實(shí)驗(yàn)二十-日本血吸蟲病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)(共7頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上實(shí)驗(yàn)二十 日本血吸蟲病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)日本血吸蟲病是一種人畜共患的寄生蟲病，被世界衛(wèi)生組織列為全球重點(diǎn)防治疾病之一。它嚴(yán)重威脅著疫區(qū)人和動物的健康和生命安全，給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在我國，本病嚴(yán)重流行于長江流域及其以南13個省、市、自治區(qū)。家畜如牛、羊、豬感染日本血吸蟲后，不僅禍害自身，更重要的是作為人體血吸蟲病的主要保蟲宿主，為傳播本病起了重要作用。大量調(diào)查研究表明，家畜是血吸蟲病流行最主要的傳染源和污染源?？刂苽魅驹词蔷C合防治疫病、撲滅疫情的重要環(huán)節(jié)，而控制傳染源的前提是確診傳染源。因此，應(yīng)用靈敏、快速、經(jīng)濟(jì)的診斷方法確診傳染源，己成為日本血吸蟲病流行病學(xué)調(diào)查

2、、疫情監(jiān)測、以及控制其流行和撲滅疫情必需解決的問題，這樣才能做到有的放矢，減少在人力、物力和財力等方面的浪費(fèi)。當(dāng)前對于日本血吸蟲病的診斷方法已有大量的報道，根據(jù)本科教學(xué)的需要，下面介紹幾種本科階段應(yīng)該掌握或者需要了解的實(shí)驗(yàn)室常用的日本血吸蟲病診斷方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙?.熟悉日本血吸蟲卵和毛蚴的形態(tài)特征。2.掌握血吸蟲病蟲卵檢查方法。3.掌握血吸蟲病毛蚴孵化方法。4.了解血吸蟲病的幾種常見的血清學(xué)（免疫學(xué)）診斷方法。二、實(shí)驗(yàn)器材(一)病原學(xué)診斷1直接涂片法。（1）檢驗(yàn)材料：新鮮動物糞便；（2）試劑：50%甘油水溶液或普通水；（3）器材：載玻片、滴管、蓋玻片、顯微鏡。2沉淀法。（1）檢驗(yàn)材料：

3、新鮮動物糞便；（2）試劑:普通水；（3）器材:專用乳白色塑料糞杯、竹筷、銅篩、滴管、金屬環(huán)、載玻片、顯微鏡（普通離心機(jī)）。3浮集法。（1）檢驗(yàn)材料：新鮮動物糞便；（2）試劑:普通水、飽和食鹽水、33的硫酸鋅溶液；（3）器材:專用乳白色塑料糞杯、竹筷、銅篩（60目/英寸）、滴管、金屬環(huán)、載玻片、顯微鏡。4.毛蚴孵化法。（1）檢驗(yàn)材料：新鮮動物糞便；（2）試劑：pH約6.8-7.2，溫度約20-30的滅菌自來水(脫氯處理)；（3）器械：專用乳白色塑料糞杯、竹筷、銅篩（40目/英寸）、尼龍篩網(wǎng)兜（260目/英寸）、塑料袋、長頸燒瓶（或三角瓶）（500ml）、脫脂棉、天平、溫箱。(二)血清學(xué)(免疫學(xué))

4、診斷1環(huán)卵沉淀試驗(yàn)（COPT）。（1）檢驗(yàn)材料：新鮮動物血清；（2）試劑：血吸蟲凍干蟲卵、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清；（3）器材：滴管、載玻片、蓋玻片（24×24mm）、蠟杯（熔蠟用）、玻璃蠟筆、脫脂棉、有蓋盤、酒精燈、溫箱、計數(shù)器、顯微鏡。2間接血凝試驗(yàn)法（IHA）。（1）檢驗(yàn)材料：動物血清；（2）試劑：生理鹽水、蒸餾水、血吸蟲病血凝抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清；（3）器材：96孔微量血凝板、25l和100l微量移液器。3膠乳凝集試驗(yàn)（LA）。（1）檢驗(yàn)材料：動物血清；（2）試劑：PAPS血吸蟲病快診液、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、生理鹽水、蒸餾水、磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH

5、7.2）；（3）器材：12×16cm玻璃凝集反應(yīng)板、25l和100l微量移液器、手術(shù)剪刀、潔凈紙、冰箱、中性濾紙（2.5×2.5cm）、2ml一次性注射器。4斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Dot-ELISA）。（1）檢驗(yàn)材料：動物血清。（2）試劑：三聯(lián)斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所）、生理鹽水、吐溫20、30%過氧化氫。（3）器材：5ml或10ml試管（多支）、試管夾、鑷子、50ml或100ml燒杯（多個）、100ml量筒、溫箱、50ml棕色試劑瓶、25l和100l微量移液器、小紙片多條。5. 免疫印跡試驗(yàn)。（1）檢驗(yàn)材料。動物血清。（2）主要試劑。樣本

