14級(jí)博士分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)講義

1、博 士 研 究 生分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)講義 浙江中醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院目 錄實(shí)驗(yàn)一、質(zhì)粒的提取及純化實(shí)驗(yàn)二、DNA瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)三、質(zhì)粒的酶切及電泳實(shí)驗(yàn)四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)五、PCR擴(kuò)增及電泳實(shí)驗(yàn)六、目的片段的回收實(shí)驗(yàn)七、哺乳動(dòng)物組織基因組DNA的提取實(shí)驗(yàn)八、哺乳動(dòng)物組織總RNA的提取c實(shí)驗(yàn)九、RT-PCR實(shí)驗(yàn)十、植物基因組DNA提取實(shí)驗(yàn)十一、Sourthern雜交附錄一 、目的片斷的回收 實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒的提取及純化小量法提?。▔A變性裂解法）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?用堿性SDS方法快速?gòu)拇竽c桿菌細(xì)胞中分離、提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙啶染色，在紫外燈下檢測(cè)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，

2、學(xué)習(xí)和掌握質(zhì)粒的快速提取純化、技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理 從大腸桿菌細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA的方法眾多，其分離的依據(jù)可利用分子大小不同，堿基組成的差異以及質(zhì)粒DNA的超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行。堿變性法抽提效果良好，既經(jīng)濟(jì)且得率較高。抽取到的質(zhì)粒DNA可用于酶切、連接與轉(zhuǎn)化。對(duì)于分子量較大拷貝較少的質(zhì)粒DNA，由于DNA片段較大易于損傷斷裂，因此選用氯化銫密度梯度超離心法抽提DNA，具有純度高，步驟少，方法穩(wěn)定且獲得的質(zhì)粒DNA是超螺旋構(gòu)型等特點(diǎn)。對(duì)于高拷貝數(shù)質(zhì)粒，用小量制備法抽提質(zhì)粒DNA就有足夠量可用于基因操作。 堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目

3、的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。本實(shí)驗(yàn)就是利用堿變性法抽提大腸桿菌中的質(zhì)粒。 三、儀器、材料與試劑(一) 儀器1、 恒溫培養(yǎng)箱2、 恒溫?fù)u床3、 臺(tái)式離心機(jī)4、 高壓滅菌鍋5、 制冰機(jī)6、 電泳槽及電泳儀7、 紫外觀測(cè)儀8、 漩渦振蕩器

4、(二) 材料1、 三羥甲基氨基甲烷（Tris）2、 乙二胺四乙酸（EDTA）3、 氫氧化鈉4、 十二烷基硫酸納（SDS）5、 乙酸鉀6、 冰乙酸7、 氯仿8、 乙醇9、 RNA酶（RNase）10、芐青霉素（Amp）(三) 試劑1 LB培養(yǎng)液：10g氯化鈉10g蛋白胨5g酵母提取物補(bǔ)充蒸餾水到990ml ,用5N NaOH調(diào)至pH 7.0補(bǔ)充蒸餾水到1000ml ,120高壓滅菌30min2 氨芐青霉素：50mg/ml溶于水3 氯霉素：34mg/ml溶于乙醇4 溴化乙錠：10mg/ml溶于水5 溶液1 50mmol/l Tris .cl PH 7.5 ; 10mmol/l EDTA PH8.0

5、分別加入下列溶液，定容至100ml, 高壓滅菌后，存于4 1mol/l Tris.cl(PH7.5) 5ml 0.5mol/l EDTA (PH8.0) 2ml 6 溶液II 0.4M NaOH ； 2% SDS（現(xiàn)用現(xiàn)配），不能高壓滅菌。使用時(shí)0.4M NaOH 和2% SDS等體積混合使用，使其工作濃度為0.2M NaOH 和1% SDS7溶液III 1.32mol/l Kac (PH 4.8) 分別加入乙酸鉀12.96g ，溶于雙蒸水80ml ， 用HAc 調(diào)節(jié)pH至4.8，定容至100ml，滅菌后存于4備用。8 TE緩沖液 10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(

6、pH 8.0), 高壓滅菌。四：實(shí)驗(yàn)步驟1、 在兩只50ml離心管中分別加入10ml含有60ug/ul 氨芐的LB培養(yǎng)液，從兩塊轉(zhuǎn)化平板上分別挑取單菌落接種于其中，37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2、 在1.5ml離心管中加入菌液1.5ml，12000g離心2min，收集細(xì)菌沉淀，倒掉上清。3、 將細(xì)菌沉淀中加入預(yù)冷的溶液I 200 ul， 劇烈震蕩將菌液充分混勻。4、 加溶液II 200ul （NaOH和SDS用之前等體積混勻），蓋嚴(yán)管蓋顛倒微型離心管5次以合內(nèi)容物，溫和震蕩，至溶液變的澄清，冰浴放置5min。（根據(jù)不同菌株可適當(dāng)縮短） 5、溶液澄清后加入預(yù)冷的溶液III 200ul ，溫和混勻10s，冰

7、上放置3-5 min。6、12000g 4離心5 min，取上清移至一個(gè)新的Eppendorf管中。7、 加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），震蕩混勻， 12000g，4下離心5min，取上清移至另一個(gè)Eppendorf管中，用來(lái)去除雜蛋白。8、 加入2倍體積無(wú)水乙醇（室溫），震蕩混勻，室溫放置5min。9、 12000g，離心5min，棄上清。10、加500ul的 70%乙醇洗脫，直接倒去70%乙醇，再離心30秒，將管壁上的乙醇收集至管壁，用槍頭吸去。室溫下蒸發(fā)痕量的乙醇1015min。11、 最后加入50ul的雙蒸水或TE（含Rnase 20ug/ml ）溶液溶解，37水浴，3

