圖位克隆技術(shù)在水稻基因定位和克隆中的應(yīng)用

1、2008年11月第4期吉林師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版Journal of Jilin N ormal University (Natural Science Edition . 4N ov. 2008圖位克隆技術(shù)在水稻基因定位和克隆中的應(yīng)用徐洪偉, 周曉馥3(吉林師范大學(xué)遺傳生理研究所, 吉林四平136000摘要:圖位克隆是基因定位和克隆的有效技術(shù), 本文簡述了圖位克隆技術(shù)在水稻基因定位和克隆中的應(yīng)用,主要包括圖位克隆的一般策略、相關(guān)技術(shù)、及在水稻基因組研究中的作用.關(guān)鍵詞:圖位克隆; 基因定位; 水稻; 基因中圖分類號:Q 343文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1674238732(2008 042

2、0028203最終確定目的基因的堿基序列.1引言水稻是最重要的糧食作物, 也是單子葉模式植物功能基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一. 八十年代以來分3圖位克隆技術(shù)環(huán)節(jié)物. 水稻重要基因的精細(xì)定位和克隆已成為當(dāng)前植3. 1, 已有30子生物學(xué)研究技術(shù)不斷進(jìn)步, , RF LP (Restriction 非常迅速, , orphism 是動(dòng)植物基因組作圖中, RNA , 包括DDRT 2PCR , cDNA 2RDA ,SSH 等123. 其中最常用的基因克隆技術(shù)最先使用、應(yīng)用最廣泛的一種分子標(biāo)記, 水稻中第一張連鎖圖譜是McC ouch 等用粕粳交Fz 群體構(gòu)建的RF LP 圖譜5. 第二代分子標(biāo)記的代表是

3、微衛(wèi)星是圖位克隆(map 2based gene cloning 或positional (Sim ple sequence repeat ,SSR 標(biāo)記, 該標(biāo)記被廣泛應(yīng)cloning 技術(shù)4, 圖位克隆技術(shù)是近幾年隨著各種植用于水稻的各種研究領(lǐng)域. 這些高密度的分子標(biāo)記物的分子標(biāo)記圖譜的相繼建立而發(fā)展起來的一種新圖譜為尋找與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記打下了的基因克隆技術(shù), 本文擬對圖位克隆的研究進(jìn)展做堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ). 雖然己有很多分子標(biāo)記遺傳圖譜, 但是一介紹, 以期對水稻遺傳育種研究有所助益.對于一些特殊的物種或基因, 僅靠目前分子標(biāo)記圖譜還是難以滿足精細(xì)定位的要求, 人們往往將幾種標(biāo)記結(jié)合

4、起來使用, 通過整合己有的遺傳圖譜或開2圖位克隆法圖位克隆(map 2based clonig 又稱定位克隆(posi 2發(fā)新的分子標(biāo)記來達(dá)到精細(xì)定位的目的.目的基因區(qū)域的精細(xì)作圖toinal cloning ,1986年首先由劍橋大學(xué)的Alan C oul 23. 2s on 提出4. 是根據(jù)目標(biāo)基因在染色體上的位置進(jìn)行通過整合已有的遺傳圖譜和尋找新的分子標(biāo)基因克隆的一種方法. 用該方法分離基因無需預(yù)先記, 提高目的基因區(qū)域遺傳圖譜和物理圖譜的密譜知道基因的DNA 序列, 也無需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的密度. 利用目標(biāo)基因的近等基因系或分離群體分的有關(guān)信息. 在利用分子標(biāo)記技術(shù)對目的基因進(jìn)行組分

5、析法(BS A 進(jìn)行連鎖分析, 篩選出目標(biāo)基因所精確定位的基礎(chǔ)上, 使用與目的基因緊密連鎖的分在局部區(qū)域的分子標(biāo)記. 分離群體分組分析法子標(biāo)記篩選DNA 文庫, 從而構(gòu)建目的基因區(qū)域的物(BS A :是Michelm ore 等首先發(fā)明的, 主要篩選目標(biāo)理圖譜, 再利用此物理圖譜通過染色體步行逼近目基因所在局部區(qū)域的分子標(biāo)記6故也稱作近等基因的基因或通過染色體登陸的方法最終找到包含該目池法. 在植物中特別是水稻中針對不同性狀構(gòu)建了的基因的克隆, 最后通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證許多近等基因系7,8.收稿日期:2008209221基金項(xiàng)目:吉林省科技發(fā)展計(jì)劃重大項(xiàng)目(20065008第一作者簡介:

