消毒劑消毒效力及有效期驗證方案20140805

1、消毒劑消毒效力及有效期驗證方案編號：XXX-XXXXXX-XX版本號： 00頁 號：119/119消毒劑消毒效力及有效期驗證方案 起草人驗證技術(shù)部 簽名日期 審核人驗證技術(shù)部經(jīng)理 簽名 日期 審核人QC經(jīng)理 簽名日期 審核人QA經(jīng)理 簽名日期 批準人質(zhì)量總監(jiān) 簽名 日期 目 錄1. 目的42. 范圍43. 概述44. 風(fēng)險評估85. 職責(zé)86. 定義與縮寫97. 參考文件98. 培訓(xùn)99. 內(nèi)容910. 偏差和變更處理 1911. 驗證記錄191.目的確認潔凈區(qū)按照規(guī)定的清潔、消毒程序進行清潔消毒后，能夠達到防止交叉污染的目的，并在消毒有效期內(nèi)能確保達到生產(chǎn)工藝所需要的效果。潔凈區(qū)用消毒劑對地

2、漏、地面、墻面、操作臺、設(shè)備表面及非滅菌容器具表面等進行消毒，旨在控制微生物污染水平，防止微生物在藥品生產(chǎn)環(huán)境中污染及交叉污染，保證生產(chǎn)環(huán)境符合工藝衛(wèi)生要求，最終保證藥品質(zhì)量。2.范圍本方案適用于本公司A級、B級、C級、D級潔凈區(qū)使用的消毒劑消毒效力及有效期的驗證，適用于本公司潔凈區(qū)的墻面、天花板、門窗、機器設(shè)備、儀器、操作臺、地漏、推車、桌椅等表面以及操作人員雙手（手套）的消毒等，7種消毒劑：手消毒液、75%乙醇、新潔爾滅、84消毒液、LpH st酸性苯酚、Vesphene II st堿性苯酚、Spor-Klenz殺孢子劑。3.概述本公司潔凈區(qū)分為A級、B級、C級、D級，擬定用于潔凈區(qū)消毒的

3、有7種消毒劑，本次驗證方案將選用以下7種消毒劑分別進行驗證實驗。l 手消毒液主要成分：63%75%乙醇和0.45%0.55%醋酸氯己定。l 84消毒液主要成分：次氯酸鈉，有效氯含量為17.023.0g/ml。l LpH st酸性苯酚主要成分：對叔戊基苯酚7.6%、鄰苯基苯酚7.7%、溶劑84.7%。l Vesphene II st堿性苯酚主要成分：對叔戊基苯酚7.66%、鄰苯基苯酚9.09%、溶劑84.7%。l Spor-Klenz殺孢子劑主要成分：過乙酸、過氧化氫和醋酸的混合物，含有1.0%的過氧化氫和0.08%的過乙酸。l 新潔爾滅：5%苯扎溴銨。l 75%乙醇：對95%乙醇進行稀釋。3.

4、1.消毒劑適用范圍消毒劑名稱潔凈級別適用范圍手潔凈服室內(nèi)設(shè)備內(nèi)表面設(shè)備外表面水池、地漏75%乙醇A/B級××××-C級×××××新潔爾滅A/B級×××××-C/D級×××××酸性苯酚A/B級×××-C/D級×××堿性苯酚A/B級×××-C/D級×××Spor-Klenz殺孢子劑A/B級&#

5、215;×-C/D級××××××84消毒液A/B級×××××-C/D級×××××手消毒液A/B級××××-D級×××××備注：1、室內(nèi)包括：地面、墻面、門窗、天花板、燈具等。 2、75%乙醇是唯一允許在生產(chǎn)過程中使用的消毒劑，如在無菌灌裝過程中定時對操作人員的手部進行消毒。3.2.消毒劑的配制方法消毒劑名稱配制方法手消毒液直接使用。75%

6、乙醇按C1V1=C2V2 的計算公式，計算配制一定體積75%乙醇溶液需要的95%的乙醇的量，如：配制1000ml75%乙醇溶液，需要95%乙醇的量為：800ml按95%乙醇：水=4：1的體積比配制，攪勻，即得。0.1%新潔爾滅按5%苯扎溴銨：純化水（或注射用水）=1：50的體積比配制，攪勻，即得。0.01%新潔爾滅按5%苯扎溴銨：純化水（或注射用水）=1：500的體積比配制，攪勻，即得。0.04%84消毒液按2% 84消毒液：純化水=1：50的體積比配制，攪勻，即得。酸性苯酚按酸性苯酚：純化水（或注射用水）=1：256的體積比配制。緩慢加入純化水或注射用水中，邊加邊攪拌，攪勻，即得。堿性苯酚按