8、0min,降解RNA。12、電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（電泳步驟參照電泳實(shí)驗(yàn)步驟）。五、注意事項(xiàng)1在細(xì)胞內(nèi)，共價(jià)閉環(huán)DNA(covalently closed circular DNA，簡(jiǎn)稱cccDNA)常以超螺旋形式存在。如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫作開(kāi)環(huán)DNA(open circular DNA，簡(jiǎn)稱ocDNA)。在電泳時(shí)，同一質(zhì)粒如以cccDNA形式存在，它比其開(kāi)環(huán)和線狀DNA的泳動(dòng)速度快，因此在本實(shí)驗(yàn)中，自制質(zhì)粒DNA在電泳凝膠中呈現(xiàn)3條區(qū)帶。2. 從核酸樣品中去除蛋白質(zhì)時(shí)使用等體積的平衡酚/氯仿混合物。其中氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相

9、與有機(jī)相的分離。對(duì)酚進(jìn)行平衡的目的是使其pH值在7.8以上，防止DNA在酸性條件下分配于有機(jī)相。3. 酚的腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套，小心操作。4. 用加樣槍吸取酚或氯仿時(shí)要小心，動(dòng)作要緩慢，以防酚或氯仿濺到加樣槍上腐蝕加樣槍。實(shí)驗(yàn)二 DNA瓊脂糖凝膠電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解DNA瓊脂糖凝膠電泳的基本原理、影響瓊脂糖凝膠DNA遷移速率的因素。2.掌握DNA瓊脂糖凝膠電泳的基本操作方法和注意事項(xiàng)。二、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離、鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速，可以分辨用其他方法，如密度梯度離心法所無(wú)法分離的DNA 片段。此外，直接用低濃度的

10、熒光嵌入染料溴化乙錠進(jìn)行染色，可確定DNA在凝膠中的位置。少至110ng的DNA條帶即可直接在紫外燈下檢出。如有必要，還可以從凝膠中回收DNA條帶，用于各種克隆操作。瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠可以灌制成各種形狀、大小和孔隙度，并在許多種不同的裝置中進(jìn)行電泳。上述參數(shù)的選擇主要取決于所分離的片段的大小。聚丙烯酰胺分離小片段DNA（5500bp）效果最好，其分辨力極高，相差1bp的DNA片段就能分開(kāi)。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快，可以容納相對(duì)大量的DNA，其不足之處在于：與瓊脂糖凝膠相比，其制備和操作更為困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置在恒定電場(chǎng)下電泳。瓊脂糖凝膠的分辨力要比聚丙烯酰胺凝膠低，但其分離范圍較

11、廣。用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長(zhǎng)度為200bp至近50kb的DNA。瓊脂糖凝膠通常采用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。長(zhǎng)度達(dá)10000kb的更大的DNA可以通過(guò)電流方向呈周期性變化的脈沖電場(chǎng)進(jìn)行電泳。影響瓊脂糖凝膠DNA遷移速率的因素有如下幾個(gè)：1.DNA的分子大小線狀雙鏈DNA分子在電場(chǎng)下以其一端指向電場(chǎng)一極，在凝膠基質(zhì)中其遷移率與堿基對(duì)數(shù)值成反比。分子越大，則摩擦阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移的越慢。2.瓊脂糖濃度一個(gè)給定大小的線狀DNA片段，其遷移速率在不同濃度的瓊脂糖各不相同。DNA電泳遷移率與凝膠的性質(zhì)、遷移分子的形狀和大小有關(guān)。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范

12、圍不同的DNA分子。（見(jiàn)表1.1）表1.1 含不同量瓊脂糖的凝膠的分離范圍 凝膠中的瓊脂糖含量（%（w/v） 線狀DNA分子的有效分離范圍（kb）0.3 5600.6 1200.7 0.8100.9 0.571.2 0.461.5 0.232.0 0.123.DNA的構(gòu)象分子量相同的超螺旋環(huán)狀(型)、帶切口環(huán)狀(型)及線狀(型)DNA通過(guò)凝膠時(shí)速度不一。這三種DNA的相對(duì)遷移率主要取決于凝膠的瓊脂糖濃度，但也受所用電流強(qiáng)度、緩沖液的離子強(qiáng)度及I型DNA超螺旋度的影響。在某些條件下，I型DNA遷移速率比型DNA快；線狀(型)DNA比帶切口環(huán)狀(型)快。確切鑒定不問(wèn)構(gòu)象形式的DNA的方法是，在不斷

13、增加溴化乙錠用量的情況下進(jìn)行電泳。隨著溴化乙錠濃度的增加，更多的染料結(jié)合到DNA上，I型分子的負(fù)超螺旋逐漸解開(kāi)，其分子半徑增加，遷移速率減小。達(dá)到游離染料的臨界濃度時(shí)，不再有超螺旋，I型DNA的遷移速率達(dá)最小值。繼續(xù)增加溴化乙錠，便形成正超螺旋，DNA分子變得更加致密，遷移速率迅速增加。同時(shí)，由于電荷的中和，也由于溴化乙錠賦予DNA較大的剛性，型和型DNA的遷移速率有不同程度的減小。對(duì)絕大多數(shù)1型DNA制品而言，游離溴化乙錠的臨界濃度介于0.10.5g/m1。4.所加電壓在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，高分子量DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)