6、緩沖液：含甘油10ml，2-巰基乙醇5ml，10%SDS 30ml。轉(zhuǎn)印緩沖液（TB）：Tris 3g，甘氨酸14g，甲醇250ml，加水至1000ml。Tris緩沖鹽水（TBS）：10mmol/L，Tris含0.9%NaCl，用1N HC1調(diào)pH至7.4。TBS-T液：TBS液內(nèi)含0.05%Tween-20的TBS液。猝火劑：1%5%BSA或0.1%0.3%Tween-20的TBS液。氨基黑染液：0.1%W/V氨基黑（C. I. 20470），45%V/V甲醇，10%V/V冰醋酸。脫色液：90%V/V甲醇，2%冰醋酸。（3）器材。/轉(zhuǎn)移電泳儀，硝酸纖維素膜，濾紙，剪刀，手套，小尺等。三、實(shí)驗(yàn)

7、方法、步驟和操作要領(lǐng)(一) 病原學(xué)診斷1.直接涂片法。糞便中蟲卵數(shù)量多時可采用直接涂片法檢查。用滴管在載玻片表面加50%甘油水溶液或普通水12滴，取黃豆大小的被檢糞塊放入液滴內(nèi)，混勻，剔除粗糞渣，加蓋蓋玻片，顯微鏡下鏡檢蟲卵（見圖20-1）。圖20-1. 日本血吸蟲蟲卵2沉淀法。 日本血吸蟲卵的比重大可沉集于水底，可采用自然沉淀法或離心沉淀法檢出。取糞便2030g、加水成混懸液，經(jīng)金屬篩（4060孔）或2、3層濕紗布過濾，再加清水沖洗殘渣；過濾糞液在容器中靜置25min，倒去上液，重新加滿清水，以后每隔1520min換水一次（34次），直至上液清晰為止。最后倒去上液，取沉渣作涂片鏡檢。附：離心

8、沉淀法將上述濾去粗渣的糞液離心（15002000rpm）12min，倒去上液，注入清水，再離心沉淀，如此反復(fù)沉淀34次，直至上液澄清為止，最后倒去上液，取沉渣鏡檢。3浮集法。利用比重較大的液體（日本血吸蟲卵比重約1.16），使日本血吸蟲蟲卵上浮，集中于液體表面。常用的方法有兩種：（1）飽和鹽水浮集法。用竹筷取黃豆粒大小的糞便置于浮集瓶（高3.5cm，直徑約2cm的圓形直筒瓶）中，加入少量飽和鹽水（比重約1.18）調(diào)勻，再慢慢加入飽和鹽水到液面略高于瓶口，但不溢出為止。此時在瓶口覆蓋一載玻片，靜置15min后，將載玻片提起并迅速翻轉(zhuǎn)，鏡檢。附：飽和鹽水配制將食鹽徐徐加入盛有沸水的容器內(nèi)，不斷攪動

9、，直至食鹽不再溶解為止。（2）硫酸鋅離心浮聚法。取糞便約1g，加1015倍的水，充分?jǐn)囁?，按離心沉淀法過濾，反復(fù)離心34次，至水清為止，最后倒去上液，在沉渣中加入比重1.18的硫酸鋅液（33的溶液），調(diào)勻后再加硫酸鋅溶液至距管口約1cm處，離心1min。用金屬環(huán)取表面的糞液置于載玻片上，加碘液一滴，鏡檢。4毛蚴孵化法。毛蚴孵化法是日本血吸蟲病病原學(xué)檢查最常用的方法。其操作步驟如下：（1）取新鮮糞便300g，攪拌混勻后分成三份，每份100g。（2）將分好的糞便置于40目銅篩濾杯內(nèi)，然后將該銅篩放入預(yù)先盛好水的糞杯內(nèi)進(jìn)行淘洗，淘洗時三上三下，力求將血吸蟲蟲卵全部洗下，除去濾渣。（3）將濾液倒入26