7、堿性苯酚：純化水（或注射用水）=1：128的體積比配制。緩慢加入純化水或注射用水中，邊加邊攪拌，攪勻，即得。Spor-Klenz殺孢子劑用作殺孢子劑時不經(jīng)稀釋直接使用。也可按1:50比例稀釋后可作為普通消毒劑使用（暫不應(yīng)用）。3.3.消毒劑的貯存條件及貯存期3.3.1.開瓶后原液的貯存條件和貯存期名 稱貯存條件貯存期手消毒液密閉保存1個月95%乙醇密閉保存1個月新潔爾滅遮光，密閉保存1個月84消毒液密閉保存1個月酸性苯酚密閉保存56天堿性苯酚密閉保存54天Spor-Klenz殺孢子劑低于24，密閉保存一年備 注1、本貯存期指消毒劑原包裝開口后的貯存期。2、未打開包裝的消毒劑貯存期執(zhí)行各品種項下

8、規(guī)定的貯存期或有效期。3、未打開包裝的消毒劑未規(guī)定貯存期或有效期的統(tǒng)一按2年執(zhí)行。3.3.2.配制后的消毒液貯存條件及貯存期名 稱貯存條件及貯存期75%乙醇密閉保存。C級及以下區(qū)域的7天，除菌過濾后用于B級區(qū)域為3天。0.1%新潔爾滅溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，使用期不超過2小時。0.01%新潔爾滅溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，使用期不超過2小時。0.04%84消毒液現(xiàn)用現(xiàn)配，使用期不超過2小時。酸性苯酚溶液密閉保存。C級及以下區(qū)域的14天，除菌過濾后用于B級區(qū)域為3天。堿性苯酚溶液密閉保存。C級及以下區(qū)域的14天，除菌過濾后用于B級區(qū)域為3天。3.4.作用對象一樣的消毒劑每月輪換使用，避免表面微生物產(chǎn)生耐藥菌株。在利用消

9、毒劑進行表面擦拭消毒過程中消毒劑的作用時間應(yīng)不少于10分鐘，利用消毒劑進行浸泡消毒的不少于10分鐘。4.風(fēng)險評估及驗證錯略失效模式潛在風(fēng)險風(fēng)險級別現(xiàn)有控制措施是否降低建議采取措施消毒劑配制濃度不符合要求1.沒有起到消毒作為2.對操作人員產(chǎn)生傷害中核對配制過程與SOP一致是在驗證中由驗證主管進行確認，日常操作需要雙人復(fù)核消毒劑作用時間不夠消毒效果不能保證中規(guī)定好消毒方法，保持消毒方式持續(xù)一致是在驗證中由驗證主管進行確認，日常操作需要雙人復(fù)核消毒劑有影響藥品質(zhì)量殘留藥物安全性高檢查材質(zhì)證明和安全數(shù)據(jù)是在本驗證中確認消毒劑的安全數(shù)據(jù)消毒劑輪換不能起到避免抗藥性的作用細菌產(chǎn)生抗藥性中參與輪換消毒劑抗菌

10、譜的核對以及輪換試驗數(shù)據(jù)的核查是在本驗證中確認消毒劑的相關(guān)數(shù)據(jù)消毒劑消毒效力不足消毒能力不能保證消毒要求，導(dǎo)致微生物不良高消毒劑消毒效力驗證是對每種消毒劑進行相關(guān)應(yīng)用消毒效力驗證消毒劑開啟后存放周期內(nèi)效力降低消毒能力不能保證消毒要求，導(dǎo)致微生物不良高消毒劑有效期驗證是對需要存放的消毒劑進行相關(guān)應(yīng)用的有效期驗證新潔爾滅溶液消毒失效可能對C/D衣物生物負荷不能控制低現(xiàn)用現(xiàn)配，使用期不超過2小時。是日常檢查配制方法，觀察氣泡情況，無需消毒效力和效期驗證。84消毒液失效可能對C/D鞋生物負荷不能控制低現(xiàn)用現(xiàn)配，使用期不超過2小時。是日常檢查配制方法，無需消毒效力和效期驗證。4.1.為了確認消毒劑的消毒

11、效力，通過實驗室考察部分和現(xiàn)場考察部分分別進行驗證。其中，用定量懸浮試驗法和表面實驗法進行實驗室考察試驗部分。潔凈區(qū)設(shè)施表面材質(zhì)有不銹鋼和玻璃兩種，故表面試驗法選用不銹鋼載片和玻璃裁片模擬潔凈區(qū)設(shè)施表面進行驗證試驗。三種試驗方法作用的消毒劑見表。序號消毒劑試驗方法中和劑鑒定試驗表面實驗法定量懸浮試驗法1手消毒液275%乙醇3酸性苯酚溶液4堿性苯酚溶液5Spor-Klenz殺孢子劑現(xiàn)場考察試驗部分選擇QC無菌檢驗室（A/B級）、QC微生物消毒檢測室（C級）、QC陽性菌室（D級）設(shè)備表面消毒前和消毒后分別進行取樣，測定其微生物數(shù)量。4.2.消毒劑有效期確認試驗通過該試驗，確定消毒劑在有效期內(nèi)是穩(wěn)定