14、。因此，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大，瓊脂糖凝膠上所加電壓不應(yīng)超過(guò)5V/cm。5.電場(chǎng)方向如果電場(chǎng)方向保持不變，則長(zhǎng)于50100kb的DNA分子在瓊脂糖凝膠上的遷移速率相同。但是，如果電場(chǎng)方向呈周期性改變，則DNA分子被迫改變路徑。由于DNA分子越大，為適應(yīng)新的電場(chǎng)方向而重新排列所需的時(shí)間就越長(zhǎng)，因此可以通過(guò)脈沖電場(chǎng)凝膠電泳來(lái)分辨極大的DNA分子(達(dá)到10000kb)。6.堿基組成與溫度 DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為（與聚丙烯酰胺中截然不同）受DNA的堿基組成或凝膠電泳溫度的影響不明顯。因此，在瓊脂糖凝膠電泳中，不同大小的DNA片段

15、的相對(duì)遷移率在4與30之間不發(fā)生改變。瓊脂糖凝膠電泳一般在室溫下進(jìn)行。但是，濃度低于0.5的瓊脂糖凝膠和低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠較為脆弱，最好在4下電泳。此時(shí)它們強(qiáng)度較大。7.嵌入染料的存在 熒光染料溴化乙錠用于檢測(cè)瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA，它會(huì)使線狀DNA的遷移率降低15。染料嵌入到堆積的堿基對(duì)之間，并拉長(zhǎng)線狀和帶切口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng)。溴化乙錠是致癌劑，操作時(shí)應(yīng)小心。所有含有溴化乙錠的溶液在棄置前應(yīng)當(dāng)進(jìn)行凈化處理。8.電泳緩沖液的組成 電泳緩沖液的PH組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒(méi)有離子存在時(shí)（如在凝膠中不慎未加緩沖液），電導(dǎo)率最小，即使DNA還能移動(dòng)一點(diǎn)的話，也很慢

16、。在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加了10電泳緩沖液)，電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱。最壞的情況是引起凝膠熔解而DNA發(fā)生變性。 有幾種不同的緩沖液可用于天然雙鏈DNA的電泳。這些緩沖液含EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸（TAE）、Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)。其濃度約為50mmol/L(pH7.57.8)。電泳緩沖液通常配制成濃縮液，貯存于室溫。由于歷史的原因，最常用的緩沖液是TAE。但它的緩沖容量相當(dāng)?shù)?，長(zhǎng)時(shí)間電泳會(huì)使其緩沖容量喪失殆盡(陽(yáng)極呈堿性，陰極變成酸性)。在進(jìn)行高壓、長(zhǎng)時(shí)間的電泳時(shí)，更新緩沖液或在兩槽之間進(jìn)行緩沖液循環(huán)是可取的。TPE和TBE比TAE成本稍高，但它們

17、的緩沖容量明顯增高。雙鏈線狀DNA片段在TAE中的遷移速率比在TBE或TPE中快將近10%，但這些系統(tǒng)的分辨能力幾乎相同，只是超螺旋DNA在TAE中的分辨率要比在TBE中更好。三、器材與試劑1.水平式電泳裝置、電泳儀、移液器、微波爐、紫外透射儀、照相支架、照相機(jī)及其附件2. 5TBE 電泳緩沖液54g Tris27.5g 硼酸20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)補(bǔ)充雙蒸水至1L3.溴化乙錠溶液(10mg/ml) 在100ml水中加入1g溴化乙啶，磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其完全溶解，避光保存 4 6上樣緩沖液0.25% 溴酚藍(lán)40%（W/V） 蔗糖水溶液 5 .DNA溶液四、實(shí)驗(yàn)步驟1

18、.取5TBE 電泳緩沖液20ml加雙蒸水至200ml，配制成0.5TBE稀釋緩沖液，待用。2.稱取0.4g瓊脂糖，置于200ml 錐形瓶中，加入50ml 0.5TBE稀釋緩沖液,放入微波爐(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為0.8% 瓊脂糖凝膠液。加熱過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng)，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜，以減少水分蒸發(fā)。3.將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用膠帶緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mml左右的間隙。向冷卻至5060的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠溶液使其終濃度為0.5g/ml(也可不把溴化乙錠加入凝膠中，而是電

19、泳后再用0.5g/ml的溴化乙錠溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封膠帶內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖溶液小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。倒膠時(shí)的溫度不可太低，否則凝固不均勻；速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后拔出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒(méi)過(guò)膠板上表面。因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會(huì)有一些隆起，阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中，所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。4.取10l DNA溶液與2l 上樣液混勻，用微量移液器小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過(guò)樣品槽容量。每加完一

20、個(gè)樣品要更換槍頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。5.加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?080V，電流在0mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí)，停止電泳。6.未加溴化乙錠的膠板在電泳完畢后移入0.5g/ml 的EB溶液中，室溫下染色2025分鐘。7.在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的或已加有的EB電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的橘紅色熒光條帶。紫外燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩，以免損傷眼睛。經(jīng)照相機(jī)鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將數(shù)碼相機(jī)固定于照相架上拍照，記錄電泳結(jié)果。五、注意事項(xiàng)1.觀察D

21、NA離不開(kāi)紫外透射儀，可是紫外光對(duì)DNA分子有切割作用。如果需從膠上回收DNA，應(yīng)盡量縮短光照時(shí)間并采用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈（300360nm），以減少紫外光切割DNA。2.EB是強(qiáng)誘變劑，具有中等毒性，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門(mén)處理后才能清洗或丟棄。3.當(dāng)EB太多、膠染色過(guò)深、DNA帶看不清時(shí)，可將膠用蒸餾水沖泡30分鐘后再觀察。4.含有EB的溶液必須經(jīng)過(guò)凈化處理，如含有0.5g/ml EB的電泳緩沖液每100ml中加入100mg粉狀活性炭，于室溫放置1小時(shí)，不是搖動(dòng)，用Whatman 1 號(hào)濾紙過(guò)濾溶液，丟棄濾液，然后用塑料袋裝濾紙

