多角度激光光散射與GPC聯(lián)接與應(yīng)用技術(shù)

1、美國懷雅特技術(shù)公司5CORPORATION6300 Hollister Arenue Santa Barbara. CA93117TEL (8O5)68V9C09 FAX (S05J 6813123,att-ooni . URL http;/ww*r.wyatt coHi多角度激光光散射與凝膠滲透色譜儀聯(lián)接與應(yīng)用技術(shù)MALLS/GPC(SEC)WYATT TECHNOLOGY CORPORTION(BEIJING OFFICE)地址：北京西直門北大街58號 金暉嘉園7-2302美國懷雅特技術(shù)公司北京代表處郵編：100082電話：8610-82292806傳真：8610-82290337多角度激

2、光光散射與凝膠滲透色譜儀的聯(lián)接與應(yīng)用WYATT TECHNOLOGY CORPORATION.一前言近十幾年來，光散射技術(shù)(Light scattering)在高分子特征分析領(lǐng)域的應(yīng)用得到了迅 速的發(fā)展。將光散射技術(shù)和凝膠滲透色譜(Gel Permeation Chromatography, GPC或尺 寸排阻色譜(Size Exclusion Chromatography)分離技術(shù)相結(jié)合，不但可以測得大分子 的絕對分子量，分子旋轉(zhuǎn)半徑與第二維里系數(shù)，還可測得分子量分布，分辨分子量大 小不同的族群以及分子的形狀，分枝率及聚集態(tài)等。目前，該技術(shù)已成為一種非常有 效的工具，在美國，日本及歐洲已廣為

3、使用，國內(nèi)近年來亦引進了此項技術(shù)。二光散射簡介早在十九世紀初，人們就開始對光散射原理進行研究。自六十年代激光被發(fā)明以來， 光散射的原理與技術(shù)使得以迅速發(fā)展，至今已成為檢測微小粒子形狀，粒徑大小，分 子量，界面電位及粒子間效應(yīng)的重要工具。隨著電腦技術(shù)的日新月異，許多過去需花 費數(shù)小時甚至數(shù)日才能完成的實驗，如今只需數(shù)分鐘即可完成，而其準確性及重現(xiàn)性 也大幅度提高了。光散射現(xiàn)象，如圖1所示，當一束光通過一間充滿煙霧的房間就會產(chǎn)生散射。利用在不同角度，不同時間所測得的光散射強度，再借助各種光學理論及軟件，硬件設(shè)備， 就可以測得微粒的許多特性。入射光散射光圖1光散射現(xiàn)象在光散射發(fā)展的歷程中，以下是一些

4、具有代表性的人物: James Clerk Maxwell (1833-1879)解釋了光是一種電磁波，并正確地計算出光的速度。 Lord Rayleigh(1842-1919)研究了遠小于波長的微粒散射現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)了散射強度與波長的四次方成反比，并解 釋了藍天被太陽光穿透大氣層所產(chǎn)生的散射現(xiàn)象。 Abert Einstein(1879-1955)研究了液體的光散射現(xiàn)象。 Chandrasekhara Raman (1888-1970)印度籍物理大師，提出了 Raman效應(yīng)，具著作多次發(fā)表于印度文期刊，直至第二次 世界大戰(zhàn)結(jié)束后才逐漸被人所知。 Peter Debye (1884-1966)延續(xù)

5、了 Einstein的理論，描述了分子溶解于溶劑中所產(chǎn)生的光散射現(xiàn)象，提出用Debye plot,求得重量平均分子量Mw o三光散射理論激光照射到樣品時，會在各個方向產(chǎn)生散射光，于是我們可以在一個角度或多個角 度收集散射光的強度。1 .光散射所透露的信息在任何方向的光散射強度與分子量和溶液的濃度成正比；散射光角度的變化與分子 的尺寸大小有關(guān)。當分子小于10nm時，各個角度的散射強度都相同；當分子介于 10 至30nm時，散射強度則由低角度向高角度呈直線下降的趨勢； 而當分子大于30nm時， 散射強度則隨角度增大呈曲線下降的趨勢。2 .基本理論由Maxwell, Einstein, Debye及