12、的，并且消毒效力不會發(fā)生變化，符合要求。在進行消毒劑有效期確認時，每天開啟裝消毒劑的容器不少于5次，以模擬實際操作的最差條件。5.職責(zé)5.1.驗證技術(shù)部：負責(zé)驗證方案的編寫審核，在執(zhí)行前完成對方案及記錄的審核和批準；確保按照批準的方案實施，起草審核驗證報告；負責(zé)驗證偏差、變更的報告及糾偏措施的審核，確保能及時發(fā)現(xiàn)偏差，并按照已經(jīng)達成一致偏差處理方法對其進行記錄、糾正、調(diào)查和最終確認；負責(zé)對驗證小組成員進行本方案的培訓(xùn)。5.2.質(zhì)保部：執(zhí)行前完成對方案及記錄的審核；負責(zé)驗證記錄的歸檔及驗證偏差糾偏措施的批準和糾正措施結(jié)果的確認；負責(zé)驗證過程的監(jiān)控和檢查，保證驗證方案的實施，參與驗證結(jié)果評價。參與

13、驗證偏差的調(diào)查、處理和評估和變更控制。負責(zé)驗證方案、報告的批準。5.3.其它成員職責(zé)：執(zhí)行前確認方案已批準，并經(jīng)過培訓(xùn)；按驗證方案實施驗證，收集、整理驗證數(shù)據(jù)，完成驗證記錄和報告；參與驗證偏差的調(diào)查和處理，確認并通過偏差修訂和解決方案。 5.4.質(zhì)量總監(jiān)：負責(zé)方案的批準。6.定義與縮寫英文縮寫英文全稱中文名稱SOPStandard Operating Procedure標準操作規(guī)程7.參考文件變更管理SOP（SOP-0160-002）；驗證的組織和實施（SOP-0310-001）；車間清潔劑、消毒劑管理SOP （SOP-1030-005）潔凈區(qū)表面微生物監(jiān)測SOP（SOP-0120-010）藥

14、品生產(chǎn)驗證指南微生物檢測驗證技術(shù)（中國醫(yī)藥科技出版社）8.培訓(xùn)確認參與驗證的人員都經(jīng)過此方案和相關(guān)SOP的培訓(xùn)，將檢查結(jié)果記錄在附錄2：培訓(xùn)檢查和簽字確認。9.內(nèi)容9.1.驗證前準備9.1.1.確認的相關(guān)SOP和在驗證過程中用到的相關(guān)文件，同時對消毒劑安全性數(shù)據(jù)和抗菌譜等信息進行檢查，將檢查結(jié)果記錄在文件檢查內(nèi)，見附錄1。9.1.2.驗證用試劑與材料9.1.2.1.菌種序號名稱序列號1金黃色葡萄球菌CMCC(B)260032大腸埃希菌CMCC(B)441023枯草桿菌芽孢CMCC(B)635014白色念珠菌CMCC(F) 98001 5環(huán)境分離菌HJFL130019.1.2.2.培養(yǎng)基序號名稱

15、備注1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基經(jīng)121，20min滅菌備用2營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基4改良馬丁培養(yǎng)基5大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基接觸碟規(guī)格：f55mm，取樣面積為25m29.1.2.3.消毒液擬定選用的中和劑序號消毒劑名稱中和劑備注175%乙醇1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑經(jīng)121，20min滅菌備用。2手消毒液3酸性苯酚溶液4堿性苯酚溶液5Spor-Klenz殺孢子劑用1% 蛋白胨，0.1%硫代硫酸鈉，加上1.4% KH2 PO4，把pH值調(diào)至7.2到7.4. 通過蒸汽滅菌柜滅菌。就在使用中和劑之前，在每份50ml的溶液中，無菌添加1ml，無菌過濾過的0.625%濃度的過氧化氫酶（

16、100微升的過氧化氫酶+9.8ml的稀釋液里=0.625%的濃度，氧化氫酶活力單位1000 u/mL）9.1.2.4.稀釋液0.9%無菌氯化鈉溶液（NS）9.1.2.5.器具及設(shè)備序號名稱規(guī)格/型號1無菌移液管0.5ml、5ml、10ml2錐形瓶150ml3無菌試管N/A4漩渦混合器XW-80A5恒溫水浴鍋HWS-266生化培養(yǎng)箱LRH-800F9.1.2.6.驗證用試劑與材料記錄見附錄3。9.2.消毒劑消毒效力試驗9.2.1.中和劑鑒定試驗9.2.1.1.試驗?zāi)康耐ㄟ^該試驗，確認所用的中和劑對對應(yīng)的消毒劑有良好的中和作用，對試驗用菌劑及其恢復(fù)期培養(yǎng)示范有害或不良影響。9.2.2.菌液的制備及

17、計數(shù)9.2.2.1.金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌和環(huán)境分離菌工作菌液的制備接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌和環(huán)境分離菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824小時。取上述培養(yǎng)物用0.9無菌氯化鈉溶液做10倍系列稀釋成5×1055×106CFU/ml的工作菌液（如肉湯培養(yǎng)物的濃度已為1×1085×108CFU/ml，可不再用0.9無菌氯化鈉溶液稀釋）。計數(shù)時，將5×1055×106CFU/ml的工作菌液10倍系列稀釋成含50100CFU/ml菌液，并同時采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基3035培養(yǎng)2天計數(shù)。計算

