也是右旋性的物質(zhì)，其比旋光度為52.5，但是果糖是左旋性物質(zhì)，其比旋光度為91.9。由于生成物中果糖左旋性比葡萄糖右旋性大，所以生成物呈現(xiàn)左旋性質(zhì)。因此，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系的右旋角不斷減小，反應(yīng)到某一時刻，體系的旋光度可恰好等于零，而后就變成左旋，直到蔗糖完全轉(zhuǎn)化，這時體系的左旋角達(dá)到最大值。三、 儀器和試劑旋光儀1臺恒溫槽1套葡萄糖、果糖、蔗糖（均為分析純）醋酸醋酸鈉緩沖溶液四、 實驗步驟1 蔗糖酶的提取取鮮酵母20 g于100 mL三角瓶中，加入1.6 g NaAc，攪拌1520分鐘后使團(tuán)塊液化，再加3 mL甲苯，混和后搖動10分鐘，放在恒溫箱中37保

3、溫60小時左右。取出后加入3.2 mL 4 M醋酸和100 mL水使pH值在4.5左右。將混合物以每分鐘3000轉(zhuǎn)的速度離心30分鐘，離心后形成三層，取中層黃色液體，再以同樣速度離心30分鐘，所得澄清的黃色液體即為蔗糖酶粗品。將此蔗糖酶用pH4.6的緩沖溶液稀釋10倍，過濾后冷凍保存。2 作蔗糖轉(zhuǎn)化體系旋光度和濃度的工作曲線 根據(jù)蔗糖轉(zhuǎn)化體系的蔗糖和果糖、葡萄糖的比例關(guān)系，可以制作不同濃度下混和體系的旋光度的工作曲線。例如0.1 M蔗糖轉(zhuǎn)化體系的旋光度和葡萄糖濃度的工作曲線，實際上是制作0.1 M蔗糖轉(zhuǎn)化進(jìn)程工作曲線，不同的蔗糖濃度有不同的進(jìn)程工作曲線，從若干不同蔗糖濃度的進(jìn)程工作曲線得到這些

4、工作曲線直線關(guān)系很好，且直線的斜率與蔗糖的濃度無關(guān)，經(jīng)過線性擬合，其直線方程為：y60.28xa其中x蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖的濃度（M）y蔗糖轉(zhuǎn)化進(jìn)程中體系的旋光度值a不同濃度蔗糖溶液的旋光度值，其值可以測定，也可以通過下式計算。a66.6×L×C（L10cm，C是蔗糖濃度g/mL）通過上述的直線方程，可以測定任何濃度蔗糖轉(zhuǎn)化體系的旋光度值，求出其轉(zhuǎn)化成葡萄糖的濃度x，從而可以求得不同反應(yīng)時間的葡萄糖濃度。3 酶比活性的測定配制2.5的蔗糖溶液100 mL，測定其旋光度。在20的條件下加入蔗糖酶5 mL，反應(yīng)3分鐘測定體系旋光度值y，用公式 y60.28xa 求出葡萄糖濃度x，及

5、生成葡萄糖的毫克數(shù)，即可求出酶的比活性。（上述方法制備的酶，其活性約每毫升20單位。）比活性(單位/mL)(生成葡萄糖的毫克數(shù))/(酶的體積)4 蔗糖酶進(jìn)程曲線的制作取200 mL 0.1 M的蔗糖溶液，在35水浴條件下恒溫，加10 mL蔗糖酶溶液，每5分鐘取出20 mL反應(yīng)液加5滴5 M NaOH滅活后，測定一次體系的旋光度。求出葡萄糖的濃度，用葡萄糖的濃度對時間作圖，得到蔗糖酶催化反應(yīng)的進(jìn)程曲線。時間（分）510152025303540旋光度葡萄糖濃度5 蔗糖酶米氏常數(shù)的測定 用緩沖溶液稀釋0.5 M的蔗糖溶液成為一系列不同濃度的蔗糖溶液各50 mL，在35恒溫條件下加入10 mL已知活性