10、0目尼龍篩兜，用清水繼續(xù)淘洗，至濾水清晰。（4）將網(wǎng)兜內(nèi)糞樣捏干成團(tuán)塊包入紙內(nèi)，放入塑料袋內(nèi)保濕，在30溫箱中孵育24h。（5）將孵育好的糞樣倒入500ml的長頸燒瓶（或三角瓶）內(nèi)，加孵化用水至瓶頸處，在燒瓶瓶頸處塞一團(tuán)脫脂棉（脫脂棉與糞水之間不能留有空氣柱），再加清水至距瓶口12cm處，保持溫度在2226間，進(jìn)行孵化。（6）分別在開始孵化后1、3、5h各觀察一次,觀察時間2min以上。發(fā)現(xiàn)水面下有白色點(diǎn)狀物直線來回運(yùn)動，即為毛蚴，判為陽性，并記錄。（二）血清學(xué)（免疫學(xué)）診斷近些年來已將血清學(xué)診斷法應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，如環(huán)卵沉淀試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、膠乳凝集試驗(yàn)和斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。其檢出率可在

11、95%以上，假陽性率在5%以下。1環(huán)卵沉淀試驗(yàn)（COPT）。原理：環(huán)卵沉淀試驗(yàn)（circumovalprecipitintest，COPT）是以血吸蟲全卵為抗原的特異免疫血清學(xué)試驗(yàn)，卵內(nèi)毛蚴或胚胎分泌排泄的抗原物質(zhì)經(jīng)卵殼微孔滲出與檢測血清內(nèi)的特異抗體結(jié)合，可在蟲卵周圍形成特殊的復(fù)合物沉淀，在光鏡下判讀反應(yīng)強(qiáng)度并計數(shù)反應(yīng)卵的百分率稱環(huán)沉率。 操作步驟：（1）取載玻片，在其中央橫軸兩側(cè)涂兩條平行蠟，蠟間距離與蓋玻片寬度相同。（2）用滴管吸取被檢動物血清12滴（約25l），用針挑取蟲卵約100個，放入血清中，并用針攪拌，使蟲卵散開，蓋好蓋玻片，四周用蠟封閉。（3）將制好的玻片放入濕盒（在有蓋盤中預(yù)先

12、放置一層濕紗布），置37溫箱中培養(yǎng)。（4）48h后，取出切片在顯微鏡下觀察，記錄環(huán)沉情況，并計算環(huán)沉率。判定標(biāo)準(zhǔn)：（1）環(huán)沉判定標(biāo)準(zhǔn)。塊狀反應(yīng)物大于1/8而小于1/2蟲卵面積或索狀反應(yīng)物大于1/3而小于1/2蟲卵長徑，記為“+”或“+”；塊狀反應(yīng)物面積大于1/2蟲卵面積或索狀反應(yīng)物大于1/2蟲卵長徑，記為“+”或“+”。（2）陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。環(huán)沉率達(dá)5%者為陽性。環(huán)沉率%=（全片陽性反應(yīng)卵數(shù)/全片蟲卵數(shù)）×100%。2. 間接血凝試驗(yàn)法。原理：間接血凝試驗(yàn)（indirecthaemagglutinationtest，IHA）是以甲醛和鞣酸處理過的綿羊紅細(xì)胞或“O”型人紅細(xì)胞為載體，將血

13、吸蟲蟲卵或成蟲抗原吸附于載體上，當(dāng)受檢動物血清中存在相應(yīng)的抗體時，紅細(xì)胞會因抗原-抗體的結(jié)合而被動呈現(xiàn)凝集現(xiàn)象。IHA操作簡便，敏感性高，適于現(xiàn)場使用，可作為輔助診斷病人，流行病學(xué)調(diào)查及綜合查病方法。操作步驟：（1）用微量移液器在血凝板左邊第一孔、第二孔、第三孔內(nèi)分別加入生理鹽水100l、25l、25l。（2）在第一孔內(nèi)加入被檢血清25l，混勻，使血清成15稀釋。（3）吸取25l第一孔的血清液，加入第二孔，混勻，此孔血清成110稀釋。（4）吸取25l第二孔的血清液，加入第三孔，混勻，此孔血清成120稀釋。然后吸取25l此孔血清液丟棄。（5）如有多份樣本，每個樣本均按上述操作處理。（6）陽性對照