18、該稀釋級的平均菌落數(shù)，將計數(shù)結(jié)果換算成每毫升濃菌液的菌落數(shù)。9.2.2.2.白色念珠菌工作菌液的制備接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，2328培養(yǎng)2448小時。取上述培養(yǎng)物用0.9無菌氯化鈉溶液做10倍系列稀釋成5×1055×106CFU/ml的工作菌液（如肉湯培養(yǎng)物的濃度已為5×1055×106CFU/ml，可不再用0.9無菌氯化鈉溶液稀釋）。計數(shù)時，將5×1055×106CFU/ml的工作菌液10倍系列稀釋成含50100CFU/ml菌液，并同時采用改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基2328培養(yǎng)3天計數(shù)。計算該稀釋級的平均菌落數(shù)，將計數(shù)

19、結(jié)果換算成每毫升濃菌液的菌落數(shù)。9.2.3.鑒定試驗操作9.2.3.1.配制75%乙醇、0.1%新潔爾滅溶液、0.01%新潔爾滅溶液、手消毒液、0.04%84消毒液、1:256酸性苯酚、1:128堿性苯酚、Spor-Klenz殺孢子劑。將配置好的消毒劑置20±1恒溫水浴鍋中備用。9.2.3.2.分組操作試驗分組及稀釋操作方法簡表組號混合液A混勻作用10min混合液B混勻作用10min取混合液B或混合液B的稀釋級溶液0.5ml平板計數(shù)（2皿/組）取0.5ml工作菌液加入下列溶液中取混合液A 0.5ml加入下列溶液1消毒劑4.5ml稀釋液4.5ml混合液B、10-12消毒劑4.5ml中和

20、劑4.5ml混合液B、10-13中和劑4.5ml稀釋液4.5ml10-2、10-34中和產(chǎn)物4.5ml（消毒液與中和劑比例為1:1）稀釋液4.5ml10-2、0-35稀釋液4.5ml稀釋液4.5ml10-2、10-36稀釋液和中和劑各1.0ml注入無菌平皿中，各制備2皿，作為陰性對照組。具體操作l 第1組目的：觀察消毒液對試驗菌有無殺滅或抑制能力。操作：取消毒劑4.5ml+工作菌液0.5ml，混勻作用10min后，取混合液B 0.5ml+稀釋液4.5ml，混勻作用10min，取混合液B和10-10.5ml注皿，平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌和環(huán)境分離菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

21、，倒置3035培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置2328培養(yǎng)5天計數(shù)計數(shù)。l 第2組目的：觀察殘留消毒劑被中和后受到消毒劑作用后的試驗菌是否恢復(fù)生長。操作：取消毒劑4.5ml+工作菌液0.5ml，混勻作用10min后，取混合液A 0.5ml +中和劑4.5ml，混勻作用10min，用稀釋液稀釋成10-1。分別取未稀釋溶液即混合液B（混合液0.5mll+中和劑4.5ml的混合液）及10-1 0.5ml注皿，各平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌和環(huán)境分離菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置于3035培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置于2328培養(yǎng)5天計數(shù)。

22、l 第3組目的：觀察中和劑是否有抑菌性、毒性操作：取中和劑4.5ml+工作菌液0.5ml，混勻作用10min，取混合液0.5ml l+稀釋液4.5ml，混勻作用10min后，用稀釋液進行10倍系列稀釋成10-2、10-3。取相應(yīng)稀釋級0.5ml注皿，各稀釋級平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌和環(huán)境分離菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置3035培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置2328培養(yǎng)5天計數(shù)計數(shù)。l 第4組目的：觀察中和產(chǎn)物，或未被完全中和殘留消毒劑對試驗菌的生長繁殖是否有影響。操作：取消毒劑和中和劑1:1的混合液4.5ml+工作菌液0.5ml，混勻作用10mi

23、n，取混合液0.5ml l+稀釋液4.5ml，混勻作用10min后，用稀釋液進行10倍系列稀釋成10-2、10-3。取相應(yīng)稀釋級0.5ml注皿，各稀釋級平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌和環(huán)境分離菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置3035培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置2328培養(yǎng)5天計。l 第5組目的：作陽性對照用操作：取稀釋液4.5ml+工作菌液0.5ml，混勻作用10min，取混合液0.5ml l+稀釋液4.5ml，混勻作用10min后，用稀釋液進行10倍系列稀釋成10-2、10-3。取相應(yīng)稀釋級0.5ml注皿，各稀釋級平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希