6、Zimm 等人陸續(xù)發(fā)展起來，有關(guān)溶劑中分子量的 光散射現(xiàn)象可由下列公式表達：K*c1=+ 2A2cR( )MwP(D式中：常數(shù) K =4 Tt2(dn/dc)2n02(NA X)4)n。是溶劑的折光指數(shù)。C是溶質(zhì)分子的濃度(g/mol)。Na是阿佛加德羅常數(shù)。入0是入射光的波長。DN/DC是溶液折射率與濃度變化的比值，它說明了隨溶質(zhì)濃度變化的溶液折光指數(shù) 變化。R()是單個角度的散射光(大于溶劑的散射光數(shù)量)除以入射光強度所得的分數(shù)即 不同角度光散射強度。Mwll重均分子量。A是第二維里系數(shù)P(是光散射強度的函數(shù)將P(代入式()展開得:在上式中，R()是測得值，K*c、入。、為輸入值，均為已知

7、值；而 Mw A rg為未 知值。3 . Zimm Plot將K* C/ R e對sin2(q/2)+kc作圖，可得到著名的Zimm曲線，如圖2所示，其中K 為調(diào)整橫坐標的設(shè)定值。sin2(O/2) + kc圖 2 Zimm Plo當8 一。時，(2)式簡化為斜率即是Ak*= 1 + 2A2cR(0) M當C- 0時，(2)式簡化為 斜率是rg2當8 一 O, C- 0 , (2)式簡化為K*1R(0)M在縱座標上交點的倒數(shù)即為 Mw實驗的方法為配制一組不同濃度的溶液，依次在 不同的角度測量其散射光強度，由計算機程序按照上列的公式繪出 Zimm Plot,并求得 Mw <rg2>及

8、A2值，這是極少數(shù)能直接測得絕對分子量的方法之一。但由于結(jié)果僅為單 一平均值，因此較適用于成分單一，分布較窄的分子，對于分布較寬或有不同族群分 布的樣品，則較難看出全貌。四光散射與GPC/SECGPC/SEC可以將溶劑中的分子按重量或尺寸大小依次洗脫出來。利用此項技術(shù)將 光散射儀器與GPC/SEC聯(lián)用，除了可以分出不同的族裙，還可測得不同族群的分布, 并且不需要另外標準樣品做標準曲線。由于光散射信號直接與分子量大小有關(guān)，因此 可以直接測出重均絕對分子量，并獲得其它許多有關(guān)的信息。-0.5 10.012.014.016.0Volume (mL)050502 110 0rpcnveDVO9 XUA

9、18.020.0圖4光散射強度與GPC層析圖Chromatography with LS Set-upPumpGOFilter圖5光散射強度與GPC/SEC聯(lián)用PlumbingElectrical美國懷雅特技術(shù)公司1 Debye plot通常GPC/SEC的樣品注射濃度就很低，再經(jīng)過色譜柱得到進一步的稀釋，圖 4 中光散射信號上的任何一點，其濃度都極低(趨近于零)。根據(jù)公式，當2 A2c - 0,71.00x10 -68.00x10 -76.00x10 -74.00x10 -72.00x10 -70.000.0sin?theta/2)0.81.090?& AUX de

10、tectors將K* C/ Re對sin2(q/2)+kc作圖6,其縱坐標交點即為1/Mw ,由直線的斜率可得 到vrg2,圖4光散射信號的每點都可以得到上述結(jié)果，由此可以求得分子量及旋轉(zhuǎn)半 徑rg2的分布，如圖7所示：Peak, Slice : 1, 184Volume : 13.067 mLFit degree : 1Conc. : (1.488 ?0.006)e-5 g/mLMw : (6.505 ?0.088)e+6 g/molRadius : 158.8 ?0.5 nm1.0x1(5o ssa M roro M1.0x1(38.5Molar Mass vs. Volume HEPAR

11、IN21 ox19.09.510.010.5Volume (mL)11.011.5圖 6 Debye plotCumulative Molar Mass* LT1 LT2 LT3 LT4M 匚口君 ELTH6 一S焉 nEnQ1.0x1031.0xl0J1.0x10s1.0x1051.0X107Molar Mass (g/mol)圖8積分分子量2分子形狀不論是分布較寬或是多峰分布的樣品，皆可通過測量分子量及分子旋轉(zhuǎn)半徑得到分 子形狀的數(shù)據(jù)。球形分子ri3 0°Mi - log ri = k + 1/3 log Mi無規(guī)則線團狀分子ri2 0°Mi - log ri = k