22、和活性炭，作為有害廢物予以丟棄。實(shí)驗(yàn)三 質(zhì)粒酶切及電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 了解限制性內(nèi)切酶的酶切原理、及限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用2、 學(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶酶切的方法和技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理DNA限制性內(nèi)切酶主要分為3類。I類和III類限制性內(nèi)切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化酶以及依賴于ATP的限制性內(nèi)切酶活性。III類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA，然后從底物上解離下來(lái)。I類酶結(jié)合于特定的識(shí)別位點(diǎn)，但卻沒(méi)有特定的切割位點(diǎn)，酶對(duì)其識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)切割，很難形成穩(wěn)定的、特異性的切割末端，故I、III類酶在基因工程中基本不用。II類限制性內(nèi)切酶是基因工程中所用的主要的工具酶。是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸

23、序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。它們主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的，由于限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用從而使體外重組DNA技術(shù)的發(fā)展成為可能。以下是一些常用的限制性內(nèi)切酶識(shí)別的序列：限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列Alu IBamH IBgl IICla IEcoR IHind IIISal ISam IXma INot IAGCTGGATCCAGATCTATCGATGAATTCAAGCTTGTCGACCCCGGGCCCGGGGCGGCCGC三、實(shí)驗(yàn)器材和實(shí)驗(yàn)試劑：1、 器材恒溫水浴鍋、1.5ml Eppendorf管、低溫離心機(jī)、冰浴、低溫高速離心機(jī)、膠布、電泳槽及電泳儀、紫外觀察儀2、 試劑1

24、） EcoR I（15U/ul）寶生物工程有限公司2） Sal I（15U/ul）寶生物工程有限公司3） 10*buffer 4） 電泳所需試劑: 參照實(shí)驗(yàn)二四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、 酶切 取兩只1.5ml Eppendorf管，做好標(biāo)記，分別用酶切抽提出兩管質(zhì)粒，分別向其中加入：試劑體積（ul）10*H Buffer EcoR I（15U/ul）Sal I（15U/ul）質(zhì)粒DNA滅菌水4222ugUp to 40ul總體積40ul混勻后短暫離心，37水浴1.5h。2、 電泳 參照電泳步驟，電泳結(jié)束后紫外燈下觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)四 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)，掌握大腸桿菌感受態(tài)

25、細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化的方法和技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。其原理是細(xì)菌處于0，CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成DNA酶的羥基鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時(shí)間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。將細(xì)菌放置在非選擇性的培養(yǎng)基中保溫一段時(shí)間，促使轉(zhuǎn)化過(guò)程中獲得新的表型（如AMP r等）得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含氨卞青霉素的選擇性培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)化體在氨卞青霉素的選擇性培養(yǎng)基上能夠存活，而未受轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞因無(wú)抵抗氨卞青霉素的能力而不能存活，因此就不能在選擇培養(yǎng)基上形成菌落。三

26、：儀器、材料和試劑（一）、儀器1、 超凈工作臺(tái)2、 低溫離心機(jī)3、 恒溫?fù)u床4、 70冰箱5、 恒溫水浴鍋（二）、材料1、 氯化鈣2、 胰蛋白胨3、 酵母提取物4、 氯化鈉5、 氨卞青霉素6、 大腸桿菌JM1097、 質(zhì)粒8、 50ml離心管9、 試管、培養(yǎng)皿、錐形瓶等（三）試劑 1、0.1mol/L CaCl2溶液 2、LB液體培養(yǎng)基 稱取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl 10g ，NaOH調(diào)pH至7.0，加蒸餾水定容至1000ml ，分裝后高壓滅菌。 3、氨芐青霉素（Amp）母液（100mg/ml），-20保存四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）感受態(tài)細(xì)胞的制備1、 取甘油保存的菌株在LB 固體培養(yǎng)

27、基上劃線，37培養(yǎng)過(guò)夜。2、 從LB平板上挑取一個(gè)單菌落，接到3ml LB培養(yǎng)基中，37震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。3、 取0.5ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，轉(zhuǎn)入50ml LB培養(yǎng)基中，37震蕩培養(yǎng)1.5-2h，使菌液OD600達(dá)到0.3-0.4。（細(xì)胞數(shù)務(wù)必小于108/ml，此為成功的關(guān)鍵）4、 將菌液在冰上放置5-10min后，4下6000rpm離心5min集菌.5、 加入10ml0.1mol/L的Cacl2 ，冰上懸浮沉淀，至少20 min。（懸浮沉淀時(shí)動(dòng)作要輕） 6、 4下6000rpm離心5 min集菌，加入2ml 冰冷的0.1mol/L的Cacl2懸浮菌體.7、 分裝細(xì)胞，每200ul一份，若要長(zhǎng)期保存

28、，較。此細(xì)胞即為感受態(tài)細(xì)胞。8、 放冰上置于冰箱中貯藏備用(長(zhǎng)期保存的應(yīng)加人終濃度為20的甘油，70)。(二) 轉(zhuǎn)化1、 取200ul新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入DNA(50ng)混勻，同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照管。 受體菌對(duì)照：200ul感受態(tài)細(xì)胞2ul無(wú)菌水 質(zhì)粒對(duì)照：200ul感受態(tài)細(xì)胞2ul（50ng）標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒冰上放置30min2、 將管放到42循環(huán)水浴鍋中，放置2min3、 然后迅速置于冰上2min4、 每管加800ul LB液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1h（慢搖）5、 將適當(dāng)體積（200ul）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，涂在含有氨卞青霉素的培養(yǎng)皿中6、 倒置平皿37培養(yǎng)1216h，查看有無(wú)出現(xiàn)菌落五、注意事項(xiàng)1