24、菌、枯草桿菌芽孢菌和環(huán)境分離菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置3035培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置2328培養(yǎng)5天計數(shù)。l 第6組目的：作為陰性對照用操作：分別取稀釋液和中和劑各1.0ml注入無菌平皿中，各制備2皿。9.2.3.3.結(jié)果判斷試驗結(jié)果應(yīng)符合下列全部條件，判斷所選中和劑合格。l 第1組無菌生長，或僅有少數(shù)試驗菌菌落生長。l 第2組菌落數(shù)比第1組菌落數(shù)多，但比第3、4、5組菌落數(shù)少，且符合下表要求第1組平板平均菌落數(shù)第2組平板平均菌落數(shù)05x(x+5)y(y+0.5y)l 第3、4、5組有相似菌落數(shù)生長，其每組間菌落數(shù)誤差率不超過15%。計算公式如下：（3組間菌落平均數(shù)-

25、各組菌落平均數(shù)）的絕對值之和誤差率×1003×3組間菌落平均數(shù)l 第6組無菌生長。否則，說明試劑有污染，應(yīng)重新進行試驗。9.2.4.中和劑鑒定試驗記錄見附錄4。9.3.定量懸浮試驗9.3.1.試驗?zāi)康挠捎?.1%新潔爾滅溶液、0.01%新潔爾滅溶液、0.04%84消毒液、1:256酸性苯酚、1:128堿性苯酚、Spor-Klenz殺孢子劑是通過浸泡或液封消毒，通過定量懸浮試驗，確定其消毒效力是否符合要求。9.3.2.試驗操作9.3.2.1.配制0.1%新潔爾滅溶液、0.01%新潔爾滅溶液、0.04%84消毒液、1:256酸性苯酚、1:128堿性苯酚、Spor-Klenz殺孢

26、子劑。將配置好的消毒劑置20±1恒溫水浴鍋中備用。9.3.2.2.由于0.1%新潔爾滅溶液、0.01%新潔爾滅溶液、0.04%84消毒液、1:256酸性苯酚、1:128堿性苯酚中低效消毒劑，且不能殺滅芽孢，故定量懸浮試驗用菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌和環(huán)境分離菌。Spor-Klenz殺孢子劑為高效消毒劑，能殺滅芽孢，故定量懸浮試驗用菌枯金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌和環(huán)境分離菌。9.3.2.3.將菌液制備成1×1071×107CFU/ml的工作菌液，菌液的制備及計數(shù)同8.1.2。9.3.2.4.將試管按需要分組排列在試管架上，試

27、驗組分3組（8min、10min、12min各一組），并由左向右逐管標明消毒劑、中和劑、10-1、10-2。對照組1組，并由左向右逐管標明稀釋液、中和劑、10-1、10-2、10-3、10-4。9.3.2.5.向各消毒劑、中和劑、稀釋液試管加入4.5ml相應(yīng)的試劑，向標明10-1、10-2、10-3、10-4。加入4.5ml的稀釋液。9.3.2.6.吸取工作菌液0.5ml加入標明消毒劑的試管中，對照組加入標明稀釋液的試管中，迅速混勻，并開始計時。9.3.2.7.待菌液與消毒劑相互作用至8min、10min、12min，吸取菌液和消毒劑混合液0.5ml，加入標明中和劑的試管中，迅速混勻。 9.3

28、.2.8.中和作用10min后，吸取0.5ml加入標明10-1的試管中，混勻后吸取0.5ml加入標明10-2試管中（對照組以此類推，對照組直至10-4）。9.3.2.9.試驗組分別取中和劑管、10-1、10-2管溶液1ml按平皿法測定存活菌數(shù)；對照組取10-3、10-41ml按平皿法測定存活菌數(shù)。每管平行制備2皿。9.3.2.10.金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌和環(huán)境分離菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置于3035培養(yǎng)2天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置于2328培養(yǎng)3天計數(shù)計數(shù)。9.3.3.結(jié)果計算計算試驗組和對照組的活菌濃度 （CFU/ml），并換算為對數(shù)值（N），并

29、按下式計算殺滅對數(shù)值: 殺滅對數(shù)值 (KL)對照組平均活菌濃度的對數(shù)值（NO）試驗組活菌濃度對數(shù)值（NX）9.3.4.可接受標準殺滅對數(shù)值 (KL)應(yīng)不低于35個對數(shù)單位。9.3.5.定量懸浮試驗記錄見附錄59.4.表面試驗法9.4.1.試驗?zāi)康挠捎?5%乙醇、手消毒液、1:256酸性苯酚、1:128堿性苯酚、Spor-Klenz殺孢子劑是通過擦拭消毒，故選用不銹鋼載片和玻璃裁片進行表面試驗法，確定其消毒效力是否符合要求。9.4.2.菌種選擇由于75%乙醇、手消毒液、1:256酸性苯酚、1:128堿性苯酚為中低效消毒劑，且不能殺滅芽孢，故表面試驗用菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃

30、希菌、白色念珠菌和環(huán)境分離菌。Spor-Klenz殺孢子劑為高效消毒劑，能殺滅芽孢，故表面試驗用菌枯金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌和環(huán)境分離菌。9.4.3.工作菌液制備工作菌液的制備方法、濃度及驗證同步計數(shù)操作同8.1.2。9.4.4.試驗操作9.4.4.1.（1） 染菌不銹鋼載片制備將經(jīng)滅菌的載片平鋪于無菌平皿內(nèi)，滴加金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌含菌和環(huán)境分離菌量為1×1085×108CFU的菌液0.1ml，并均勻涂布于整個載體表面。滴染菌液后，載片置超凈工作臺晾干后備用。每種菌平行制備兩個染菌不銹鋼載片。（2）染菌玻璃載片制備因培養(yǎng)皿的

31、材質(zhì)為玻璃，故用培養(yǎng)皿代替玻璃載片進行染菌試驗。進行菌液滴染前，用記號筆在培養(yǎng)皿菌液滴染面的背面畫出染菌面積（50mm×50mm），標注清晰。菌液滴染操作同染菌不銹鋼載片制備。9.4.4.2.l 試驗組：將消毒劑擦拭在制備好的染菌載片上，消毒劑作用時間分別為8min、10min、12min，不銹鋼載片和玻璃載片每個作用時間分別制備2個。作用結(jié)束后，用接觸碟取樣（接觸碟規(guī)格：f55mm，取樣面積為25m2）。取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基接觸碟；取樣白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基接觸碟。接觸碟取樣方法：打開接觸碟蓋，使無菌培養(yǎng)基表面與取樣面直接接觸，

32、均勻按壓接觸碟底板，確保全部瓊脂表面與取樣面表面均勻接觸10秒左右，在蓋上跌蓋。l 對照組對照組的活菌濃度計數(shù)見8.3.3。.l 陰性對照：用接觸碟在已滅菌的載片上（未染菌片的載）按壓取樣，操作同上。每種載片及每種接觸碟平行制備兩份。9.4.4.3.培養(yǎng)將取樣金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌的接觸碟倒置于3035培養(yǎng)2天計數(shù)；取樣白色念珠菌的接觸碟倒置于2328培養(yǎng)3天計數(shù)計數(shù)。9.4.4.4.結(jié)果計算計算試驗組和對照組的活菌濃度 （CFU/ml），并換算為對數(shù)值（N），并按下式計算殺滅對數(shù)值: 殺滅對數(shù)值 (KL)對照組平均活菌濃度的對數(shù)值（NO）試驗組活菌濃度

33、對數(shù)值（NX）9.4.5.可接受標準殺滅對數(shù)值 (KL)應(yīng)不低于35個對數(shù)單位。9.4.6.表面試驗法記錄見附錄69.5.現(xiàn)場考察試驗9.5.1.消毒前對潔凈區(qū)進行表面微生物取樣。取樣地點： QC陽性菌室（D級）一墻壁和設(shè)備表面、QC微生物消毒檢測室（C級）墻壁和設(shè)備表面、QC無菌檢驗室（B級）墻壁和設(shè)備表面、QC無菌檢驗室室超凈工作臺（A/B級）設(shè)備表面。取樣操作及檢驗執(zhí)行潔凈區(qū)表面微生物監(jiān)測SOP。9.5.2.QC檢驗室操作結(jié)束后操作人員按照微生物實驗室管理SOP對潔凈區(qū)進行清潔消毒。9.5.3.清潔消毒完畢15分鐘后，現(xiàn)場QA對清潔消毒后的潔凈區(qū)進行表面微生物取樣。QC無菌檢驗

34、室室超凈工作臺下（A/B級）設(shè)備表面、QC無菌檢驗室（B級）墻壁和設(shè)備表面、QC微生物消毒檢測室（C級）墻壁和設(shè)備表面、QC潔凈走廊（D級）墻面及設(shè)備（小車）。取樣操作及檢驗執(zhí)行潔凈區(qū)表面微生物監(jiān)測SOP。9.5.4.至少進行3次試驗,每次間隔7天。9.5.5.可接受標準消毒后：A級：<1CFU/25cm2B級：5CFU/25cm2C級：25CFU/25cm2D級：50CFU/25cm29.5.6.現(xiàn)場考察試驗記錄見附錄79.6.消毒劑有效期確認試驗9.6.1.試驗?zāi)康耐ㄟ^該試驗，確定消毒劑在有效期內(nèi)是穩(wěn)定的，并且消毒效力不會發(fā)生變化，符合要求。在進行消毒劑有效期確認時，每天開啟裝消毒劑

35、的容器不少于5次，以模擬實際操作的最差條件。9.6.2.試驗操作9.6.2.1.配制75%乙醇、0.1%新潔爾滅溶液、0.01%新潔爾滅溶液、0.04%84消毒液、手消毒液、1:256酸性苯酚、1:128堿性苯酚、Spor-Klenz殺孢子劑。0.1%新潔爾滅溶液、0.01%新潔爾滅溶液和0.04%84消毒液為現(xiàn)用現(xiàn)配，配制臨配新用，不做有效期考察。其他消毒液基于如下貯存條件及貯存期，采取下表取樣周期名 稱貯存條件及貯存期0天3天7天14天30天60天75%乙醇密閉保存。C級及以下區(qū)域的7天，除菌過濾后用于B級區(qū)域為3天。手消毒液密閉保存，1個月酸性苯酚溶液密閉保存。C級及以下區(qū)域的14天，除