14、和陰性對照采用標(biāo)準(zhǔn)血清也按上述操作處理。另外用生理鹽水設(shè)空白對照。（7）用移液器吸取血吸蟲病血凝抗原，在各個樣本和對照的110和120的稀釋孔分別加25l，震蕩混勻，置于37條件下。當(dāng)空白或陰性血清兩孔的血球全部沉于孔底中央（即無圓形紅點(diǎn)或僅有小的圓形紅點(diǎn)）時，即可判定診斷結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：（1）反應(yīng)強(qiáng)度判定。紅血球全部下沉到孔底中央，形成緊密紅色圓點(diǎn)，周緣整齊為陰性“-”。紅血球少量沉于孔底中央，形成一較陰性小的紅色圓點(diǎn)，周圍有少量凝集紅血球?yàn)槿蹶栃浴?”。紅血球半數(shù)沉于孔底中央，形成一更小的紅色圓點(diǎn)，周圍有一層淡紅色凝集紅血球?yàn)殛栃浴?”。紅血球75%以上散于孔底斜面，形成一層淡紅色薄層為強(qiáng)

15、陽性“+”。紅血球全部凝集，均勻散于孔底斜面，形成一層淡紅色薄層為強(qiáng)陽性“+”。（2）陽性血清判定以血清110稀釋孔出現(xiàn)陽性（包括弱陽性）時被檢血清判定為血吸蟲病畜陽性。3膠乳凝集試驗(yàn)（LA）。原理：膠乳凝集試驗(yàn)(latex agglutination test)是以聚苯乙烯膠乳顆粒為載體,將血吸蟲抗原聯(lián)結(jié)在膠乳顆粒上。試驗(yàn)時將一定量的聯(lián)結(jié)有抗原的膠乳試劑加入待檢血清中，如待檢血清中有相應(yīng)的抗體，則抗原抗體結(jié)合，膠乳顆粒發(fā)生凝集。操作步驟：（1）在12×16cm玻璃凝集反應(yīng)板的左邊第一孔中加PBS液100l，第二孔加PBS液25l。（2）在第一孔中加待檢血清25l，混勻，使第一孔成1

16、5稀釋。（3）在第二孔中加第一孔稀釋血清液25l，混勻，使第二孔成110稀釋。（4）在每孔中加PAPS快診液25l，混勻，10min后觀察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：（1）反應(yīng)強(qiáng)度判定。12min內(nèi)膠乳全部凝集出現(xiàn)粗顆粒，并且四周形成一白色框邊，液體清亮，記為“+”。34min內(nèi)膠乳全部凝集出現(xiàn)粗顆粒，四周白色框邊不太明顯，液體較清亮，記為“+”。56min內(nèi)70%80%膠乳出現(xiàn)凝集顆粒，液體微渾濁，記為“+”。810min內(nèi)40%50%膠乳出現(xiàn)凝集顆粒，液體微渾濁，記為“+”。不出現(xiàn)凝集顆粒，呈白色均勻渾濁狀，記為“-”。（2）陽性血清判定。110 (第二孔)血清稀釋孔出現(xiàn)“+”即判為陽性。4斑點(diǎn)酶聯(lián)免

17、疫吸附試驗(yàn)（Dot-ELISA）。原理：斑點(diǎn)ELISA（dot-ELISA）是在ELISA技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種技術(shù)，選用對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)吸附能力的硝酸纖維素薄膜作固相載體，底物經(jīng)酶促反應(yīng)后形成有色沉淀物使薄膜著色，然后目測或用光密度掃描儀定量。dot-ELISA可用來檢測抗體，也可用來檢測抗原，由于該法檢測抗原時操作較其他免疫學(xué)試驗(yàn)簡便，故目前多用于抗原檢測。試劑準(zhǔn)備：本實(shí)驗(yàn)采用三聯(lián)斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所），試劑盒內(nèi)有試劑1、2、3、4、5，試劑6、7、8、9、10需現(xiàn)配現(xiàn)用，配置方法如下：試劑6：1包試劑1配500ml生理鹽水，溶解后加入2ml吐溫20，

18、混勻。試劑7：1包試劑2配500ml生理鹽水，溶解后即成。試劑8：量取25ml試劑6倒入燒杯中，將試劑3紙片浸入即成。試劑9：吸取5ml試劑6加入試劑4中，待溶解后倒入燒杯中，再量取20ml試劑6洗試劑4瓶3次，倒入燒杯中，混勻即成。試劑10：量取40ml試劑7倒入燒杯中，將試劑5加入，置37溫箱避光溶解后，取出在室溫下置于避光容器（棕色瓶）中待用。操作步驟：（1）用記號筆在試管上標(biāo)好待檢血清號碼，用鉛筆在診膜右端遍上待檢血清號碼，用剪刀將膜條剪下，放入相應(yīng)試管中。（2）分別在每個試管中加入1.5ml的試劑6。（3）分別在各個試管中加4l相應(yīng)編號的待檢血清，輕輕搖勻。（4）將搖勻的試管置于37