29、、 DNA溶液與感受態(tài)細(xì)胞混合后，一定要在冰浴條件下操作，如果溫度高時(shí)，轉(zhuǎn)化效率將降低。2、 42熱處理很關(guān)鍵，將試管從42轉(zhuǎn)到冰上時(shí)，轉(zhuǎn)移速度要快，溫度要控制準(zhǔn)確。3、 菌液涂皿操作時(shí)動(dòng)作要輕柔，避免反復(fù)來(lái)回涂布，因?yàn)榇藭r(shí)感受態(tài)細(xì)胞形態(tài)已變化，過(guò)多的擠壓會(huì)使細(xì)胞破碎，影響轉(zhuǎn)化效率。 新制備的感受態(tài)細(xì)胞可立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化，若在4放置1224h后，轉(zhuǎn)化效率會(huì)更高，24h后轉(zhuǎn)化效率開(kāi)始降低。實(shí)驗(yàn)五 PCR擴(kuò)增及電泳 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 本實(shí)驗(yàn)以基因組或質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增基因,長(zhǎng)度約400-800bp。2 學(xué)習(xí)并掌握PCR反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。二實(shí)驗(yàn)原理多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的原理類似于DNA的

30、天然復(fù)制過(guò)程?？珊?jiǎn)述為：在微量離心管中加入適量緩沖液，加入微量模板DNA，四種脫氧核苷酸(dNTP)，和耐熱Taq聚合酶及兩個(gè)合成的DNA引物，并有Mg2+存在。1加熱使模板DNA在高溫下(94)變性，雙鏈解鏈，這是所謂變性階段。2降低溶液溫度，使合成引物在低溫(55)與模板DNA互補(bǔ)退火形成部分雙鏈，這是 所謂退火階段。3溶液反應(yīng)溫度升至中溫(72)，在Taq酶作用下，以四種dNTP為原料，引物為復(fù)制 起點(diǎn)，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。如此反復(fù)，在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫復(fù)性和DNA合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物DNA重復(fù)合成，并且在重復(fù)過(guò)程中，前一循環(huán)

31、的產(chǎn)物DNA可作為后一循環(huán)的模板DNA而參與DNA的合成，使產(chǎn)物DNA的量按2n方式擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)2535個(gè)循環(huán)，DNA擴(kuò)增倍數(shù)106109PCR原理示意圖模板DNA變性和引物復(fù)性引物延伸變性和引物復(fù)性引物延伸變性和引物復(fù)性引物延伸 第425輪循環(huán) 靶DNA至少增加106倍三、實(shí)驗(yàn)器材和試劑1. 器材0.2ml薄壁管、PCR擴(kuò)增儀、旋渦振蕩器、臺(tái)式離心機(jī)、瓊脂糖凝膠電泳槽、電泳儀、紫外觀察儀、100ml三角燒瓶、刻度吸管、洗耳球、膠布、加樣器、槍頭。2. 試劑1) 10反應(yīng)緩沖液：大連寶生生物工程公司產(chǎn)品2) TaqDNA聚合酶 (3u/l)：大連寶生生物工程公司產(chǎn)品3) 4dNTP(每種2.5m

32、M)：大連寶生生物工程公司產(chǎn)品4) 引物1(12.5pmol/l )：由上海生工生物公司合成5) 引物2(12.5pmol/l )：由上海生工生物公司合成6) 模板DNA：為實(shí)驗(yàn)三所提出的植物基因組DNA(約0.5g/1)7) 無(wú)菌ddH208) 電泳緩沖液TBE： 9) 溴化乙錠溶液(10mg/m1)：在100m1水中加入1g溴化乙錠,磁力攪拌器數(shù)小時(shí)以確保其完全溶解，避光保存。四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 取一只0.2ml PCR薄壁管，依次加入：10Reaction Buffer （Mg2+） 2.5l4種dNTP的混合物(每種25mM) 2lPrimer l (12.5pmol/l 1lPrime

33、r 2 (12.5pmol/l) 1lTemplate 1lTaq DNA Polymerase (3u/l ) 0.5lddH20 15l 總體積 25l2. 振蕩混勻，短暫離心,放入PCR擴(kuò)增儀中。394預(yù)變性5分鐘：進(jìn)入循環(huán)： 94變性30秒 55退火30秒 30個(gè)循環(huán) 72延伸30秒72延伸5分鐘同時(shí)設(shè)置PCR擴(kuò)增儀的熱蓋溫度為105。4. 配制1%的Agarose凝膠：稱取0.5g Agrose放入200m1三角燒瓶中，加入50m1 1TBE溶液，微波爐中加熱令其完全溶解，待冷卻至約50時(shí)加入溴化乙錠溶液(10 mg/m1)1.5l 。澆板，水平放置，待凝(約2030min)。5.