36、菌過濾后用于B級區(qū)域為3天。堿性苯酚溶液密閉保存。C級及以下區(qū)域的14天，除菌過濾后用于B級區(qū)域為3天。Spor-Klenz殺孢子劑低于24，密閉保存1年9.6.2.2.l 手消毒液、1:256酸性苯酚、1:128堿性苯酚、Spor-Klenz殺孢子劑試驗操作同8.2定量懸浮試驗（10min）。l 75%乙醇、1:256酸性苯酚、1:128堿性苯酚、Spor-Klenz殺孢子劑試驗操作同8.3表面試驗（10min）。9.6.2.3.結(jié)果計算計算試驗組和對照組的活菌濃度 （CFU/ml），并換算為對數(shù)值（N），并按下式計算殺滅對數(shù)值： 殺滅對數(shù)值 (KL)對照組平均活菌濃度的

37、對數(shù)值（NO）試驗組活菌濃度對數(shù)值（NX）9.6.2.4.可接受標準在消毒液有效期末，殺滅對數(shù)值 (KL)應(yīng)不低于35個對數(shù)單位。9.6.2.5.消毒劑有效期確認試驗記錄見附錄810.偏差和變更處理10.1.測試過程中發(fā)生的任何偏差都應(yīng)該記錄，并給予相應(yīng)的糾偏措施，每一偏差給予唯一的偏差編號，在“附錄9：偏差清單”中，匯總所有的偏差。偏差編號原則：DCA+ 三位流水號，如：DCA-001 (DCA表示偏差，001是測試項目發(fā)生的第一個偏差)。在“附錄10：偏差報告”中描述偏差的實際情況，提出相應(yīng)的糾正方案，描述再測試結(jié)果。糾正方案必須經(jīng)批準。偏差報告根據(jù)需要可復(fù)印，一個偏差，一份偏差

38、報告。10.2.變更控制所有在驗證過程中產(chǎn)生的變更都參考驗證主計劃的要求執(zhí)行，確保所有的變更得到評估和批準，驗證的結(jié)果達到預(yù)定的目的和要求。將驗證過程中產(chǎn)生的“變更報告”記錄在附錄11。10.3.將所有的附件填寫于附錄12“附件清單”11.驗證記錄序號文件名稱附錄1文件檢查附錄2培訓(xùn)檢查和簽字確認附錄3驗證用試劑與材料附錄4中和劑鑒定試驗記錄附錄5定量懸浮試驗記錄附錄6表面試驗記錄附錄7現(xiàn)場考察試驗記錄附錄8消毒劑有效期確認試驗記錄附錄9偏差清單附錄10偏差報告附錄11變更報告附錄12附件清單附錄1文件檢查資料類型資料名稱文件/檔案號存放地點 SOP結(jié)果分析與評價：備注： 驗收標準：文件資料已

39、經(jīng)完備，并且是最終批準版本。是否符合驗收標準？是: 否: 如果為否，輸入異常情況編號_檢查人：日期：復(fù)核人：日期：附錄2培訓(xùn)檢查和簽字確認目的：確認參與驗證的人員都經(jīng)過此方案的培訓(xùn)，和識別所有簽字和草簽本方案任何數(shù)據(jù)表的人員。測試方法：檢查培訓(xùn)記錄?？山邮軜藴剩簠⑴c驗證的人員進行此方案前已經(jīng)完成此方案的培訓(xùn)。培訓(xùn)方法（選一個） ¨ 閱讀 ¨ 錄像/DVD ¨ 幻燈片講解 ¨ 在崗培訓(xùn) ¨ 指導(dǎo)型 ¨其他 持續(xù)時間段： 到 . 培訓(xùn)/草簽確認簽名部門 簽名部門 備注：驗收標準：所有參與驗證人員已接受方案培訓(xùn)，并完成簽字確認。是否符合驗收

40、標準？是: 否: 如果為否，輸入異常情況編號_檢查人：日期：復(fù)核人：日期：附錄3 驗證用試劑與材料1 器具及設(shè)備序號名稱規(guī)格型號編碼生產(chǎn)廠家123456782 菌種序號名稱序列號代次來源123453 培養(yǎng)基及稀釋液序號名稱批號來源1234564 消毒液及對應(yīng)的中和劑序號消毒劑名稱中和劑備注1234567備注：驗收標準：所有驗證用物品，來源合規(guī)合法，并處相應(yīng)管理狀態(tài)下。是否符合驗收標準？是: 否: 如果為否，輸入異常情況編號_檢查人：日期：復(fù)核人：日期：附錄4 中和劑鑒定試驗1 工作菌液的制備濃菌液名稱菌液編號稀釋級別工作菌液計數(shù)取樣量操作過程大腸埃希菌將稀釋好的工作菌液分別加至2個90mm平皿

