非小細(xì)胞肺癌 EGFR突變 單核苷酸多態(tài)性 克隆 檢測(cè)限論文

1、非小細(xì)胞肺癌論文：基于Gap-LCR技術(shù)建立EGFR基因突變的檢測(cè)方法【中文摘要】EGFR基因突變與治療非小細(xì)胞肺癌關(guān)系密切,肺癌目前已經(jīng)成為最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其中非小細(xì)胞肺癌占到肺癌總量的75%-85%,但由于傳統(tǒng)的化療毒副作用較大,近年來(lái)隨著對(duì)其發(fā)病機(jī)制的深入研究,以表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)為靶標(biāo)的新一代的分子靶向治療受到普遍關(guān)注,酪氨酸機(jī)酶抑制劑如吉非替尼、厄羅替尼已被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療晚期非小細(xì)胞肺癌。臨床研究顯示,吉非替尼、厄洛替尼治療非小細(xì)胞肺癌療效與EGFR基因突變關(guān)系密切,攜帶EGFR基因突變的患者對(duì)吉非替尼、厄洛替尼更為敏感,其總生存期和無(wú)進(jìn)展生

2、存期均比無(wú)突變的患者顯著增加。因此,檢測(cè)EGFR基因突變對(duì)于選擇吉非替尼及厄洛替尼治療非小細(xì)胞肺癌是非常必要的。本研究建立了一種新的檢測(cè)EGFR基因突變的方法,根據(jù)Gap-LCR技術(shù)的反應(yīng)原理,對(duì)于EGFR每個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)探針,然后在DNA聚合酶和DNA連接酶的作用進(jìn)行聚合連接反應(yīng),以產(chǎn)物的有無(wú)來(lái)判斷EGFR基因型。最后通過(guò)三種檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)基因中是否存在突變,這三種方法分別為瓊脂糖凝膠電泳、Qubit檢測(cè)系統(tǒng)和通用寡核苷酸芯片檢測(cè)。我們選擇了EGFR基因的熱點(diǎn)突變,包含了.【英文摘要】EGFR gene mutation is closely to the treatment of no

3、n-small cell lung cancer,Lung cancer has become one of the most common malignant tumors, including non-small cell lung cancer accounts for more than 75% to 85%, because of toxic side effects of traditional chemotherapy, with the depth study of its pathogenesis in recent years, epidermal growth facto

4、r receptor (EGFR) as a new generation of molecular targeting therapy has more and more attention, such as inhibitors of tyrosine machine gefitinib, erlotinib ha.【關(guān)鍵詞】非小細(xì)胞肺癌 EGFR突變 單核苷酸多態(tài)性 克隆 檢測(cè)限【英文關(guān)鍵詞】Non-small cell lung cancer EGFR mutations single nucleotide polymorphism cloning detection limit【目錄

5、】基于Gap-LCR技術(shù)建立EGFR基因突變的檢測(cè)方法摘要3-4ABSTRACT4-5目錄6-9前言9-10第一章 緒論10-211.1 藥物基因組學(xué)與個(gè)體化治療概述10-12 藥物基因組學(xué)的研究?jī)?nèi)容10 基因多態(tài)性與藥物效應(yīng)的多樣性10-11 藥物基因組學(xué)在合理用藥中的應(yīng)用11-121.2 EGFR的結(jié)構(gòu)功能及分子靶向治療的進(jìn)展12-18 非小細(xì)胞肺癌概述12-13 EGFR的結(jié)構(gòu)功能13-16 EGFR基因突變與吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展16-181.3 EGFR基因突變檢測(cè)方法的研究進(jìn)展18 單核苷酸多態(tài)性的意義及檢測(cè)方法18 EGFR基因突變性檢測(cè)方法181.4 立題背景與意義18-

6、21第二章 EGFR基因突變檢測(cè)方法的建立21-312.1 EGFR檢測(cè)方法的總體設(shè)計(jì)21-222.2 檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)方法22-26 模板擴(kuò)增PCR引物22-23 連接反應(yīng)探針的設(shè)計(jì)23-26 連接產(chǎn)物的擴(kuò)增反應(yīng)262.3 結(jié)果26-29 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)26-27 Qubit定量系統(tǒng)檢測(cè)27 通用寡核苷酸芯片檢測(cè)方法27-292.4 討論29-31第三章 EGFR基因突變的檢測(cè)方法摸索及優(yōu)化31-413.1 材料31-32 材料31 主要試劑31 主要溶液31 主要儀器31-32 探針的溶解及保存323.2 方法32-34 樣本基因組DNA的提取32 EGFR基因突變檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)流程32-

7、343.3 檢測(cè)方法的條件優(yōu)化34-37 關(guān)于聚合連接反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化34-35 關(guān)于聚合連接反應(yīng)探針量的優(yōu)化35 關(guān)于兩步消化反應(yīng)的優(yōu)化35-36 關(guān)于聚合酶的選擇以及使用量的優(yōu)化36-37 關(guān)于P3、p4引物量的優(yōu)化373.4 檢測(cè)結(jié)果的展示37-40 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)EGFR單核苷酸多態(tài)性37-38 Qubit定量系統(tǒng)檢測(cè)EGFR單核苷酸多態(tài)性38-39 通用寡核苷酸芯片檢測(cè)方法39-403.5 討論40-41第四章 定點(diǎn)突變克隆各個(gè)SNP位點(diǎn)41-494.1 材料41-43 材料41 主要試劑41 主要溶液41 培養(yǎng)基41-42 主要儀器42-43 探針的保存及溶解434.2 實(shí)驗(yàn)方法43-47 定點(diǎn)突變的原理43-44 具體實(shí)驗(yàn)流程44-474.3 結(jié)果474.4 討論47-49第五章 檢測(cè)限的確立及檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌病人