CEA單鏈抗體基因在大腸桿菌中的克隆及表達

1、    CEA單鏈抗體基因在大腸桿菌 中的克隆及表達        【摘要】目的嘗試將CEA單鏈抗；過離子交換柱進行純化；ELISA夾心法測活性。結果得到了SD序列與起始密碼ATG分別相隔著5，6，7，8個核苷酸的重組質(zhì)粒；SDS-PAGE顯示轉(zhuǎn)染入重組質(zhì)粒的TG1菌經(jīng)熱誘導后有分子量約為3×104的外源蛋白，表達量最高達930mg/L培養(yǎng)液，約占菌體總蛋白的50%；ELISA活性測定結果表明復性后的ScFv有較高的抗原結合活性。結論CEA單鏈抗體在大腸桿

2、菌中獲得了較高水平的表達，且經(jīng)復性后有較高的抗原結合活性?！局黝}詞】單鏈抗體癌胚抗原基因表達 Cloning and expression of CEA single chain Fv gene in E.coli * Wang Guanhua,Kong Jian * National Vaccine & Serum Institute,Beijing,100024【Abstract】Objective To attempt to increase the expression level of CEA ScFv gene in E.coli. MethodsFour sets of

3、PCR primers were designed based on CEA ScFv gene, then four modified DNA fragments were obtained using PCR and were cloned into pBV220,respectively. The recombinant plasmids were transfected into E.coli TG1 and the interest protein was expressed as inclusion body with temperature inducement at 42.Th

4、e inclusion body was extracted and disolved in 8mol/L Urea,renatured by glutathione and purified by ion exchange,its activity was analysed with sandwich ELISA.ResultsFour recombinant plasmids were obtained in which the distance from the SD sequence to the initial code ATG was 5,6,7, and 8 bp, respec

5、tively. SDS-PAGE showed that each of the four recombinant clones gave a new protein band with a MW about 30000,the highest expression level was 930mg per liter culture ,about 50% of the total bacterial proteins. ELISA showed that the antigen-binding activities of the E.coli expressed ScFv were good.

6、 Conclusions CEA ScFv can be expressed in E.coli with very high level,and has remarkable antigen-binding activities after being renatured.【Subject words】Single-chain FvCarcinoembryonic antigen(CEA)Gene expression單鏈抗體(Single-chain Fv, ScFv)是由抗體的VH和VL區(qū)組成，中間由一連接肽將其相連。單鏈抗體保留了與原抗體相同的特異性1，2，具有分子量小、易于穿透組織和

7、清除、較少引起機體的排斥反應等優(yōu)點，是當前基因工程抗體的研究熱點之一。癌胚抗原(CEA)屬廣譜的腫瘤相關抗原，存在于多種腫瘤細胞表面。CEA單鏈抗體可用于腫瘤的體內(nèi)成像定位檢查及治療，在臨床上有較廣泛的應用前景。我們構建了含CEA-ScFv基因的重組表達質(zhì)粒，并使其在大腸桿菌中得到了高水平表達。材料與方法1.質(zhì)粒與菌株：含CEA ScFv基因的重組噬菌粒pCANTAB5-ScFv由本室構建3；原核表達載體pBV2204由病毒所惠贈；大腸桿菌TG1由本室凍存。2.酶及主要試劑：所用限制性內(nèi)切酶、Tth DNA聚合酶、T4 DNA連接酶等均購自寶靈曼公司；DTT、谷胱甘肽等試劑皆為進口或國產(chǎn)分析純

8、；CEA抗原、CEA單克隆抗體C50及辣根過氧化物酶標CEA單抗皆為本室提取或生產(chǎn)。3.寡核苷酸引物：由賽百盛公司合成。4.重組表達載體的構建：以pCANTAB5-ScFv為模板PCR擴增目的片段，DNA片段的回收、酶切、連接、轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒的小量酶切鑒定等皆參照文獻5。5.ScFv基因的表達：含重組表達質(zhì)粒的TG1菌在LB(含氨芐青霉素100g/ml)中30活化過夜，然后1100接種于Amp LB中，30劇振培養(yǎng)，至A600吸光度值為0.50.6時，迅速升溫至42，繼續(xù)培養(yǎng)56小時。6.包涵體的提取及溶解：誘導培養(yǎng)后的細菌在4以5000r/min離心10分鐘收集菌體，用TE(50mmol/L