19、溫箱中孵育5060分鐘，每隔20分鐘輕輕搖動試管一次。（5）取燒杯一只，加入約40ml試劑6，用鑷子將每支試管中膜夾出，放入盛有試劑6的燒杯中，每隔2分鐘，輕輕搖動洗滌1次，共計三次。（6）洗滌好的膜用鑷子夾出，放在濾紙上吸去膜表面水后，放入盛有試劑8的燒杯中，用鑷子翻動膜，使其充分接觸液體，然后，置于37溫箱中反應(yīng)5060min，隔25min用鑷子翻動膜1次。(7) 反應(yīng)結(jié)束后洗滌膜三次，方法同5。(8) 用濾紙吸去膜表面水后，將膜放入盛有試劑9的燒杯中，用鑷子翻動膜，使膜浸在液體中，置于37溫箱中反應(yīng)40分鐘，隔25分鐘用鑷子翻動膜1次。(9) 反應(yīng)結(jié)束后洗滌膜三次，方法同5和7。(10)

20、用可調(diào)微量移液器吸取30%過氧化氫40l，加入盛有試劑10的燒杯中搖勻后，迅速用濾紙吸去膜表面水，放入燒杯中，輕輕搖動，待有任一清晰斑點(diǎn)出現(xiàn)后終止反應(yīng)。(11)將燒杯中的反應(yīng)液棄去，用自來水充分洗滌至水清為止。然后判定結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：（1）反應(yīng)強(qiáng)度判定。深棕色為“+”，淺棕色為“+”，黃色為“+”，淺黃色為“+”，稍有黃色為±，無色為“”（2）陽性血清判定。凡出現(xiàn)“+”即判為陽性血清。5免疫印跡試驗(yàn)。原理：免疫印跡試驗(yàn)（immunoblot或Westernblot）是由十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），電泳轉(zhuǎn)印及標(biāo)記免疫試驗(yàn)三項(xiàng)技術(shù)結(jié)合而成的一種新型的免疫探針技術(shù)（

21、immuno-probingtechnique），是用于分析蛋白抗原和鑒別生物學(xué)活性抗原組分的有效方法，近年來已應(yīng)用于檢測寄生蟲感染宿主體液內(nèi)針對某分子量抗原的相應(yīng)循環(huán)抗體成分或譜型，是一項(xiàng)高敏感和高特異的診斷方法，具有很大發(fā)展?jié)摿?。用于診斷的免疫印跡試驗(yàn)以采用酶標(biāo)記的探針（即二抗及其標(biāo)記結(jié)合物）為安全方便，稱酶免疫轉(zhuǎn)移印跡試驗(yàn)（enzymeimmuno-transferblotting，EITB）。操作程序：樣本分離。取日本血吸蟲新鮮成蟲按510對1.5ml比例加樣本緩沖液，勻漿，置沸水浴2分鐘，離心（10000g，30min），取上清液備用。上述成蟲抗原樣本進(jìn)行單梳SDSPAGE電泳分離。

22、左側(cè)梳孔加標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，梳孔右側(cè)樣槽加抗原液，電壓控制在160180V之間。 電泳轉(zhuǎn)印。從電泳板中取出已完成電泳的凝膠片浸泡于盛有轉(zhuǎn)印緩沖液（TB）的搪瓷盤內(nèi)。在TB液內(nèi)組成轉(zhuǎn)印夾心板層：取相應(yīng)大小的硝酸纖維（NC）薄膜，徐徐浸泡在TB液，將凝膠片與薄膜光面緊貼。兩面各放置浸濕濾紙兩層而后海綿墊（厚0.51cm）一層，做好方位標(biāo)記，最后夾于二層有孔塑料襯板之間，絕對避免各層之間留有氣泡。將TB倒入轉(zhuǎn)印槽中，然后插入轉(zhuǎn)印板，使凝膠片位于陰極側(cè)，NC薄膜位于陽極側(cè)。置轉(zhuǎn)印槽于4冰箱內(nèi)，通電轉(zhuǎn)印數(shù)小時或過夜，電流控制在250mA上下（約4050V）。 探針檢測。取出轉(zhuǎn)印好的NC薄膜，水平地放入猝火劑中，室溫?fù)u動1h以封閉未吸附蛋白質(zhì)的區(qū)域，然后用洗滌緩沖液選23次，每次30min以除去變性劑，使蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)和生物學(xué)特性得以恢復(fù)。平置NC薄膜于浸有Tris-緩沖鹽水（TBS）的濾紙上，用刀片將薄膜按電泳方向分割為寬約0.5cm的