6、徐洪偉(19642 , 男, 吉林省公主嶺市人, 現(xiàn)為吉林師范大學(xué)遺傳生理研究所副教授, 博士. 研究方向:植物基因工程. 3通訊作者:周曉馥(19642 , 女, 教授, 博士. 研究方向:植物分子生物學(xué).283. 3構(gòu)建并篩選含有大插入片段的基因組文庫過序列拼接, 實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因區(qū)域遺傳圖譜和物理圖在圖位克隆技術(shù)中, 高質(zhì)量的基因組文庫也是成譜的電子整合, 得到該區(qū)域的基因組序列, 從而減少功的關(guān)鍵. 1983年,Murray 等首次構(gòu)建了總長度為55文庫構(gòu)建、篩選等繁重的工作, 加速圖位克隆進(jìn)程. kb 的Y AC 9. 1987年,Burke 等得到了能夠克隆大片從一系列侯選基因中鑒定目

7、標(biāo)基因是定位克隆技術(shù)段DNA 的Y AC 載體10Shizuya 等建立了人工細(xì)菌染的最后一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié). 色體(Bacterial artificial chrom os ome ,BAC 11. 可轉(zhuǎn)化人4圖位克隆技術(shù)在水稻基因克隆中的應(yīng)用工染色體T AC (T rans formation 2com petem Artificial Chro 2m os ome 具有可轉(zhuǎn)化的優(yōu)越性, 可以大大的簡化目的水稻高精密遺傳圖譜和物理圖譜的相繼構(gòu)建成基因的轉(zhuǎn)化互補(bǔ)實(shí)驗(yàn). 目前己經(jīng)利用T AC 載體系統(tǒng)功13, 尤其是全基因組測序結(jié)果的公布14, 為水稻構(gòu)建了多種植物的基因組文庫如水稻、小麥、擬南芥

8、、百脈根、金魚草、大豆、棉花等. 在水稻中, 已獲得了含有特定基因大片段(80kb DNA 的轉(zhuǎn)化株12. 3. 4以與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫找到與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記(最好分布在基因兩側(cè) 和鑒定出分子標(biāo)記所在的大片段克隆以基因的精細(xì)定位以及后續(xù)的圖位克隆創(chuàng)造了優(yōu)越條件. 截止到目前,oryzabase 網(wǎng)站公布了約3000多個(gè)水稻突變體(含數(shù)量性狀基因 . 其中包括我國克隆的MDCI 、BCI 、A LK 、G H2和G S3等基因. 2003年, 李家洋研究小組克隆了MOC1基因. 該基因表達(dá)的蛋白能夠促進(jìn)腋芽的分生15. Sun 等人16. 中科院院士、華中農(nóng)業(yè)

9、大學(xué)教授張啟發(fā)領(lǐng)導(dǎo)的“基因組研究與后, 接著是以該克隆為起點(diǎn)進(jìn)行染色體步行, 逐漸靠水稻遺傳改良”國家創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)繼今年相繼分離克隆近目標(biāo)基因, 以該克隆的末端作為探針篩選基因組文出G hd717和S5基因之后, 在水稻功能基因組研究庫, 鑒定和分離出鄰近的基因組片段的克隆, 再將這. 個(gè)克隆的遠(yuǎn)端末端作為探針重新篩選基因組文庫. 繼, 被命名續(xù)這一過程, 直到獲得具有目標(biāo)基因兩側(cè)分子標(biāo)記的. 2008年9大片段克隆或重疊群. 2PNAS 上18. 目前, 利用成分子作圖, 1.可以利用. 時(shí), , . 3. 5目的基因的精細(xì)定位利用側(cè)翼分子標(biāo)記分析和混合樣品作圖精確定位目的基因. 接著以目標(biāo)基因

10、兩側(cè)的分子標(biāo)記為探針通過染色體登陸獲得含目標(biāo)基因的陽性克隆一旦把目標(biāo)基因初步定位在兩個(gè)標(biāo)記之間后, 就可以從國際水稻基因組測序計(jì)劃(IRG SP 公布的序列中下載這兩個(gè)標(biāo)記區(qū)域的部分PAC/BAC 克隆序列. 利用軟件SSRIT 搜索克隆序列中的微衛(wèi)星序列, 然后選擇合適的微衛(wèi)星序列進(jìn)行特異PCR 引物的設(shè)計(jì). 也可以直接借助于公共數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行比較, 如尋找RG P 基因組數(shù)據(jù)庫(粳稻 與中國華大基因組數(shù)據(jù)庫(釉稻 的單核普酸多態(tài)性(S NP 序列差異, 設(shè)計(jì)C APS 或dC APS 標(biāo)記和插入/缺失多態(tài)性標(biāo)記(In 2Del 等. 利用這些標(biāo)記對大群體進(jìn)行分析, 可以迅速地將目標(biāo)基因范