9、 Tris,1mmol/L EDTA,pH8.3)洗一遍，懸浮于TE中，超聲破菌，7000r/min離心10分鐘，棄上清；沉淀用3mol/L脲洗45次，然后加入1/100初始培養(yǎng)體積的8mol/L脲(含10mmol/L DTT),4下緩慢攪拌1小時使之溶解后，15000r/min離心10分鐘，收集上清，此即為粗提包涵體。7.表達蛋白的復性：10下，用復性液(50mmol/L TE,pH8.3,含0.1mmol/L還原型谷胱甘肽及0.3mmol/L氧化型谷胱甘肽)對粗提包涵體進行稀釋，逐滴滴加并攪拌，稀釋至原體積的20倍，并放置2小時使蛋白充分復性。8.表達蛋白的純化：將復性后的蛋白過用50mm

10、ol/L TE(pH8.3)平衡好的Q Sepharose FF陰離子交換柱。上樣后用TE+1mol/L NaCl梯度洗脫，收集目的峰。9.SDS-PAGE：5%濃縮膠，12%分離膠，20mA恒流電泳，考馬斯亮藍G250染色，脫色液脫色。10.蛋白活性測定：ELISA夾心法。用過柱后的蛋白包被96孔板，同時設陰、陽性對照，依次加入CEA抗原、辣根過氧化物酶標CEA單抗，OPD底物顯色，490nm比色測定。結果1.ScFv基因的擴增：設計合成了4對引物，上游引物分別為：(A)5?ACG GAA TTC ATGGAG GTT CAC CTG CAG CAG TCT TTG3?(B)5?ACG GA

11、A TTC AATG GA GGT TCA CCT GCA GCA GTC TTT G3?(C)5?ACG GAA TTC AT ATGG AGG TTC ACC TGC AGC AGT CTT TG3?(D)5?ACG GAA TTC CAT ATG GAG GTT CAC CTG CAG CAG TCT TTG3?它們的不同之處在于EcoR酶切序列與ATG之間分別相隔著0，1，2，3個核苷酸。下游引物都相同，含TCATTA兩個串連的終止密碼子和BamH酶切位點：5?CCG GAT CCT CAT TATTTT ATT TCC AGC TTG GTC CCT CCT CC3?。以pCANTA

12、B5-ScFv為模板，用此4對引物進行PCR擴增，分別得到了750bp左右的DNA片段。2.ScFv表達質(zhì)粒的構建及鑒定：用EcoR/BamH分別對4條DNA擴增片段和質(zhì)粒pBV220雙酶切后，將兩者進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1。挑取4組長出的轉(zhuǎn)化單菌落，分別培養(yǎng)后小量提取質(zhì)粒，酶切鑒定重組子，經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳，可見4組重組克隆經(jīng)EcoR/BamH雙酶切后各有二條DNA條帶，分別是3.6kb和750bp左右，而空載體pBV220經(jīng)酶切后只有3.6kb的一條帶，表明4組重組克隆皆已連上了外源DNA片段，分別將其命名為pBV-ScFv-a、pBV-ScFv-b、pBV-ScFv-c及pBV-S

13、cFv-d，其對應的SD序列與ATG之間的距離分別為5，6，7，8個核苷酸。3.ScFv在大腸桿菌中的誘導表達：4株含ScFv表達質(zhì)粒的TG1菌A、B、C、D(分別對應于pBV-ScFv-a至pBV-ScFv-d) 42誘導56小時后，SDS-PAGE顯示分子量在30000處皆比含pBV220的陰性對照菌多出一條蛋白帶，與預計的CEA ScFv分子量基本一致，其中表達量最高的為C株，經(jīng)薄層掃描顯示其外源蛋白可達菌體總蛋白的50%，約為930mg/L培養(yǎng)液；其余3株菌A、B、D的表達量分別為668mg/L,836mg/L和687mg/L(見1)。1ScFv在TG1中的誘導表達Fig1. The