6、的蔗糖酶，反應(yīng)5分鐘，加入1 mL 5 M NaOH溶液終止反應(yīng)，測定此時溶液的旋光度，從而求出葡萄糖的生成速度V，根據(jù)米氏方程用反應(yīng)速度V對（V/S）作圖，直線的斜率-Km，直線的截距為Vmax，從而可以求出米氏常數(shù)Km。加入蔗糖體積(mL)蔗糖濃度（M）起始旋光度結(jié)束旋光度葡萄糖濃度（M）反應(yīng)速度V(M/分)V/S11.200.0123.600.0337.200.06410.80.09514.40.12618.00.15721.60.18825.20.21五、 數(shù)據(jù)處理1 利用(3)中的數(shù)據(jù)計算酶的比活性。2 利用(4)中的數(shù)據(jù)作酶催化反應(yīng)進(jìn)程曲線。3 利用(5)中的數(shù)據(jù)計算蔗糖酶米氏常數(shù)

7、。六、參考文獻(xiàn)1 沈同等，“生物化學(xué)”，上冊，人民教育出版社，1980年版。2 復(fù)旦大學(xué)，“物理化學(xué)實驗”，上冊，人民教育出版社，1979年版。3 朱儉等，“生物化學(xué)實驗”，上?？萍汲霭嫔?，1981年版。附錄一直線直線方程一般可表示為：yabx（1）式中y和x為由實驗數(shù)據(jù)可確定的量；a和b為待定參數(shù)或函數(shù)。例如，對Arrhenius公式指數(shù)式，y和x分別為lnk和1/T；a和b分別為lnA和（E/k）。對式lnr=lnknlnC，y和x分別為lnr和lnC；a和b分別為lnk和n。由于有實驗誤差，用n對由實驗確定的yi與xi值作y對x圖時，一般說來，所得各點并不嚴(yán)格的在同一直線上，于是存在著這

8、樣的問題：應(yīng)如何更合理地作出直線，從而更準(zhǔn)確地求解a和b的值？應(yīng)當(dāng)指出，若直線選擇不當(dāng)（直線位置畫的不當(dāng)），不大的偏離，將可能導(dǎo)致a和b重大偏差。尤其是當(dāng)試驗測定的x區(qū)間范圍相對較小時，外推至x0，將可使截距a產(chǎn)生較大的誤差。例如依Arrhenius對數(shù)式以lnk對1/T作圖，由實驗測定的溫度范圍外推至1/T0，即T時，所選的直線斜率的較小的偏差將會引起截距l(xiāng)nA產(chǎn)生很大的偏差，致使指前因子A產(chǎn)生更大的偏差。怎樣方能使直線位置選擇（畫）的得當(dāng)呢？通俗地說，實測點（yixi）應(yīng)均勻分布在直線兩側(cè)。嚴(yán)格的說，可采用下述“最小二乘法”確定最佳a、b值，作出最佳直線。若取得的數(shù)據(jù)實驗值yi與xi（i=

9、1、2、n），一般來說，yi與abxi值并不相等，令其誤差為di，則di=yiabxi線性回歸，要求適當(dāng)選擇a與b之值，使各對元數(shù)據(jù)的偏差di之平方和之值為最小。即（2）（3）式中yi、bxi均為已知值。令與分別為yi與xi的平均值。則式（2）、（3）聯(lián)立，可得（4）（5）由式（4）、（5）確定的a和b，稱之為線性回歸系數(shù)。用線性回歸系數(shù)確定的直線方程yabx，稱為回歸直線方程。其對應(yīng)的直線，稱為回歸直線?；貧w直線有下列性質(zhì)1 當(dāng)x時，由式（1）、（5）可知y，即回歸直線必通過（，）點。2 由式（2）知，回歸直線要求y的各次實驗值yi與計算值abxi偏差之總和為零，即各實驗點均勻分布于回歸直線