12、+ 1/2 log Mi棒狀分子門1 ooMi - log ri = k + 1/1 log Mi將log ri, log Mi作圖，有直線的斜率可以獲知分子的形狀，如圖9所示:0.5-0.6)圖9-1 M、rg與分子形狀的關(guān)系7Molar Mass (g/mol)RM S Radius vs. M olar M assGA TC2_01 0.54 ?0.01圖9-2構(gòu)型判斷，rg對Mw作圖。斜率為0.54 0.01。表明分子是具有無規(guī)則線團構(gòu)象的線性聚合物SMRM olar M ass (g/mol)圖9-3構(gòu)型判斷，rg對Mw作圖。斜率大于0.6,表明分子具有伸展結(jié)構(gòu)。斜率為 1.0,表明

13、是棒狀 結(jié)構(gòu)。SMR10.0 1.0x1051.0x1061.0x1071.0x108M olar M ass (g/mol)RM S Radius vs. Molar M assGA TE 2_01圖9-4構(gòu)型判斷，rg對Mw作圖。其U型曲線表明為典型的高支化度結(jié)構(gòu)。美國懷雅特技術(shù)公司3需要量多少個角度在低角度的時候，有雜質(zhì)所產(chǎn)生的噪音信號干擾會很大，如圖 10所示，所以只取 低角度，加上九十度兩個角度，其誤差就會相對很大；若只取九十度則只能求得分子 量，無法測得旋轉(zhuǎn)半徑，所以最起碼要加上一組高角度來修正，則誤差會較少很多。圖10雜質(zhì)較多的GPC層析圖圖12十八角度檢測器9Solvent圖1

14、1三個檢測角度9 scattering anglieGlass CellO' Observed angle4光散射儀器最基本的儀器mini DAWN TREOS如圖11所示，在與入射光成45度、90度、135 度角配置三組光電二極管檢測器，同時檢測不同角度的光散射強度，而激光經(jīng)由樣品 槽的毛細管通道，樣品槽為石英材質(zhì)。如果要增加測量角度，可以如 DAWN HELEOS在樣品槽的兩側(cè)以不對稱得方式增加檢測器的數(shù)目， 如圖12所示可高達18個角度之多。五應(yīng)用光散射強度與分子的大小及分子量有直接的關(guān)系,而 SEC/GPC能分離不同尺寸及 分子量的分子，結(jié)合此兩種特性，可以得到許多有用的信息，

15、并廣泛地應(yīng)用于高分子， 生化及動力學等研究領(lǐng)域。美國懷雅特技術(shù)公司1高分子聚合物特性利用多角度激光光散射系統(tǒng) 合SEC/GPC不必依賴泵的流速, 分子量及分子量分布等數(shù)據(jù)。(Multi-Angle Laser Light Scattering. MALLS )結(jié)校正曲線及其它任何的假設(shè),即可直接求得重均絕對MAT1 : 3D PlotInt en sit圖13光散射強度，洗脫體積與角度作圖13MALLS利用色譜柱分離出的樣品在各個角度的光散射量（如圖 13）,由RI檢測 器得到的洗脫液濃度及dn/dc值，即可計算出各個切片的分子量。 MALLS測得絕對分 子量所需的各種物性均可由實驗直接求得，

16、無需作任何假設(shè)。而 GPC的色譜柱又有分 離雜質(zhì)的功能，可以避免傳統(tǒng)的光散射需極小心準備樣品的麻煩。圖 14顯示高分子混 合物經(jīng)SEC分離后MALLS及RI的洗脫體積對照圖。由此圖看出RI對大分子量濃度 低的物質(zhì)較不敏感，而對低分子量高濃度者較敏感。Slnp Uhiirt - PEIRTAdO>qD-9J31 三口10口Vo*ume （mL）圖14這是由ASTRA軟件得到的 miniDAWN （上）和Optilab示差檢測器（下）信號。1 BSA 67,000 64,300± 700 1% 23 緩激肽 1,060 1,090+ 102% 4溶解酵素 14,300 14,600

17、+3001%亮氨酸腦啡肽556 592 + 63%'"一<一1-11-I Ok T 口 *S.O1 0.012.0圖15分子量對洗脫體積圖，有四個明顯的峰0 0FA.iO2 .蛋白質(zhì)及其聚合體在各種工業(yè)應(yīng)用中，決定蛋白質(zhì)的絕對特性不僅嚴格而且必要，例如在生化工程 應(yīng)用上，以蛋白質(zhì)為基質(zhì)的產(chǎn)品必須很純而且無任何聚集存在。而測定蛋白質(zhì)的分子 量和是否有聚集態(tài)存在，光散射法是最理想的工具之一。以往，在水相中用低角度光散射測量法 （LALLS ）受到溶劑中不純的物質(zhì)干擾相當 大。而MALLS的多角度測量大大降低了背景噪音的干擾，并能提供完整的信息和良 好的重現(xiàn)性結(jié)果。圖16顯示

