東亞飛蝗有機(jī)磷抗性相關(guān)羧酸酯酶基因的特性及功能研究

1、東亞飛蝗有機(jī)磷抗性相關(guān)羧酸酯酶基因的特性及功能研究    英文題名 Characterizations and Function Analysis of Carboxylesterase Genes Related to Organophosphate Resistance in Locusta Migratoria Manilensis (Meyen)  關(guān)鍵詞 東亞飛蝗; 有機(jī)磷抗性; 羧酸酯酶; RNA干擾; 英文關(guān)鍵詞 Locusta migratona manilensis; Organophosphorus resistance;

2、Carboxylesterase; RNAi; 中文摘要 羧酸酯酶是昆蟲體內(nèi)重要的代謝解毒酶系,其主要功能是水解內(nèi)源性和外源性含有酯鍵的有毒物質(zhì),減緩其到達(dá)靶標(biāo)部位的時(shí)間。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),羧酸酯酶參與昆蟲抗藥性的產(chǎn)生。東亞飛蝗是重要的世界性農(nóng)業(yè)害蟲,由于長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥治理蝗災(zāi),使得田間東亞飛蝗種群對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗性。2004年馬恩波等首次發(fā)現(xiàn)東亞飛蝗對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥產(chǎn)生抗性,楊美玲等通過生物測(cè)定和生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了東亞飛蝗黃驊田間種群對(duì)馬拉硫磷的抗藥性與酯酶活性增加相關(guān)。 為進(jìn)一步深入探討東亞飛蝗羧酸酯酶介導(dǎo)的有機(jī)磷抗性分子機(jī)制,本文基于東亞飛蝗EST數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái),通過生物信息學(xué)方法獲得東

3、亞飛蝗25個(gè)羧酸酯酶ESTs,采用Real-time PCR技術(shù)篩選出12個(gè)與抗性相關(guān)的羧酸酯酶基因,分析了其在不同組織部位(前腸、中腸、后腸、胃盲囊、馬氏管、脂肪體、表皮和頭部)的表達(dá)差異,結(jié)果顯示：所有基因在東亞飛蝗胃盲囊處表達(dá),且有6個(gè)基因在胃盲囊處特異性表達(dá)?？剐苑N群(Field Resistant Population, FR)中的表達(dá)量較敏感品系(Laboratory Susceptible Strain, LS)為高。與LS相比,在FR中表達(dá)量差異最大的基. 英文摘要 Carboxylesterases (CarEs) as one of the predominant meta

4、bolic enzyme familys in insect play the primary role in degredation and sequestration of a broad suit of endogenous and exogenous ester containing compounds. CarEs are frequently implicated in the resistance of insects to different  中文摘要 11-13 ABSTRACT 13-14 第一章 前言 15-23     1.1

5、害蟲抗藥性研究 15-16         1.1.1 抗藥性的產(chǎn)生 15         1.1.2 抗藥性的檢測(cè) 15-16         1.1.3 抗藥性生理生化機(jī)制 16     1.2 酯酶研究進(jìn)展 16-17         1.2.1 酯酶生化水平的研究 16-17 &#

6、160;       1.2.2 酯酶分子水平的研究 17     1.3 東亞飛蝗概述 17-20         1.3.1 東亞飛蝗分布、生活習(xí)性及生態(tài)特征 18         1.3.2 東亞飛蝗國(guó)內(nèi)外研究概況 18-20             1

7、.3.2.1 國(guó)內(nèi)研究概況 18-19             1.3.2.2 國(guó)外研究概況 19-20     1.4 我國(guó)東亞飛蝗的為害及治理 20         1.4.1 我國(guó)東亞飛蝗的為害 20         1.4.2 我國(guó)東亞飛蝗治理策略 20     1.5 本文研究的

8、內(nèi)容及意義 20-23 第二章 東亞飛蝗有機(jī)磷抗性相關(guān)羧酸酯酶基因特性分析 23-35     2.1 材料與方法 23-28         2.1.1 供試?yán)ハx的采集及飼養(yǎng) 23         2.1.2 供試藥品及主要儀器 23         2.1.3 東亞飛蝗EST數(shù)據(jù)庫(kù)中羧酸酯酶基因的搜索 23-24    &#

9、160;    2.1.4 羧酸酯酶基因引物設(shè)計(jì) 24-25         2.1.5 篩選抗性相關(guān)羧酸酯酶基因 25-27             2.1.5.1 總RNA的提取 25-26             2.1.5.2 總RNA的純化及第一鏈cDNA的合成 26-