10、的兩側(cè)。欲度量一組實測點與回歸直線的相符程度，常引用所謂的相關(guān)系數(shù)“g”作為定量指標(biāo)，其定義為：（6）當(dāng)|g|值在01之間，|g|值越接近于1，表明該組實測點與回歸直線吻合性越好。當(dāng)|g|=1時，表示所有的實測點均嚴(yán)格地落在回歸直線上；|g|<0.482，則該組x、y間線性關(guān)系不明顯，此時推求回歸直線方程已無意義了。較精密的小型計算器一般配有直線方程的回歸計算標(biāo)準(zhǔn)程序，使用十分方便。附錄二酶催化反應(yīng)一、 酶酶與其他催化劑不同，能在機(jī)體內(nèi)十分溫和的條件下高效率地起催化作用，使生物體內(nèi)的各種物質(zhì)處于不斷的新陳代謝之中。所以說，酶在生物體的生命活動中占有極為重要的地位，研究酶的化學(xué)性質(zhì)及其作用

11、機(jī)理，對于人們了解生命活動的規(guī)律，從而進(jìn)一步指導(dǎo)有關(guān)的醫(yī)學(xué)實踐及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，酶是具有催化作用的蛋白質(zhì)。酶蛋白主要由氨基酸組成，同其他蛋白質(zhì)一樣，具有兩性電解質(zhì)的性質(zhì)，并具有一、二、三、四級結(jié)構(gòu)，也受熱、紫外線照射等物理因素及酸、堿、有機(jī)溶劑等化學(xué)因素的影響而變性或沉淀，喪失酶活性。酶的分子量也很大，其水溶液具有親水膠體的性質(zhì)，不能透析。在體外，酶能被胰蛋白酶等水解而失活。根據(jù)酶的組成，酶可以分成簡單蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋白質(zhì)兩類。脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等屬于簡單蛋白質(zhì)，其活性僅僅取決于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；另一類酶，其中的蛋白質(zhì)部分酶蛋白不具有活性，需要加入非

12、蛋白的組分輔助因子后，才表現(xiàn)出酶的活性，這就是結(jié)合蛋白質(zhì)。酶蛋白與輔助因子結(jié)合后形成的復(fù)合物稱為全酶。例如酪氨酸酶就是以Cu+或Cu2+為輔助因子的全酶。在催化反應(yīng)中，酶蛋白與輔助因子所起的作用不同，酶反應(yīng)的專一性及高效率取決于酶蛋白本身，而輔助因子則直接對電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)起傳遞作用。酶的輔助因子包括金屬離子（Zn+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+等）及小分子復(fù)雜有機(jī)化合物。它們本身無催化作用，但參與氧化還原或運載酰基載體的作用。在大多數(shù)情況下，可以通過透析等方法將全酶中的輔助因子除去，這種與酶蛋白分子松弛結(jié)合的輔助因子稱為輔酶。在少數(shù)情況下，有一些輔助因子以共價鍵和

13、酶蛋白較牢固地結(jié)合在一起，難以透析除去，這種輔助因子稱之為輔基。細(xì)胞色素氧化酶與鐵卟啉輔基就結(jié)合的比較牢固。酶母提取物經(jīng)透析除去輔酶I(Co I)后，便失去了催化葡萄糖發(fā)酵的能力。根據(jù)酶蛋白分子的特點可將酶分為單體酶、寡聚酶和多酶體系。單體酶只有一個多肽鏈，分子量在1.3萬到3.5萬之間，一般是催化水解反應(yīng)的多肽鏈。寡聚酶由幾個甚至幾十個亞基組成，亞基之間不是共價鍵結(jié)合，彼此很容易分開，分子量從3.5萬到幾百萬，如磷酸化酶a。多酶體系是由幾種酶彼此嵌合形成的復(fù)合體。多酶復(fù)合體的分子量一般都在幾百萬以上，它有利于一系列反應(yīng)的連續(xù)進(jìn)行，如在脂肪酸合成中的脂肪酶合成酶復(fù)合體。在酶促反應(yīng)中被酶作用的物