34、上樣電泳：取10l PCR樣品上樣電泳，另取3u1 Marker作為DNA片段大小的對(duì)照。75V的電壓下電泳，紫外燈下觀察條帶。五、注意事項(xiàng)1. 由于PCR技術(shù)非常敏感，可使一個(gè)DNA分子得以擴(kuò)增，所以應(yīng)當(dāng)注意防止反應(yīng)體系被痕量DNA模板污染：操作時(shí)應(yīng)戴手套，所有緩沖液、槍頭和離心管使用前都必須經(jīng)過(guò)高壓處理。2. 裝有PCR試劑的微量離心管打開(kāi)之前，應(yīng)先在微量離心機(jī)上作瞬時(shí)離心使液體沉積于管底，從而減少污染手套或加樣槍的機(jī)會(huì)。3. 最好在加完所有其它反應(yīng)成分后才加模板DNA，加模板DNA時(shí)注意不要形成噴霧，以免有可能污染別的反應(yīng)。4. 在PCR中，Taq酶可用于92.5，97.5分別保持其活力

35、為180 min，56 min。在95時(shí)為35min，故PCR中循環(huán)溫度不宜高過(guò)95。5. Taq酶的用量一般為0.55U之間，用酶量少合成產(chǎn)物量低，用酶量多，非特異性產(chǎn)物堆積。6. Mg2+濃度應(yīng)保持在0.52.5 mmol/L之間。鎂離子濃度可影響到引物退火、模板和PCR中間產(chǎn)物的解鏈濃度、產(chǎn)物特異性、引物二聚體生成及酶活性等等。7. 為減少污染機(jī)會(huì)，反應(yīng)體系中加樣順序?yàn)閐dH20、10反應(yīng)緩沖液、4dNTP、兩條引物、模板DNA。8. 若用沒(méi)有熱蓋的PCR擴(kuò)增儀，則需在反應(yīng)體系中加入液體石蠟等礦物油封閉體系以防止反應(yīng)過(guò)程中液體的蒸發(fā)。實(shí)驗(yàn)六 目的片段的回收（見(jiàn)附件）實(shí)驗(yàn)七 哺乳動(dòng)物組織基

36、因組DNA的提取一：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 掌握動(dòng)物組織基因組的提取原理及實(shí)驗(yàn)方法2、 利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA溶液在260nm波長(zhǎng)處的吸光值，并計(jì)算DNA的濃度及純度二：實(shí)驗(yàn)原理DNA在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在的。核酸與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合力包括離子鍵、氫鍵、范德華力等。破壞或降低這些結(jié)合力就可把核酸與蛋白分開(kāi)。一般采用去污粉（如SDS）、蛋白變性劑（如鹽酸胍、異硫氫酸胍）、蛋白酶等。去除蛋白質(zhì)通常采用有機(jī)溶劑酚和氯仿。當(dāng)它們與含核酸和蛋白的水溶液一起振搖時(shí)可形成乳濁液，酚和氯仿使蛋白變性并與核酸分開(kāi)。離心后可分成兩相，一般上層為含核酸的水相，下層為有機(jī)相，分界處變性凝聚的蛋白質(zhì)。含核酸

37、的水相常用乙醇、異丙醇等有機(jī)溶劑對(duì)核酸進(jìn)行沉淀。DNA、RNA所含有的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共扼雙鍵具有紫外吸收的性質(zhì)，吸收峰在260nm處，所以可用紫外分光光度法測(cè)定DNA的濃度。三：儀器、材料與試劑（一） 儀器離心管、移液器、槍頭、試管架、離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、液氮罐、電泳儀、研缽（二） 材料小鼠肝、腎等器官組織（三）試劑1、提緩沖液：10mmol/L Tris.cl (pH 8.0)0.1mol/L EDTA(pH 8.0)20ug/ml 胰RNA酶0.5% SDS2、蛋白酶K用雙蒸水配成20mg/ml的儲(chǔ)存液（分裝成小管），存于-20。3、Tris飽和酚4、無(wú)水乙醇4、 異丙醇四、

38、實(shí)驗(yàn)步驟：1、 液氮研磨組織塊，將其轉(zhuǎn)入有近3ml的抽提緩沖液中。2、 加入蛋白酶K至終濃度為100ug/ml，混勻。3、 將裂解細(xì)胞的混懸液置于50水浴中，水浴3小時(shí)，不時(shí)的旋動(dòng)該粘滯溶液。4、 將溶液冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚，緩慢來(lái)回顛倒離心管10分鐘，混合兩相（酚的pH值必須接近8.0）。5、 5000g離心15分鐘，分離兩相，將粘稠的上清移至一潔凈的離心管中。6、 用酚/氯仿/異物醇重復(fù)抽提1次，12000g離心5分鐘將上清移至一干凈的離心管中。7、 用兩倍體積的乙醇或0.6倍體積異丙醇沉淀核酸，12000g離心15分鐘，棄上清。8、 70%乙醇洗脫，直接倒去70%乙醇，

39、再離心30秒，將管壁上的乙醇沉淀，用槍頭吸去多余的乙醇。將管放置在濾紙上，室溫下蒸發(fā)痕量的乙醇1015分鐘。9、 最后加入50ul的雙蒸水或TE溶液溶解。10、電泳檢測(cè)結(jié)果（參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)二步驟）。11、紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA產(chǎn)量及濃度。OD260 0.02*D280DNA濃度（ug/ml）= _稀釋倍數(shù) 式中，D為比色杯的光徑（cm），0.02為常數(shù)。稀釋好的DNA濃度最好介于5-50ug/ml 范圍，這個(gè)線形范圍內(nèi)比較準(zhǔn)確。利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)核酸的濃度 組成核酸分子的堿基，均具有一定的吸收紫外線特性，最大吸收值在波長(zhǎng)為250-270nm之間。例如腺嘌呤的最大紫外線吸收值在260.5nm，胞