14、induced expression of ScFv in TG1Lane 1:Protein markerLane 2:The induced result of TG1-A(containing pBV-ScFv-a)Lane 3:The induced result of TG1-B(containing pBV-ScFv-b)Lane 4:The induced result of TG1-C(containing pBV-ScFv-c)Lane 5:The induced result of TG1-D(containing pBV-ScFv-d)Lane 6:The induced

15、 result of negative control (TG1 containing pBV220)4.表達蛋白的純化：對誘導表達后的菌粗提包涵體，經(jīng)變性、復性后，過Q Sepharose FF陰離子交換柱，SDS-PAGE顯示粗提包涵體純度可達80%，過柱后蛋白純度可達90%，見2。2CEA ScFv蛋白的SDS-PAGEFig2. SDS-PAGE of CEA ScFv proteinsLane 1: Protein markerLane 2: The total proteins of TG1-C(containing pBV-ScFv-c)Lane 3: Crude inclusi

16、on bodies Lane 4: Purified CEA ScFv proteins5.蛋白活性測定：用ELISA夾心法對純化后的蛋白進行活性測定，陽性對照為CEA C50單克隆抗體，陰性對照為AFP單克隆抗體，結果見3。表明經(jīng)復性、純化后的表達產(chǎn)物CEA ScFv具較高的抗原結合活性。3CEA ScFv蛋白的活性測定Fig3. The antigen-binding activity of expressed CEA ScFv protein detected by ELISA討論真核基因在E.coli 中的表達水平，主要取決于轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率。采用可誘導的強啟動子能使外源基因得到高效轉(zhuǎn)

17、錄，而在影響翻譯效率的諸多因素中，SD序列的組成及其與ATG之間的距離，都顯著地影響翻譯水平，且一種優(yōu)化的真核基因高表達模式不能通用于其它所有真核基因的表達。本研究從SD序列與ATG之間的距離著手，探索使ScFv在大腸桿菌中高表達的條件。在已構建好的含CEA ScFv基因的噬菌粒pCANTAB5-ScFv的基礎上，我們設計了4對引物，其中下游引物都相同，帶TCATTA兩個串聯(lián)的終止密碼子和BamH酶切位點；4條上游引物的不同之處在于EcoR酶切識別序列與起始密碼子ATG之間分別相隔了0，1，2，3個核苷酸。分別進行PCR擴增，在ScFv基因兩端引入EcoR和BamH酶切位點，將4條擴增產(chǎn)物連入

18、原核表達載體pBV220中，得到了4個重組表達質(zhì)粒，分別命名為pBV-ScFv-a至pBV-ScFv-d，它們的SD序列與ATG之間分別相隔著5，6，7，8個核苷酸。轉(zhuǎn)化入TG1受體菌后，同時進行的42誘導表達顯示，pBV-ScFv-c的表達量最高，外源蛋白可占菌體總蛋白的50%，約為930mg/L培養(yǎng)液，這樣高的表達量國內(nèi)還未見報道。結果說明在用pBV220所進行的CEA ScFv基因的表達中，SD與ATG之間相距7個核苷酸是較佳的距離。隨后進行的研究表明，在提取包涵體時用3mol/L脲反復洗滌能除去很大一部分的雜蛋白，此步表達蛋白的純度即可達80%，隨后過Q Sepharose FF陰離子交換柱可使蛋白純度達90%以上。谷胱甘肽復性系統(tǒng)可使變性蛋白得到有效復性，ELISA顯示復性后的蛋白有較高的抗原結合活性。CEA ScFv高水平表達的成功，為進行大規(guī)模的下游生產(chǎn)奠定了基礎。作者單位：100024 衛(wèi)生部北京生物制品研究所免疫診斷室參考文獻1Winter G,Milstein C.Man-made antibodies