10、27             2.1.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法篩選抗性相關(guān)羧酸酯酶基因 27         2.1.6 抗性相關(guān)羧酸酯酶基因不同組織部位的表達(dá) 27-28             2.1.6.1 總RNA的提取及純化 27      &#

11、160;      2.1.6.2 第一鏈cDNA的合成 27             2.1.6.3 抗性相關(guān)羧酸酯酶基因在敏感種群和抗性品系中組織分布 27-28         2.1.7 抗性相關(guān)羧酸酯酶基因在不同齡期的表達(dá) 28            

12、; 2.1.7.1 總RNA的提取及純化 28             2.1.7.2 第一鏈cDNA的合成 28             2.1.7.3 抗性相關(guān)羧酸酯酶基因不同齡期的mRNA差異表達(dá) 28     2.2 結(jié)果與分析 28-33         2.2.1 東

13、亞飛蝗羧酸酯酶基因在EST數(shù)據(jù)庫(kù)中的搜索 28         2.2.2 抗性相關(guān)羧酸酯酶基因的篩選 28-29         2.2.3 抗性相關(guān)羧酸酯酶基因組織組織分布特征 29-32         2.2.4 抗性相關(guān)羧酸酯酶基因不同齡期的表達(dá)特性 32-33     2.3 討論 33-35 第三章 東亞飛蝗羧酸酯酶基因克隆 35-45

14、60;   3.1 材料與方法 35-39         3.1.1 供試?yán)ハx 35         3.1.2 主要試劑及主要儀器 35         3.1.3 東亞飛蝗羧酸酯酶基因的克隆 35-39             3.1.3.1 總RNA的

15、提取及純化 35             3.1.3.2 RACE cDNA的合成 35-36             3.1.3.3 羧酸酯酶基因RACE引物設(shè)計(jì) 36             3.1.3.4 羧酸酯酶基因3和5RACE末端快速擴(kuò)增 36-37

16、60;           3.1.3.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收與純化 37-38             3.1.3.6 PCR產(chǎn)物與載體的連接反應(yīng) 38             3.1.3.7 轉(zhuǎn)化與菌體擴(kuò)大培養(yǎng) 38      

17、;       3.1.3.8 質(zhì)?；厥铡z測(cè)及測(cè)序 38             3.1.3.9 核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列分析 38-39         3.1.4 羧酸酯酶基因聚類分析 39     3.2 結(jié)果與分析 39-43         3.2

18、.1 東亞飛蝗羧酸酯酶基因的RACE擴(kuò)增結(jié)果 39         3.2.2 羧酸酯酶基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列 39-40         3.2.3 羧酸酯酶基因聚類分析結(jié)果 40-43     3.3 討論 43-45 第四章 東亞飛蝗羧酸酯酶基因在抗藥性中的功能研究 45-53     4.1 材料與方法 45-48       

19、;  4.1.1 供試?yán)ハx的采集與飼養(yǎng) 45         4.1.2 供試藥品 45-46         4.1.3 生物測(cè)定 46         4.1.4 雙鏈RNA的引物設(shè)計(jì) 46         4.1.5 雙鏈RNA的合成 46-47     

20、0;       4.1.5.1 總RNA的提取與純化 46             4.1.5.2 cDNA的合成 46-47             4.1.5.3 PCR擴(kuò)增 47            

21、 4.1.5.4 體外反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈RNA 47         4.1.6 東亞飛蝗羧酸酯酶基因沉默對(duì)其表達(dá)的影響 47         4.1.7 羧酸酯酶基因沉默后東亞飛蝗對(duì)馬拉硫磷敏感性分析 47-48     4.2 結(jié)果與分析 48-50         4.2.1 東亞飛蝗敏感品系和天津田間種群2齡若蟲對(duì)馬拉硫磷敏感性的比較 48  

22、       4.2.2 東亞飛蝗羧酸酯酶基因沉默對(duì)其表達(dá)的影響 48-49         4.2.3 羧酸酯酶基因沉默后東亞飛蝗對(duì)馬拉硫磷敏感性分析 49-50     4.3 討論 50-53 全文總結(jié) 53-55 參考文獻(xiàn) 55-63     3.3 討論 43-45 第四章 東亞飛蝗羧酸酯酶基因在抗藥性中的功能研究 45-53     4.1 材料與方法 45-48