18、蛋白質(zhì)混合物的 MALLS和RI的信號。樣品在0.1M NaCl 中含0.05M的磷酸鹽緩沖液中進行 RI為Wyatt Optilab 903,流速為0.1mL/min，色譜柱 為Shodex KW-803和KW-804。雖然此樣品為標準樣品，但 MALLS仍很清楚地檢測 到聚集現(xiàn)象，此現(xiàn)象在RI幾乎無法辨認。圖16蛋白質(zhì)洗脫體積及聚集體信號圖3 .分枝高分子聚合物的分枝程度和分布是影響其物理和化學性質(zhì)的一個重要因素。采用 多角度激光光散射系統(tǒng)（MALLS）與GPC/SEC系統(tǒng)聯(lián)用是唯一決定分枝系數(shù)gM的方 法。雖然也有其他確定分枝的方法，但都不能直接且需要眾多假設(shè)及“虛擬因子” 。由傳統(tǒng)的R

19、I或Viscometer （粘度檢測器）測定的高枝化分子的分子量與絕對值有 很大的差別，若欲做有效的色譜柱校正，則需以一系列與待測物成分相同的標準品作 校正。若標準樣品與待測物的成分或組分不同，則會產(chǎn)生很大的誤差。例如分子量相 同的球形高分子的洗脫時間比無規(guī)則線團狀分子要長。因為MALLS所求得分子量和大小為絕對值，因此計算分枝系數(shù)gM不需要任何假設(shè)。由MALLS直接所求得的分子大小會直接影響分枝率。對分子量相同的長鏈狀分 子而言，其值越小，則分枝程度越大。分枝比的定義為分枝分子的旋轉(zhuǎn)半徑與長鏈分 子的旋轉(zhuǎn)半徑之比，即gM=<r2>b/<r2>i由MALLS測得。圖17

20、為由MALLS測得的分枝狀和長鏈形的高分子（PS）的旋轉(zhuǎn)半徑和分子量對 照圖。由圖中可看出，雖然其分子量相同，但分布明顯不同。圖 18為rg對Mw做圖。圖17 PS線形與枝化分子的對照圖圖18旋轉(zhuǎn)半徑對分子量圖（分子構(gòu)型圖）,可以看出樣品（藻酸鈉）在輻射后分子構(gòu)型的變化。6 .動力學/反應(yīng)速率MALLS還可以用于如抗原，抗體等反應(yīng)迅速的溶液系統(tǒng)，粒子和蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象 的檢測。因為MALLS內(nèi)部同時裝有數(shù)個固定的檢測器，所以不需移動任何儀器硬件 來掃描樣品，即可及時多方位同時捕捉反應(yīng)速率的現(xiàn)象。使用 MALLS ,可研究抗原- 抗體反應(yīng)，反應(yīng)發(fā)生時就可決定聚集粒子的大小。當改變溫度，濃度或催化劑

21、時， MALLS可記錄下反應(yīng)發(fā)生時，分子的特殊變化。oProtein Mass vs. ConcentrationO0.20.40 60.31Cpnceniration (mg/rnLJ圖19濃度變化對蛋白聚集的影響使用DAWN僉測器研究了濃度對分子量為 75KD單分子蛋白質(zhì)聚集作用的影響。圖 19描述了這種特殊蛋白質(zhì)從30ug/ml至ij 1mg/ml范圍內(nèi)得到的濃度相關(guān)性。如圖所示， 該蛋白質(zhì)在低濃度作為單一分子而在濃度大于700ug/ml時聚集為六聚體。該結(jié)果與由gluteraldehyde高度交聯(lián)技術(shù)所得結(jié)合完全相符。V& lunie f mL)Jia圖20溫度變化對PMMA分子量和大小的影響美國懷雅特技術(shù)公司7 .低分子量的測定DAWN HELEOS或mini DAWN TREOS的固定光電二極管檢測器可以捕捉到很微 弱的光散射信號，使得分子量的測定成為可能。使用DAWN系列標準配制的任何一款 激光器，都可以輕易地測量分子量低于 2000D的聚合物，并具有相當?shù)臏?/p>