41、中，每皿加入15ml20ml已融化好并冷卻至約45的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，蓋上平皿，傾斜或旋轉(zhuǎn)，使菌懸液與培養(yǎng)基充分混勻，置室溫使其凝固。按規(guī)定條件培養(yǎng)后進行計數(shù)。金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌環(huán)境分離菌2 工作菌液的計數(shù)：細菌培養(yǎng)箱型號及編號：培養(yǎng)溫度： 培養(yǎng)起止時間：霉菌培養(yǎng)箱型號及編號：培養(yǎng)溫度： 培養(yǎng)起止時間：菌種名稱稀釋級結(jié)果 （CFU/ml）平均值（CFU/ml）12大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌環(huán)境分離菌3 中和劑鑒定試驗結(jié)果序號項目類型菌落數(shù) CFU/ml平皿1平皿211%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯802Dey-Engley Neutrali

42、zing Broth（D/E）30.9%氯化鈉溶液3.1 陰性對照組結(jié)果僅限有限公司內(nèi)部使用。未經(jīng)授權(quán)，不得使用或拷貝。3.2 工作菌液為金黃色葡萄球菌時，中和劑鑒定試驗結(jié)果組號項目類型菌落計數(shù)結(jié)果（ CFU/ml）75%乙醇溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯800.1%新潔爾滅溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯800.01%新潔爾滅溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯800.04%84消毒液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80手消毒液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯801:256酸性苯酚中和劑：D/E1:128堿性苯酚中和劑：D/ESpor-Klenz殺孢子

43、劑中和劑：D/E1（消毒劑+工作菌液)+稀釋液，混合液B、10-12(消毒劑+工作菌液)+中和劑，混合液B、10-13中和劑+工作菌液，10-2、10-34(消毒劑+中和劑)+工作菌液，10-2、10-35陽性對照組，10-2、10-36稀釋液和中和劑各1.0ml 7第3、4、5組間誤差率可接受標準l 第1組無菌生長，或僅有少說試驗菌菌落生長；l 第2組菌落數(shù)比第1組菌落數(shù)多，但比第3、4、5組菌落數(shù)少；l 第3、4、5組有相似菌落數(shù)生長，其每組間菌落數(shù)是誤差率不超過15%；l 第6組陰性對照組應(yīng)無菌生長。結(jié)論3.3 工作菌液為枯草芽孢桿菌時，中和劑鑒定試驗結(jié)果組號項目類型菌落計數(shù)結(jié)果（ CF

44、U/ml）75%乙醇溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯800.1%新潔爾滅溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯800.01%新潔爾滅溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯800.04%84消毒液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80手消毒液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯801:256酸性苯酚中和劑：D/E1:128堿性苯酚中和劑：D/ESpor-Klenz殺孢子劑中和劑：D/E1（消毒劑+工作菌液)+稀釋液，混合液B、10-12(消毒劑+工作菌液)+中和劑，混合液B、10-13中和劑+工作菌液，10-2、10-34(消毒劑+中和劑)+工作菌液，10-2、10-35

45、陽性對照組，10-2、10-36稀釋液和中和劑各1.0ml 7第3、4、5組間誤差率可接受標準l 第1組無菌生長，或僅有少說試驗菌菌落生長；l 第2組菌落數(shù)比第1組菌落數(shù)多，但比第3、4、5組菌落數(shù)少；l 第3、4、5組有相似菌落數(shù)生長，其每組間菌落數(shù)是誤差率不超過15%；l 第6組陰性對照組應(yīng)無菌生長。結(jié)論3.4 工作菌液為大腸埃希菌時，中和劑鑒定試驗結(jié)果組號項目類型菌落計數(shù)結(jié)果（ CFU/ml）75%乙醇溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯800.1%新潔爾滅溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯800.01%新潔爾滅溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯800.04%84消

46、毒液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80手消毒液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯801:256酸性苯酚中和劑：D/E1:128堿性苯酚中和劑：D/ESpor-Klenz殺孢子劑中和劑：D/E1（消毒劑+工作菌液)+稀釋液，混合液B、10-12(消毒劑+工作菌液)+中和劑，混合液B、10-13中和劑+工作菌液，10-2、10-34(消毒劑+中和劑)+工作菌液，10-2、10-35陽性對照組，10-2、10-36稀釋液和中和劑各1.0ml 7第3、4、5組間誤差率可接受標準l 第1組無菌生長，或僅有少說試驗菌菌落生長；l 第2組菌落數(shù)比第1組菌落數(shù)多，但比第3、4、5組菌落數(shù)少；l 第3、4、5組有相似菌落數(shù)生長，其每組間菌落數(shù)是誤差率不超過15%；l 第6組陰性對照組應(yīng)無菌生長。結(jié)論3.5 工作菌液為白色念珠菌時，中和劑鑒定試驗結(jié)果組號項目類型菌落計數(shù)結(jié)果（ CFU/ml）75%乙醇溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯800.1%新潔爾滅溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯800.01%新潔爾滅溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯800.04%84消毒液中和