11、圍縮小到一個(gè)很小的基因組區(qū)域. 3. 6外顯子的分離、鑒定陽性克隆中可能含有多個(gè)候選基因. 用篩選cDNA 文庫, 外顯子捕捉和cDNA 直選法等技術(shù)找到這些候選基因, 通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證最終確定目標(biāo)基因的堿基序列. 完成基因精細(xì)定位后, 可以根據(jù)已有的與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記, 找到目標(biāo)基因在己公布的RG P 物理圖譜上的位置, 通表1利用圖位克隆技術(shù)分離到的部分水稻基因特性抗白葉枯病抗白葉枯病矮稈稻瘟病抗性光周期應(yīng)答光周期應(yīng)答細(xì)稈開花稻瘟病抗性生殖生長類病斑光周期應(yīng)答花分裂組織矮稈半矮稈莖稈脆性矮稈矮稈分蘗數(shù)糊化溫度抗白葉枯病類病斑恢復(fù)系葉起始垂葉光周期應(yīng)答苗期光調(diào)節(jié)芽鞘趨光性

12、冠狀根形成開花調(diào)控抗不育參考文獻(xiàn)S ong (1995 Y oshimura (1998 Ashikari (1999 W ang (1999 M asahiro (2000 T akahashi (2001 Ikedaetal. (2001 Y ano (2001 Bryan (2001 Asai (2002Y amanouchi (2002 K ojima (2002 Suzaki (2004 T anabe (2004 Sasaki (2002 Li (2003 H ong (2003 Sasaki (2003 Li (2003 G ao (2003 Sun (2004 Z eng (2

13、004 K om ori (2004 M iy oshi (2004 Y amaguchi (2004 D oi (2004 Zhao (2004 Haga (2005 Inukai (2005 Zhang (2008 Zhang (2008 基因X a21X a1D1Pib Hd1Hd6S lr1OsG 1Pi 2ta M ori1S pl7Hd3a FON1d11sd1Bc1d2G id2M oc1alk X a26S pl11R f1PlA1Dl1Ehd1LSH1C pt1crl1G hd7S5國家美國日本日本美國日本日本日本日本美國日本日本日本日本日本日本中國日本日本中國中國中國美國日

14、本日本日本日本日本日本日本中國中國295圖位克隆技術(shù)存在的問題大尺度物理圖譜、大片段基因組文庫和基因組全序列, 為圖位克隆的廣泛應(yīng)用鋪平了道路. 尤其令人鼓圖位克隆也有其自身的局限性, 在某些情況下, 舞的是,DNA 芯片和微列陣的發(fā)明為圖位克隆的應(yīng)就很難或者不能通過圖位克隆技術(shù)來定位基因. 首用展示了巨大的潛力和光明的前景. DNA 芯片或微先, 在分析自然發(fā)生的變異的時(shí)候, 最有可能遇到的列陣與S NP 和cDNA 相結(jié)合在基因的定位、篩選和復(fù)雜情況是一個(gè)給定的性狀由不止一個(gè)基因位點(diǎn)控鑒定方面具有無比的優(yōu)越性, 相信能大大提高圖位制, 其次, 表觀遺傳是圖位克隆工作中又一個(gè)可能遇克隆的效率

15、, 大大加快了水稻圖位克隆工作的進(jìn)行, 到的復(fù)雜情況. 然而近些年來生物技術(shù)和生物信息也將有助于解決上述提到的復(fù)雜問題. 學(xué)的迅猛發(fā)展, 基因組研究提供的高精度遺傳圖譜、參考文獻(xiàn)1LiangP,Pardee A B. Differential display of eukary otic messenger RNA by means of polymerase chain reactionJ.Science ,1992,257:967971. 2LisitsynN ,W igler M. Cloning the differences between tw o com plex genomes

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17、 a physical map of the genome of the nematode Caenorhabditis elegansJ.Proc Natl Acad Sci U S A. 1986Oct ;83(20 :78217825.5McC ouch SR ,et al. M olecular mapping of rice chrom os omeJ.Theor Appl G enet ,1988,26:815829.6Michhnore RW Paran I ,K esseli RV Identification of markers linked to disease 2res

18、istance genes by bulked segregant analysis :arapid method to detect mark 2ers in specific genom ic regions by using segregating populationsJ.Proc Natl Acad Sci U S A ,1991,N ov 1,88(21 :98289832.7章琦, 施愛農(nóng), 楊文才, 王春連. 攜有不同主效白葉枯病抗性單基因的3個(gè)粳稻近等基因系選育J.作物學(xué)報(bào),22(2 :135141. 8章琦, 等. 普通野生稻抗水稻白葉枯病(X anthom onas or

19、yzae pv. oryzae X a 223 作物學(xué)報(bào),2000,26(5 :536542.9MurryA W ,S z ostak J W. C onstrution of artificial chrom in ,305:18919.10BurkeD R ,et al. Cloning of large DNA yeast os ome vectorsJ.Science ,1987,236:806812. 11ShizuyaH ,et and of human DNA in Escherichia coli using an F 2factor 2based vectorJ.ProcNa

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