40、嘧啶：267nm，鳥(niǎo)嘌呤：276mn，胸腺嘧啶：264.5nm，尿嘧啶：259nm。這些堿基與戊糖，磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不會(huì)改變，但核酸的最大吸收波長(zhǎng)是260nm，吸收低谷在230nm，這個(gè)物理特性為測(cè)定核酸溶液濃度提供了基礎(chǔ)。在波長(zhǎng)260nm紫外線下，OD值的光密度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50ug/ml；單鏈DNA或RNA為40 ug/ml；單鏈寡聚核苷酸為20 ug/ml?？梢源藖?lái)計(jì)算核酸樣品的濃度。 分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可通過(guò)測(cè)定在260nm和280nm的紫外線吸收值的比值(A260A280)估計(jì)核酸的純度。DNA的比值為1.8，RNA的比值為2.0。若DNA比值高

41、于1.8，說(shuō)明制劑中RNA尚未除盡。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白質(zhì)將導(dǎo)致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干擾。當(dāng)然也會(huì)出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況，所以有必要結(jié)合凝膠電泳等方法鑒定有無(wú)RNA，或用測(cè)定蛋白質(zhì)的方法檢測(cè)是否存在蛋白質(zhì)。紫外分光光度法只用于測(cè)定濃度大于0.25 ug/ml 的核酸溶液。 對(duì)于很稀的核酸溶液，核酸的另一物理特性提供了另一方法，那就是熒光光度法。DNA、RNA本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴乙錠(ethidiumbromide，EB)嵌入堿基平面之間后，DNA樣品在紫外線照射激發(fā)下，可以發(fā)出紅色熒光，其熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用

42、一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，可比較出被測(cè)DNA溶液的濃度。靈敏度可達(dá)1-5ng。此法的比較是基于目測(cè)，所以是估計(jì)水平。另外在比較時(shí)，應(yīng)該考慮DNA或RNA樣品中分子大小與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照中核酸分子的長(zhǎng)度。五、注意事項(xiàng)1. 本實(shí)驗(yàn)獲得的DNA，大小約為100150 kb，適用于Southern分析和用噬菌體構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)。2. 實(shí)驗(yàn)所提取的是大分子量核酸，操作時(shí)各步動(dòng)作均要輕柔，以防DNA斷裂。用于Southern分析的DNA濃度最好配成1g/ml。若核酸濃度太低，可對(duì)核酸進(jìn)行濃縮，如用乙醇再沉淀，較少的ddH20再溶解。3. 一般情況下，純凈的DNA OD260/OD280比值約為

43、1.8，RNA為2.0。若樣品中含蛋白質(zhì)，則比值下降，必要時(shí)需重新抽提。若DNA的比值1.75，則加入SDS至0.5，重復(fù)步驟27。4. 苯酚具有強(qiáng)腐蝕性，能引起皮膚嚴(yán)重?zé)齻?，操作時(shí)應(yīng)戴手套及防護(hù)鏡。若皮膚觸及苯酚應(yīng)立即用大量清水沖洗，再用肥皂水浸泡，忌用乙醇擦洗。市售苯酚若呈粉紅色或黃色，以及呈結(jié)晶態(tài)，則需160重蒸，去除雜質(zhì)后方可使用。否則，這些雜質(zhì)會(huì)引起核酸降解以及導(dǎo)致RNA和DNA的交聯(lián)。苯酚使用前需用0.5mo1/L Tris-HCl (pH8.0)抽提數(shù)次，以使苯酚的pH平衡至7.8以上，減少DNA在酚相中的溶解度。平衡酚里常加入8-羥基喹啉至終濃度為0.1，使無(wú)色的苯酚變?yōu)辄S色，

44、有利于抽提時(shí)水相和有機(jī)相的分辨。同時(shí)，8-羥基喹啉既能抗氧化，有又能作為金屬離子的弱螯合劑。5. 從核酸中去除蛋白質(zhì)時(shí)，常用到酚：氯仿等體積混合液。氯仿的作用是使蛋白質(zhì)變性并有助于水相和有機(jī)相的分離。6. DNA用TE溶解，可增加DNA的穩(wěn)定性，便于長(zhǎng)期保存。本實(shí)驗(yàn)DNA用ddH20溶解，是為了避免TE中所含的EDTA可能對(duì)Southern Blot實(shí)驗(yàn)中內(nèi)切酶活力有影響。7. DNA測(cè)樣中所用的石英比色杯較貴，小心不要摔破。清洗和注入樣品時(shí)，手要拿毛面，不要拿透亮的測(cè)樣面。表觀上，石英杯與玻璃杯很象，要注意區(qū)分。有些廠家的產(chǎn)品上注有S(石英)和G(玻璃)。實(shí)驗(yàn)八 哺乳動(dòng)物組織總RNA的提取一

45、、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誖NA提取的基本原理和步驟，能獨(dú)立完成動(dòng)物細(xì)胞總RNA提取的全過(guò)程。二、實(shí)驗(yàn)原理從真核生物的組織或細(xì)胞中提取mRNA，通過(guò)酶促反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈，將雙鏈cDNA和載體連接，然后轉(zhuǎn)化擴(kuò)增，即可獲得cDNA文庫(kù)。構(gòu)建的cDNA文庫(kù)可用于真核生物基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和調(diào)控的分析，比較cDNA和相應(yīng)基因組DNA序列差異可確定內(nèi)含子存在和了解轉(zhuǎn)錄后加工等一系列問(wèn)題。模板mRNA的質(zhì)量直接影響cDNA合成的效率。由于mRNA分子結(jié)構(gòu)容易受RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解，加上RNA酶極為穩(wěn)定且廣泛存在，因而在提取過(guò)程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染，并設(shè)法抑制其活性，這是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。