14、質(zhì)稱為酶的底物。根據(jù)酶促反應(yīng)的性質(zhì)可將酶分為六大類：1 氧化還原酶類催化氧化還原反應(yīng)A·2HBAB·2H例如黃嘌呤氧化還原酶（習(xí)慣稱為黃嘌呤氧化酶）2 移換酶類催化功能基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)ABCABC例如丙氨酸酮戊二酸轉(zhuǎn)移酶（習(xí)慣稱為谷丙轉(zhuǎn)氨酶或丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）3 水解酶類催化水解反應(yīng)ABHOHAOHBH這類酶包括淀粉酶、蛋白酶等。例如ATP磷酸水解酶：ATPH2OADP 正磷酸ATP是腺苷三磷酸（腺三磷），ADP腺苷二磷酸（腺二磷）。4 裂合酶類催化從底物上移去一個基團(tuán)而留下雙鍵的反應(yīng)或其逆反應(yīng)，這類酶包括水化酶、脫羧酶和脫氨酶等。5 異構(gòu)酶類催化異構(gòu)反應(yīng)AB例如催化D、L互

15、交，a、b互交的酶6 合成酶催化合成反應(yīng)，催化一切必須與ATP分解相偶聯(lián)，并由兩種物質(zhì)（雙分子）合成一種物質(zhì)的反應(yīng)XYATPXYADPPi二、 酶的分離提純及活性測定藥物用酶、生化試劑用酶，對酶的純度要求較高；對酶的物理化學(xué)性質(zhì)和催化反應(yīng)進(jìn)行研究，亦需要純度較高的酶或純酶，所以必須對酶進(jìn)行分離和提純。生物體內(nèi)的酶分為胞內(nèi)酶和胞外酶兩類。胞內(nèi)細(xì)胞存在于細(xì)胞之內(nèi)，必須使細(xì)胞破碎才能進(jìn)行分離。胞外酶則容易分離，例如由動物胰液可分出各種蛋白酶和酯酶。因為酶是蛋白質(zhì)，故可以用提純蛋白質(zhì)的方法來提純酶。鹽析法是最常用的，鹽析沉淀的蛋白質(zhì)保持其天然構(gòu)象，能再溶解。用于鹽析的中性鹽以硫酸銨為最好，因為它在水中

16、的溶解度很高（20，760g/L）且其溫度系數(shù)較小。其他提純方法還有調(diào)節(jié)pH、等電點沉淀、有機(jī)溶劑（乙醇、丙酮、異丙醇等）分級分離等。因為酶是生物活性物質(zhì)，所以在提純時必須要減少活性的損失，全部操作需在05低溫下進(jìn)行。用有機(jī)溶劑分級分離則在-15-20進(jìn)行。為防止重金屬使酶失活，有時需在抽提溶劑中加入少量的EDTA螯合劑；為了防止酶蛋白SH基被氧化失活，需要在抽提溶劑中加入少量的巰基乙醇；為避免產(chǎn)生大量泡沫使酶變性，在分離提純過程中不能過度攪拌。為進(jìn)一步提純得到純度更高的酶制劑，常用磷酸鈣凝膠吸附、離子交換纖維素分離、葡聚糖凝膠層析、離子交換葡聚糖凝糖膠層析，凝膠電泳分離及親和層析分離法。為便

17、于保存，需將酶制品濃縮、結(jié)晶。有三種保存方法：1、保存濃縮的酶液：用硫酸銨沉淀或硫酸銨反透析法使酶濃縮，使用前再透析除去硫酸銨。2、冷凍干燥：對于已除去鹽分的酶液可以先在低溫結(jié)凍，再減壓使水分升華，制成酶的干粉，保存于冰箱中。3、濃縮液加入等體積甘油，于-20保存。在分離提純過程中，必須經(jīng)常測定酶的比活性，以指導(dǎo)提純工作的進(jìn)行。酶活性的大小也稱為酶活力，是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活性的高低是研究酶的特性、進(jìn)行酶制劑的生產(chǎn)及應(yīng)用時的一項必不可少的指標(biāo)。酶的活性的大小可以用在一定條件下，它所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度來表示。酶催化的反應(yīng)速度愈大，酶的活性就愈高。所以測定酶的活性就是測定酶促