23、        4.1.1 供試?yán)ハx的采集與飼養(yǎng) 45         4.1.2 供試藥品 45-46         4.1.3 生物測(cè)定 46         4.1.4 雙鏈RNA的引物設(shè)計(jì) 46         4.1.5 雙鏈RNA的合成

24、 46-47             4.1.5.1 總RNA的提取與純化 46             4.1.5.2 cDNA的合成 46-47             4.1.5.3 PCR擴(kuò)增 47      &

25、#160;      4.1.5.4 體外反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈RNA 47         4.1.6 東亞飛蝗羧酸酯酶基因沉默對(duì)其表達(dá)的影響 47         4.1.7 羧酸酯酶基因沉默后東亞飛蝗對(duì)馬拉硫磷敏感性分析 47-48     4.2 結(jié)果與分析 48-50         4.2.1 東亞飛蝗敏

26、感品系和天津田間種群2齡若蟲對(duì)馬拉硫磷敏感性的比較 48         4.2.2 東亞飛蝗羧酸酯酶基因沉默對(duì)其表達(dá)的影響 48-49         4.2.3 羧酸酯酶基因沉默后東亞飛蝗對(duì)馬拉硫磷敏感性分析 49-50     4.3 討論 50-53 全文總結(jié) 53-55 參考文獻(xiàn) 55-63     3.3 討論 43-45 第四章 東亞飛蝗羧酸酯酶基因在抗藥性中的功能研究 45-53

27、    4.1 材料與方法 45-48         4.1.1 供試?yán)ハx的采集與飼養(yǎng) 45         4.1.2 供試藥品 45-46         4.1.3 生物測(cè)定 46         4.1.4 雙鏈RNA的引物設(shè)計(jì) 46    

28、0;    4.1.5 雙鏈RNA的合成 46-47             4.1.5.1 總RNA的提取與純化 46             4.1.5.2 cDNA的合成 46-47             4.1.5.3 PCR擴(kuò)增

29、 47             4.1.5.4 體外反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈RNA 47         4.1.6 東亞飛蝗羧酸酯酶基因沉默對(duì)其表達(dá)的影響 47         4.1.7 羧酸酯酶基因沉默后東亞飛蝗對(duì)馬拉硫磷敏感性分析 47-48     4.2 結(jié)果與分析 48-50    &

30、#160;    4.2.1 東亞飛蝗敏感品系和天津田間種群2齡若蟲對(duì)馬拉硫磷敏感性的比較 48         4.2.2 東亞飛蝗羧酸酯酶基因沉默對(duì)其表達(dá)的影響 48-49         4.2.3 羧酸酯酶基因沉默后東亞飛蝗對(duì)馬拉硫磷敏感性分析 49-50     4.3 討論 50-53 全文總結(jié) 53-55 參考文獻(xiàn) 55-63     3.3 討論 43

31、-45 第四章 東亞飛蝗羧酸酯酶基因在抗藥性中的功能研究 45-53     4.1 材料與方法 45-48         4.1.1 供試?yán)ハx的采集與飼養(yǎng) 45         4.1.2 供試藥品 45-46         4.1.3 生物測(cè)定 46         4.1.4 雙

32、鏈RNA的引物設(shè)計(jì) 46         4.1.5 雙鏈RNA的合成 46-47             4.1.5.1 總RNA的提取與純化 46             4.1.5.2 cDNA的合成 46-47        

33、60;    4.1.5.3 PCR擴(kuò)增 47             4.1.5.4 體外反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈RNA 47         4.1.6 東亞飛蝗羧酸酯酶基因沉默對(duì)其表達(dá)的影響 47         4.1.7 羧酸酯酶基因沉默后東亞飛蝗對(duì)馬拉硫磷敏感性分析 47-48    

34、4.2 結(jié)果與分析 48-50         4.2.1 東亞飛蝗敏感品系和天津田間種群2齡若蟲對(duì)馬拉硫磷敏感性的比較 48         4.2.2 東亞飛蝗羧酸酯酶基因沉默對(duì)其表達(dá)的影響 48-49         4.2.3 羧酸酯酶基因沉默后東亞飛蝗對(duì)馬拉硫磷敏感性分析 49-50     4.3 討論 50-53 全文總結(jié) 53-55 參考文獻(xiàn) 55-63     3.3 討論 43-45 第四章 東亞飛蝗羧酸酯酶基因在抗藥性中的功能研究 45-53     4.1 材料與方