46、所有的組織中均存在RNA酶，人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換(使用一次性手套)。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200烘烤2小時(shí)以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等可用0.1的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理，再用蒸餾水沖凈。DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑，它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物，因而使用時(shí)需小心。試驗(yàn)所用試劑也可用DEPC處理，加入DEPC至0.1濃度，然后劇烈振蕩10分鐘，再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC，否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。但

47、DEPC能與胺和巰基反應(yīng)，因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌，可用DEPC處理水配制，并盡可能用未曾開(kāi)封的試劑。除DEPC外，也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復(fù)合物、RNA酶抑制蛋白等。此外，為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需經(jīng)硅烷化處理。細(xì)胞內(nèi)總RNA制備方法很多，如異硫氰酸胍熱苯酚法等。許多公司有現(xiàn)成的總RNA提取試劑盒，可快速有效地提取到高質(zhì)量的總RNA。分離的總RNA的mRNA可利用mRNA 3末端含有多聚(A)的特點(diǎn)，用oligo(dT)纖維素柱分離，當(dāng)RNA流經(jīng)ol

48、igo(dT)纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上，然后逐漸降低鹽濃度洗脫，在低鹽溶液或蒸餾水中，mRNA被洗下。經(jīng)過(guò)兩次oligo(dT)纖維素柱，可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70乙醇中-70可保存一年以上。本實(shí)驗(yàn)采用的是Trizol試劑盒的提取方法。Trizol是一種新型的總RNA提取試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。Trizol適用于從各種組織和細(xì)胞中快速分離總RNA。三、驗(yàn)器材和試劑1、 器材小鼠的肝組織或腎組織、研缽、冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)、低溫冰箱、紫外檢測(cè)儀、液氮罐、電泳儀、電泳槽、吸水紙等2、

49、試劑1）Trizol液2）無(wú)RNA酶的滅菌水 用經(jīng)高溫烘烤的玻璃瓶裝蒸餾水，然后加入0.1%的DEPC（體積/體積），處理過(guò)夜后高壓滅菌。3）75乙醇 用DEPC處理水配制75的乙醇（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。4）氯仿5）異丙醇6）無(wú)RNA酶的0.5TBE電泳緩沖液7）無(wú)RNA酶的上樣緩沖液四、實(shí)驗(yàn)步驟1、 取一定量的動(dòng)物組織，用液氮將組織研磨成粉末（一定要研磨充分），同時(shí)把1.5ml Eppendorf放入到液氮中預(yù)冷。2、 將樣品轉(zhuǎn)移到1.5ml Eppendorf管中，快速向研缽中加入1ml的 Trizol。3、 劇烈振蕩1.5ml Eppendo

50、rf管，使Trizol和組織充分混勻，室溫放置5min。4、 加入200ul氯仿、異戊醇（24：1）或氯仿，劇烈振蕩混勻30秒，室溫放置5min。5、 用臺(tái)式離心機(jī)，12000轉(zhuǎn)/分， 4度離心5 min。6、 將上清夜小心的轉(zhuǎn)移到無(wú)RNase的1.5ml離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，室溫放置5分鐘。注意：不要吸取任何中間層的物質(zhì)，否則會(huì)出現(xiàn)基因組DNA污染7、 用冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)，12000轉(zhuǎn)/分，離心5 min。8、 小心棄去上清，留下白色沉淀。9、 用70乙醇洗滌兩次，12000轉(zhuǎn)/分，4度離心2 min。10、盡可能徹底吸去上清，可以加快RNA干燥的速度。11、真空離心干燥35

51、 min，或放在室溫下將酒精空干。12、沉淀用50ul DEPC-H2O溶解。(如果是細(xì)胞，直接收集細(xì)胞沉淀加入Trizol即可，省去液氮研磨的步驟)五、注意事項(xiàng)1. 整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作2. 加氯仿前的勻漿液可在-70保存一個(gè)月以上，RNA沉淀在70乙醇中可在4保存一周，-20保存一年。3. 液氮容易凍傷手，用時(shí)要小心。實(shí)驗(yàn)九 RT-PCR一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饽孓D(zhuǎn)錄PCR的基本原理，掌握逆轉(zhuǎn)錄PCR的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理逆轉(zhuǎn)錄PCR以RNA為起始模板產(chǎn)生cDNA再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。Rt PCR主要用途為基因分離、獲得目

52、的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。三、實(shí)驗(yàn)器材和試劑1. 器材PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外檢測(cè)儀、成像設(shè)備、移液器、槍頭、薄壁管2. 試劑1）RNA酶抑制劑 10U2）10逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 500 mmol/L Tris-HC1 pH8.3 400 mmol/L KCl 60mmol/L MgCl2 10 mmol/L DTT 1 mg/ml BSA3）AMV逆轉(zhuǎn)錄酶4）4種dNTP各10mmol/L5）TaqDNA聚合酶6）引物四、實(shí)驗(yàn)步驟1.mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA第一鏈1）依次加入10擴(kuò)增緩沖液 2.5l4種dNTP(每種濃度10mmol/L) 2l下游引物(與cDNA第一鏈互補(bǔ)的引物) 2lRNA酶抑制劑 1lmRNA l2gAMV逆轉(zhuǎn)錄酶 1l 2）最后加三蒸水至25l 3）充分混勻，于42，反應(yīng)60min2.PCR擴(kuò)增 1）依次加入： 10PCR緩沖液 5 1 “上游”引物(與