18、反應(yīng)的速度，這實質(zhì)上就是酶的定量測定。酶反應(yīng)速度可用單位時間內(nèi)底物濃度的減少或產(chǎn)物濃度的增加來表示。以產(chǎn)物濃度C對反應(yīng)時間t作圖（見圖11）。酶反應(yīng)速度即為該曲線的斜率。圖1-1 酶反應(yīng)的速度曲線從酶反應(yīng)的速率曲線可以看出，反應(yīng)速度在開始一段時間內(nèi)保持恒定，隨著反應(yīng)時間的延長，酶反應(yīng)速度逐漸下降。下降的原因是由于底物濃度的降低、酶在一定pH及溫度下部分失活、產(chǎn)物對酶的抑制、產(chǎn)物濃度的增加而加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行等。因此，研究酶的反應(yīng)速度應(yīng)以酶促反應(yīng)的初速度為準(zhǔn)。這時上述各種干擾因素尚未起作用，速度保持不變。在測定酶反應(yīng)速度時，常常測定的是產(chǎn)物濃度的增加而不是底物濃度的減少。這是由于實驗中，底物的濃

19、度往往是過量的，反應(yīng)時底物濃度的減小微乎其微，難以準(zhǔn)確測定；而產(chǎn)物則從無到有，只要方法足夠靈敏，其濃度就可以準(zhǔn)確測定。酶活性的高低用酶活性單位來表示。酶含量可以用每克或每毫克酶制劑含有多少個活性單位來表示（單位/克或單位/毫克）。例如a-淀粉酶，可用每小時催化1克可溶性淀粉液化所需要的酶量來表示，也可以用每小時催化1毫升2可溶性淀粉液化所需要的酶量作為一個酶單位。酶的比活性是指每毫克酶蛋白所具有的酶活性，一般用單位/毫克蛋白來表示。它常用來比較每單位重量酶蛋白的催化能力。比活性愈高，表明酶愈純。三、 酶促反應(yīng)的動力學(xué)1 酶作為生物催化劑除具有一般催化劑的共性外，還有其特性：（1） 催化效率高。

20、以分子比表示，酶催化反應(yīng)的反應(yīng)速度比非催化反應(yīng)高1081020倍，比其它催化反應(yīng)高1071013倍，以轉(zhuǎn)換數(shù)每分鐘每個酶分子能催化多少個反應(yīng)物分子發(fā)生變化表示，大部分酶為1000，高的可達(dá)106以上。（2） 酶作用的專一性。一種酶只能作用于某一類或某一種特定的物質(zhì)，即一種酶只作用于一個或一類底物。（3） 酶易失活。強酸、強堿、高溫等條件都能使酶受到破壞而完全失去活性，所以酶作用的條件一般都比較溫和，如常溫、常壓、接近中性的酸堿度等。（4） 酶活性的調(diào)節(jié)控制。調(diào)節(jié)控制的方式很多，包括抑制劑調(diào)節(jié)、共價修飾調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、酶原激活及激素控制等，這里不予詳細(xì)討論。（5） 酶的催化活性與輔酶、輔基和金屬

21、離子有關(guān)。有些酶是復(fù)合蛋白質(zhì)，其中的小分子物質(zhì)（輔酶、輔基及金屬離子）與酶的催化活性密切相關(guān)。若將它們除去，酶就失去活性。（6） 在酶促反應(yīng)中存在著酶被底物所飽和的現(xiàn)象。高效率、專一性以及溫和的作用條件使酶在生物體新陳代謝中發(fā)揮強有力的作用，酶活性的調(diào)控使生命活動中各個反應(yīng)得以有條不紊地進(jìn)行。為了最大限度地發(fā)揮酶反應(yīng)的高效率，尋找最有利的反應(yīng)條件，為了了解酶在代謝中的作用和某些藥物的作用機(jī)理等等，都必須掌握酶促反應(yīng)速度的規(guī)律。酶促反應(yīng)的動力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速度及其影響因素的科學(xué)。2 底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響底物濃度的改變對酶反應(yīng)速度的影響比較復(fù)雜，參見圖12酶反應(yīng)和速度（v）對底物濃度S的

22、關(guān)系。圖12 酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時，反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系是正比關(guān)系，表現(xiàn)為一級反應(yīng)；隨著底物濃度的增加，反應(yīng)不再按正比升高，這一段反應(yīng)表現(xiàn)為混合級反應(yīng)；再繼續(xù)增加底物濃度，曲線表現(xiàn)為零級反應(yīng)，這時盡管底物濃度還在不斷增加，但反應(yīng)速度卻不再上升，趨向一個極限，說明酶已被底物所飽和。所有的酶都有此飽和現(xiàn)象，但各自達(dá)到飽和時所需的底物濃度并不相同，甚至差異極大。Michaelis和Menten提出了酶促動力學(xué)的基本原理，Briggs和Haldan又加以補充和發(fā)展。v對S的定量關(guān)系，他們作了如下假設(shè)與推導(dǎo)。他們借用“中間產(chǎn)物假設(shè)”比較合理地解釋了上述現(xiàn)象。此假設(shè)認(rèn)為，酶與底物

23、先絡(luò)合成一個絡(luò)合物，此絡(luò)合物再進(jìn)一步分解成產(chǎn)物和游離態(tài)的酶。第一步快速可逆ESES（1）第二步較慢可逆ESPS（2）由于酶促反應(yīng)的速度與酶底物中間物ES的形成及分解直接相關(guān)，所以必須考慮ES的形成速度和分解速度，即ES的形成量與ES和PE有關(guān)。但PE形成ES的速度極?。ㄌ貏e是在反應(yīng)處于初期階段時，P很?。?，故可忽略不計。因此，ES的形成速度可表示為（3）這里E0為酶的總濃度；ES為酶底物中間物的濃度；E0ES為游離狀態(tài)的酶的濃度。S為底物濃度。通常底物濃度比酶濃度過量得多，即S>>E0。S等于底物的總濃度S減去被酶結(jié)合的S量（亦即ES），而ES的分解速度則是與二者之和為ES分解的總

24、速度： （4）當(dāng)整個酶反應(yīng)體系處于穩(wěn)態(tài)時，ES的形成速度與分解速度相等，即ES保持恒定，所以 k1(E0ES)S=k2ES+k3ES（5）令則（6）從而（7）因為酶反應(yīng)的速度v與ES成正比，所以 v=k3ES（8）即（9）當(dāng)?shù)孜餄舛群芨邥r，所有的酶都被底物所飽和，而轉(zhuǎn)變成ES復(fù)合物，即E0=ES時，酶促反應(yīng)達(dá)到最大速度Vmax，所以Vmax=k3ES=k3E0（10）（9）式除以（10）式，得故（11）這就是米氏方程（Michaelis-Menten equation），Km為米氏常數(shù)（Michaelis-constant），該方程表明了當(dāng)已知Km及Vmax時，酶反應(yīng)速率與底物濃度呈正比的定量

25、關(guān)系。當(dāng)酶促反應(yīng)處于v=1/2Vmax的特殊情況時，顯然這里S=Km。由此可以看出Km值的物理意義，即Km值是當(dāng)酶反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度，它的單位與底物濃度的單位一樣。Km是酶學(xué)研究中的一個極為重要的數(shù)據(jù)，下面再對Km作如下分析：（1） Km值是酶的特征常數(shù)之一，只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶的濃度無關(guān)。不同的酶，Km值不同，如蘋果酸酶為0.05mmol·L-1，脲酶為25 mmol·L-1（2） 如果一個酶有幾種底物，則對每一種底物，各有一個特定的Km值。Km值還受pH值及溫度的影響。因此，Km值作為常數(shù)只是對一定的底物、一定的pH值、一定的溫度條件而言。測定

26、酶的Km值可以作為鑒別酶的一種手段。Km值隨不同底物而異的現(xiàn)象可以幫助判斷酶的專一性，并助于研究酶的活性中心。（3） 同一種酶有幾種底物就有幾個Km值，其中Km值最小的底物一般稱為該酶的最適底物或天然底物。如蔗糖是蔗糖酶的天然底物。（4） Km不等于Ks，Ks是ES的解離平衡常數(shù)，由于，所以只有在特殊情況下（k1、k2>>k3，即形成ES的平衡迅速建立，ES形成的速度大大超過ES分解為產(chǎn)物的速度）下，Km值才可看作Ks。1/Ks用來表示酶與底物親和力的大小，1/Ks愈大，表示親和力愈大。當(dāng)k3極小時，可近似地用1/Km來表示酶與底物結(jié)合的難易程度，因為1/Km愈大，Km愈小，達(dá)到最

27、大反應(yīng)速度一半所需的底物濃度就愈小。顯然，最適底物與酶的親和力最大，不需很高的底物濃度就可以很容易地達(dá)到Vmax。（5） Km值與米氏方程的應(yīng)用可由所要求的反應(yīng)速度（反應(yīng)達(dá)到Vmax的百分?jǐn)?shù)），求出應(yīng)當(dāng)加入底物的合理濃度；反過來，也可以根據(jù)已知的底物濃度，求出該條件下的反應(yīng)速度。例如，要求反應(yīng)速度達(dá)到Vmax的90，其底物濃度應(yīng)為則S=9Km根據(jù)米氏方程，從酶的vS圖上可以得到Vmax，再從1/2Vmax可求得相應(yīng)的S，即Km值。實際上，即使用很大的底物濃度，也達(dá)不到真正的Vmax，從而也測不準(zhǔn)Km值。為了準(zhǔn)確地得到米氏常數(shù)，可用如下兩種方法。（1） 雙倒數(shù)作圖法。米氏方程可改寫為實驗時選擇不

28、同的S測定相對應(yīng)的v，以1/v對1/S作圖，得一直線，外推至與橫坐標(biāo)相交，得圖13中的“-x”值，即為1/Km，則Km=-1/x。這是求米氏常數(shù)最方便也是最常用的方法。圖13 雙倒數(shù)作圖法（2） v對v/S作圖，得一直線，如圖14所示。該直線的斜率=-Km。根據(jù)米氏方程，以v對v/S作圖，可得到與實驗結(jié)果（見圖12）相符的曲線。這種一致性，從一個側(cè)面反映了“中間產(chǎn)物假說”的正確性。幾十年來，還積累了很多其他的依據(jù)，直接或間接地證明了中間產(chǎn)物學(xué)說的正確性。必須指出，現(xiàn)在的酶促反應(yīng)動力學(xué)還只能較好地反映較為簡單的酶作用過程，對于更復(fù)雜的酶作用過程，特別是對生物體中的多酶體系則還不能全面地概括和解釋

29、。米氏方程只假定形成一個ES，但實際上許多酶在催化時包括幾個中間物過程，再加上許多酶促反應(yīng)不只有一種底物，也不只產(chǎn)生一種產(chǎn)物，對這種過程的動力學(xué)分析是很復(fù)雜的，必須借助電子計算機(jī)才能進(jìn)行計算。圖14 v對v/S作圖法3 酶的濃度對酶反應(yīng)速度的影響在酶促反應(yīng)中，如果底物濃度足夠大，足以使酶飽和，則反應(yīng)速度與酶的濃度成正比。從米氏方程（9）式即可看出，當(dāng)S維持不變時，vE。這里使用的酶必須是純酶制劑或不含抑制物的粗酶制劑。4 pH對酶反應(yīng)速度的影響大部分酶活力受環(huán)境pH的影響，在一定的pH下，酶反應(yīng)具有最大的速度，高于或低于此值，反應(yīng)速度便下降，通常稱此pH為酶反應(yīng)的最適pH，示例如圖15。圖15 胰蛋白酶活性與pH底關(guān)系酶的最適pH并不是一個常數(shù)，有時因底物種類、濃度及緩沖液成分不同而改變。動物酶的最適pH多在6.58.0之間，植物及微生物酶的最適pH多在4.56.5之間。（1） 過酸過堿會影響酶蛋白的構(gòu)象，甚至使酶變性而失活。（2） pH會影響底物分子和酶分子以及中間產(chǎn)物ES的解離狀態(tài)，往往只有某一種解離狀態(tài)最有利于酶與底物的結(jié)合，如果影響到ES的形成，酶的活性便降低了。（3） pH值影響分子中另一些基團(tuán)的解離，這些基團(tuán)的離子化狀態(tài)與酶的專一性及酶分子中